電針對不同時間段局灶性腦缺血模型大鼠p-STAT5表達(dá)的影響

黃康柏，　唐純志，　鐘國新，　許能貴，　易瑋

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州　510006）

電針對不同時間段局灶性腦缺血模型大鼠p-STAT5表達(dá)的影響

黃康柏，唐純志，鐘國新，許能貴，易瑋

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006）

【目的】 觀察電針對局灶性腦缺血大鼠缺血灶周圍區(qū)不同時間段磷酸化信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子5（p-STAT5）表達(dá)的影響，探討電針治療腦缺血疾病的可能作用機制?！痉椒ā繉D大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針組（電針百會、大椎）、AG490（阻滯劑）組和AG490+電針組，各組又分為術(shù)后2 h、l d、3 d、7 d、21 d 5個時段組。采用電凝閉大腦中動脈法復(fù)制局灶性腦缺血（MCAO）模型，AG490組及AG490+電針組于術(shù)前20 min行右側(cè)腦室注射AG490進行干預(yù)。采用免疫熒光及蛋白印跡技術(shù)檢測病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5的表達(dá)含量。【結(jié)果】各組各時間段的p-STAT5表達(dá)在免疫熒光及蛋白印跡檢測中具有相似的發(fā)展趨勢。假手術(shù)組在各時間段的檢測中均只有少量表達(dá)，模型組2 h至7 d時間段p-STAT5表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（均P＜0.01）；電針組3 d至7 d時間段免疫熒光檢測p-STAT5表達(dá)較模型組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），在3 d時間段蛋白印跡檢測p-STAT5表達(dá)較模型組顯著升高（P＜0.01）；AG490組和AG490+電針組2 h至3 d時間段免疫熒光檢測p-STAT5表達(dá)較模型組與電針組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），7 d時間段p-STAT5表達(dá)較電針組顯著降低（P＜0.01）；而在2 h至7 d時間段蛋白印跡檢測p-STAT5蛋白表達(dá)較模型組與電針組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）?！窘Y(jié)論】電針改善缺血性腦損傷的內(nèi)在機制可能與電針通過激活JAK2從而提高腦缺血病灶區(qū)p-STAT5的表達(dá)水平有關(guān)。

腦缺血/針刺療法；p-STAT5；AG490；腦皮質(zhì)/病理學(xué)；蛋白表達(dá)；疾病模型，動物；大鼠

信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）是一種能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞漿蛋白。局灶性腦缺血后，STAT5參與調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素（EPO）提高缺血灶周圍區(qū)神經(jīng)元耐缺氧作用，達(dá)到抑制神經(jīng)元凋亡的目的［1］。目前研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后EPO與其受體（EPOR）特異性結(jié)合，通過活化酪氨酸蛋白激酶2（Janus kinase，JAK2），激活JAK2/STAT5信號通路從而介導(dǎo)STAT5持續(xù)高水平表達(dá)，發(fā)揮抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護腦組織及修復(fù)受損神經(jīng)元的重要作用［2-3］。本研究采用電凝閉大腦中動脈法復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型，觀察腦缺血及阻滯劑AG490干預(yù)缺血后2 h、1 d、3 d、7 d、21 d不同時間段p-STAT5表達(dá)的動態(tài)變化，以及電針的調(diào)節(jié)作用，探討電針療法治療腦缺血的內(nèi)在可能機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1動物分組廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級SD雄性成年大鼠250只。體質(zhì)量180～220 g，自來水喂養(yǎng)，飼用普遍顆粒型大鼠飼料。按體質(zhì)量隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針組、AG490組、AG490+電針組，每組又分為2 h、1 d、3 d、7 d、21 d 5個時間段亞組，共25小組，每小組10只大鼠。

1.2試劑及儀器AG490（德國Merck公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；p-STAT5兔多克隆抗體（美國Abnova公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Benthyl公司）；熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG（Goat Anti-Rabbit IgG/FITC）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；抗熒光衰減封片劑、蛋白提取試劑盒、化學(xué)發(fā)光顯色（ECL）試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑試劑盒（武漢博士德公司）。LSM 510 META型激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；TGL-18R臺式冷凍高速離心機（日本HEMA公司）。

