長枝木霉菌株T05液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢和菌絲生物量條件的篩選1)

池玉杰　　　　　　伊洪偉　　　　吉海龍

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)　　　(重慶市農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所)　　　(東北林業(yè)大學)

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長枝木霉菌株T05液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢和菌絲生物量條件的篩選1)

池玉杰伊洪偉吉海龍

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)(重慶市農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所)(東北林業(yè)大學)

采用PDB培養(yǎng)基，對長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)菌株T05液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)分生孢子、菌絲和厚垣孢子的理想條件進行了篩選，分別測試了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液初始pH、供氧量和初始接菌量的影響。結(jié)果表明：在150 r·min-1振蕩培養(yǎng)條件下，菌株T05產(chǎn)生分生孢子的適宜液態(tài)發(fā)酵條件為，培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)液初始pH=12、供氧條件為250 mL的三角瓶裝瓶量40 mL、250 mL的三角瓶裝瓶量100 mL的情況下初始接菌量為0.5 mL，在這樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5～7 d；產(chǎn)生菌絲和厚垣孢子的適宜液態(tài)發(fā)酵條件為，培養(yǎng)最適溫度較低為20 ℃培養(yǎng)5 d；培養(yǎng)液初始pH值接近中性為6；供氧條件是初始裝液量較多較有利，為250 mL的三角瓶裝瓶量160 mL；初始接菌量是較少較有利，為250 mL的三角瓶裝瓶量100 mL的情況下接菌量為0.05 mL。

長枝木霉；液態(tài)發(fā)酵；分生孢子；產(chǎn)孢量；菌絲生物量；厚垣孢子

We screened the optimal liquid fermentation conditions forTrichodermalongibrachiatumstrain T05 to produce conidia and hyphae biomass in PDB medium, four factors including culture temperature, initial pH value of culture solution, oxygen supply quantum, and tested initial inoculum volume for sporulation quantity. Under 150 r·min-1oscillatory incubation, the optimal conditions for T05 to produce conidia were the temperature of 30 ℃, the initial pH of 12, 40 mL PDB medium bottled in 250 mL conical flask, and the initial inoculum volume 0.5 mL in 100 mL PDB in 250 mL flask for 5-7 d culture, and the optimal conditions to produce mycelia and chlamydospores were the culture temperature of 20 ℃, the initial pH of 6, 160 mL PDB medium bottled in 250 mL conical flask, and the initial inoculum volume 0.05 mL in 100 mL PDB in 250 mL flask for 5 d.

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，化學農(nóng)藥的使用已經(jīng)大大減少，正在使用中的化學農(nóng)藥也多為低毒、低殘留類產(chǎn)品，對環(huán)境的保護已經(jīng)深為大眾所接受。然而，雖然采用的農(nóng)藥為低毒、低殘留產(chǎn)品，仍然不能達到對環(huán)境無污染的要求。因此，生物農(nóng)藥的研究越來越受到重視。木霉(Trichodermaspp.)作為優(yōu)良的植物生防菌，憑借著對多種真菌病害的廣譜抗性、對環(huán)境的廣泛適應性和多機制性等特點，自20世紀30年代以來一直都是植物病害專家研究的重要對象，其生防效果已得到廣泛認同[1-2]，已經(jīng)在植物病害的防治中發(fā)揮了巨大作用。木霉生物制劑的使用不僅可以減少化學