1.3造模方法局灶性腦缺血模型采用電凝閉大鼠大腦中動脈的造模方法［4］。常規(guī)麻醉大鼠后，沿右側(cè)耳眼連線中點切開皮膚打開顳骨，暴露大腦中動脈，電凝閉槍輕觸之，予以凝閉復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型。假手術(shù)組各亞組的大鼠麻醉后只暴露大腦中動脈。各組大鼠術(shù)后以1×105U/L青霉素連續(xù)治療3 d，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4側(cè)腦室注射AG490［4］量取19 mL雙蒸水溶解1 mL二甲基亞砜，再取5 mg AG490溶于20 mL體積分?jǐn)?shù)5%二甲基亞砜溶液，配制AG490注射液。大鼠麻醉后固定于立體定向儀，標(biāo)記Bregma點。在其后0.8 mm，矢狀縫右側(cè)1.5 mm，進針深至腹側(cè)4.8 mm［5］。用微量注射器緩慢勻速推注AG490注射液10 μL。于局灶性腦缺血大鼠模型術(shù)前20 min對AG490組及AG490+針刺組按要求行右側(cè)腦室注射AG490。

1.5電針方法電針組和AG490+電針組在造模1 h后選用針刺督脈百會穴（GV20）和大椎穴（GV14）進行針刺。選用華佗牌0.30 mm×25 mm一次性針灸針向后平刺百會0.5寸，直刺大椎0.3寸，連接G-6805電針儀，采用頻率為20次/min的疏密波，強度約2～3 V，針刺時間30 min/次，每天均在相同時間治療1次。其他3組大鼠在同等條件下飼養(yǎng)，除常規(guī)抓取外不予任何處理。

1.6腦組織的采集和固定在腦缺血后2 h、1 d、3 d、7 d、21 d 5個時間段各組大鼠分別隨機抽取6只用于取材。以100 mg/L的水合氯醛按3.3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。常規(guī)灌注固定后斷頭取腦，于恒冷箱冰凍切片機切片，從視交叉水平開始進行冠狀切片，片厚20 μm。每份樣本各取10張切片，用于免疫熒光檢測。

隨機抽取各組4只大鼠用于Western blotting法檢測，常規(guī)麻醉后迅速斷頭取腦，冰上分離缺血灶周圍皮層腦組織，經(jīng)0℃磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，迅速置于液氮罐中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7免疫熒光檢測p-STAT5表達(dá)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，設(shè)立陰性對照滴加PBS代替一抗。PBS漂洗晾干后，用抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下進行熒光觀察及拍片。光源采用490 nm波長的激光激發(fā)綠色熒光，觀測圖像的顯微鏡選用目鏡10×和物鏡40×的視野，數(shù)值孔徑為1.3，激光功率為30 mW，光切厚度為1 μm，電子放大為2.0，掃描方式為XYZ，圖像存為1024 ×1024像素類型。配置激光共聚焦掃描顯微鏡圖像處理系統(tǒng)進行分析，于細(xì)胞顯影密集區(qū)域連續(xù)掃描5個約0.053 1 mm2大小的視野，采用平均熒光強度值作為p-STAT5的相對表達(dá)量。

1.8Western blotting蛋白印跡檢測p-STAT5蛋白嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用ECL顯影，洗片后以培清凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。采用SensiAnsys軟件分析結(jié)果，蛋白雜交條帶的灰度值以光密度值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1不同時間段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5免疫熒光檢測結(jié)果激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，陽性熒光點呈綠色表現(xiàn)。表1、圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組在各時間段均檢測到少量p-STAT5。模型組2 h至7 d時間段p-STAT5表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（均P＜0.01），電針組3 d與7 d時間段p-STAT5表達(dá)較模型組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；AG490組和AG490+電針組2 h至3 d時間段p-STAT5表達(dá)較模型組與電針組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），7 d時間段p-STAT5表達(dá)較電針組顯著降低（P＜0.01）。

表1　不同時間段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5免疫熒光檢測結(jié)果Table 1　Expression levels of p-STAT5 in rat affected cortex of different groups detected by immunofluorescence technique　（±s，I平均熒光強度）

表1　不同時間段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5免疫熒光檢測結(jié)果Table 1　Expression levels of p-STAT5 in rat affected cortex of different groups detected by immunofluorescence technique　（±s，I平均熒光強度）

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.05，⑤P＜0.01，與電針組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組AG490組AG490+電針組N 6 6 6 6 6 t=2 h 185.02±25.63 817.67±75.82①757.87±58.64 594.08±50.84③④569.26±51.27③④t=1 d 203.94±25.22 856.38±92.17①840.71±91.84 564.72±62.37③⑤588.23±61.85③⑤t=3 d 187.51±31.67 531.57±66.84①651.78±47.15③409.28±53.92③⑤372.48±48.16③⑤t=7 d 182.16±41.32 239.99±43.71①291.32±42.58②216.73±42.54⑤214.67±38.59⑤t=21 d 167.43±32.19 192.28±29.44 203.99±38.44 170.81±27.53 168.57±33.18

2.2不同時間段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5蛋白印跡檢測結(jié)果圖2結(jié)果顯示：經(jīng)Western-blotting蛋白印跡檢測，各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)p-STAT5蛋白在92 kD的位置可見特異的發(fā)光條帶。假手術(shù)組在各時間段均幾乎檢測不到p-STAT5蛋白的表達(dá)。表2結(jié)果顯示：模型組2 h至7 d時間段p-STAT5蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均顯著升高（均P＜0.01）；電針組3 d時間段p-STAT5蛋白表達(dá)較模型組顯著升高（P＜0.01）；AG490組和AG490+電針組2 h至7 d時間段p-STAT5蛋白表達(dá)較模型組與電針組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

3　討論

STAT5是JAK2的目的蛋白和直接底物［6］，參與由EPO-EPOR結(jié)合而介導(dǎo)的細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)，對腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞損傷發(fā)揮抗炎抗凋亡的保護作用［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血后海馬CA3區(qū)中EPO和STAT5表達(dá)水平具有協(xié)同作用的正相關(guān)性［8］，局灶性腦缺血后EPO通過介導(dǎo)EPOR-JAK2-STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，啟動下游因子STAT5磷酸化，活化的STAT5能有效上調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B cell lymphoma 2，Bcl-2）等抗凋亡蛋白的表達(dá)，并能良性下調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 Associated X protein，BAX）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）等促凋亡蛋白的表達(dá)［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組在腦缺血2 h至1 d后出現(xiàn)p-STAT5的高水平表達(dá)，由此推斷p-STAT5表達(dá)的高峰出現(xiàn)在腦缺血損傷早期，可能是由于腦缺血后機體應(yīng)激性上調(diào)STAT5的表達(dá)，達(dá)到提高修復(fù)受損神經(jīng)元能力的目的。在腦缺血后3 d，模型組p-STAT5表達(dá)開始下降，這可能與缺血再灌注損傷程度加深以及缺血持續(xù)時間加長所導(dǎo)致，是缺血損傷程度超過了機體自我修復(fù)能力的表現(xiàn)。電針組在缺血早期同樣可見p-STAT5的高水平表達(dá)，與同時間段模型組p-STAT5的含量無顯著性差異。而當(dāng)腦缺血持續(xù)3 d后，電針組p-STAT5的含量顯著高于模型組，并且能在較長的一段時間內(nèi)高水平表達(dá)，表明電針刺激已啟動了機體內(nèi)自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制，良性上調(diào)p-STAT5的表達(dá)，并促使其保護效應(yīng)維持一段較長的時間，抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮保護腦組織作用。同時觀察結(jié)果提示，電針刺激在腦缺血早期就能發(fā)揮修復(fù)受損腦組織的作用，應(yīng)盡早介入治療。

圖1　不同時間段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5免疫熒光檢測結(jié)果（×400）Figure 1　Expression levels of p-STAT5 in rat affected cortex of different groups detected by immunofluorescence technique（×400）

腦缺血后EPO和EPOR結(jié)合活化JAK2，而介導(dǎo)STAT5磷酸化啟動下游因子，抑制神經(jīng)元凋亡，參與調(diào)節(jié)腦組織保護作用［10］。AG490是JAK2蛋白激酶的特異性磷酸化抑制劑，其作用是通過競爭受體抑制JAK2磷酸化，從而阻斷JAK2/STAT5信號通路，抑制其介導(dǎo)下游因子的轉(zhuǎn)錄功能［11］。本研究觀察到在腦缺血損傷過程中缺血后2 h、1 d期間p-STAT5的表達(dá)達(dá)到峰值，AG490+電針組含量只與AG490組相近而顯著低于同時段的模型組和電針組。這可能是注射AG490后，特異性抑制JAK2磷酸化，阻滯JAK2/STAT5信號通路的活化，從而降低p-STAT5的表達(dá)。同時，本研究結(jié)果顯示：AG490+電針組p-STAT5的表達(dá)均顯著低于同時段的電針組。在注射AG490后，電針并沒有表現(xiàn)出上調(diào)p-STAT5表達(dá)，增強p-STAT5活性的效應(yīng)，表明當(dāng)阻滯上游啟動因子JAK2磷酸化后，電針對STAT5的活化作用并不明顯。由此推斷電針上調(diào)p-STAT5表達(dá)水平以抑制神經(jīng)元凋亡、減輕腦缺血損傷的保護作用，可能是通過啟動JAK2/ STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。

表2　不同時段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5蛋白表達(dá)情況Table 2　Expression levels of p-STAT5 protein in rat affected cortex of different groups detected by Western blotting method （±s，D）

表2　不同時段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5蛋白表達(dá)情況Table 2　Expression levels of p-STAT5 protein in rat affected cortex of different groups detected by Western blotting method （±s，D）

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.01，與電針組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組AG490組AG490+電針組N 4 4 4 4 4 t=2 h 0.01±0.01 0.52±0.06①0.51±0.05 0.33±0.06③④0.35±0.07③④t=1 d 0.02±0.01 0.50±0.07①0.54±0.06 0.32±0.06③④0.34±0.05③④t=3 d 0.01±0.01 0.29±0.06①0.39±0.06③0.18±0.04③④0.22±0.04②④t=7 d 0.01±0.01 0.16±0.03①0.18±0.04 0.11±0.02③④0.13±0.02②④t=21 d 0.02±0.01 0.04±0.02 0.04±0.03 0.03±0.02 0.04±0.02

圖2　不同時間段病灶側(cè)皮質(zhì)p-STAT5蛋白印跡圖Figure 2　Western blotting results for the expression level of p-STAT5 protein in rat affected cortex of different groups

局灶性腦缺血后STAT5的高表達(dá)有利于抑制神經(jīng)元凋亡從而減輕腦組織的損傷［2］。針刺百會、大椎后能較長時間維持p-STAT5的高水平表達(dá)，可能是通過激活JAK2/STAT5信號通路，上調(diào)p-STAT5含量，激發(fā)機體自我保護機制，從而發(fā)揮修復(fù)受損神經(jīng)元的作用，這可能是電針療法治療腦缺血疾病的內(nèi)在作用機制之一。

［1］Miljus N，Heibeck S，Jarrar M，et al.Erythropoietin-mediated protection of insect brain neurons involves JAK and STAT but not PI3K transduction pathways［J］.Neuroscience，2014，258（1）：218.

［2］Kosan C，Ginter T，Heinzel T，et al.STAT5 acetylation：Mechanisms and consequences for immunological control and leukemogenesis［J］.JAKSTAT，2013，2（4）：e26102.

［3］Bell B D，Kitajima M，Larson R P，et al.The transcription factor STAT5 is critical in dendritic cells for the development of TH2 but not TH1 responses［J］.Nat Immunol，2013，14（4）：364.

［4］Liu R，Xu N G，Yi W，et a1．Electroacupuncture effects on cortical neurons，as well as Janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3 signal transduction pathway，in a rat model of cerebral ischemia［J］．Neural Regen Res，2012，7（6）：457

［5］Paxinos G，Watson C．The rat brain in stereotaxic coordinates ［M］.6th Edition.Pittsburgh：Academic Press，2007：402.

［6］Harrison D A.The JAK/STAT pathway［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4（3）：1.

［7］Letourneur A，Petit E，Roussel S，et al.Brain ischemic injury in rodents：the protective effect of EPO［J］.Methods Mol Biol，2013（982）：79.

［8］Ogawa C，Tone Y，Tsuda M，et al.TGF-β mediated Foxp3 gene expression is cooperatively regulated by Stat5，Creb，and AP-1 through CNS2［J］.J Immunol，2014，192（1）：475.

［9］Shen J，Wu Y，Xu J Y，et al.ERK-and Akt-dependent neuroprotection by erythropoietin（EPO）against glyoxal-AGEs via modulation of Bcl-xL，Bax，and BAD［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51（1）：35.

［10］Sola A，Rogido M，Lee B H，et al.Erythropoietin after focal cerebral ischemia activates the Janus kinase-signal transducer and activator of transcription signaling pathway and improves brain injury in postnatal day 7 rats［J］.Pediatr Res，2005，57（4）：481.

［11］Joung Y H，Na Y M，Yoo Y B，et al.Combination of AG490， aJak2inhibitor， andmethylsulfonylmethane synergistically suppresses bladder tumor growth via the Jak2/ STAT3 pathway［J］.Int J Oncol，2014，44（3）：883.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Effect of Electroacupuncture on Phosphorylated Signal Transducer and Activator of Transcription 5 Expression in Rats with Focal Cerebral Ischemia in Different Periods

HUANG Kangbai，TANG Chunzhi，ZHONG Guoxin，XU Nenggui，YI Wei
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo observe the effects of electroacupuncture（EA）on the phosphorylated signal transducer and activator of transcription 5（p-STAT5）in the marginal zone of the ischemic foci of rats with focal cerebral ischemia at different time points，so as to further explore its underlying mechanism in the treatment of cerebral ischemia.Methods SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，EA group （EA on acupoints of Baihui and Dazhui），AG490 group（intracerebroventricular injection with blocker AG490）and AG490+EA group.Heat-coagulation-induced occlusion of the middle cerebral artery was performed toestablish the model of focal cerebral ischemia.AG490 group and AG490+EA group were given intracerebroventricular injection with blocker AG490 20 min before the heat-coagulation-induced occlusion. Immunofluorescence technique and Western blotting method were used to detect the expression of p-STAT5 in rat affected cortex at different time points.Results The expression of p-STAT5 in each group at different time points showed the similar development trend presented by the results of immunofluorescence technique and Western blotting method.The sham operation group had a small amount of p-STAT5 expression at different time points；the model group had higher p-STAT5 expression level than the sham operation group after ischemia for 2 h to 7 d（all P＜0.01）；EA group hadhigher p-STAT5 expression level showed by immunofluorescence technique than the model group after ischemia for 3 d to 7 d（P＜0.05 or P＜0.01），and had higher proteinexpression level showed by Western blotting method on ischemia day 3（P＜0.01）；AG490 group and AG490+EA group had lower p-STAT5 mRNA expression level showed by immunofluorescence technique than the model group and EA group after ischemia for 2 h to 3 d（P＜0.05 or P＜0.01），had lower mRNA expression level than EA group on ischemia day 7（P＜0.01），and had lower p-STAT5 expression level showed by Western blotting method than the model group and EA group after ischemia for 2 h to 7 d（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion The therapeutic mechanism of EA for ischemic cerebral injury may be related to the up-regulation of p-STAT5 expression in the marginal zone of the ischemic foci through activating JAK2.

cerebral ischemia/acupuncture therapy；p-STAT5；AG490；cerebral cortex/pathology；protein expression；disease models，animal；rats

R246.9

A

1007-3213（2016）04-0515-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.018

2016-03-21

黃康柏（1981-），男，講師；E-mail：kb_huang@126.com

許能貴（1964-），男，研究員；E-mail：ngxu@tom.com

廣東省重點實驗室建設(shè)項目（編號：2012A061400017）；廣東省自然科學(xué)基金項目（編號：2015A030310375）；廣東省中醫(yī)藥管理局項目（編號：20151232）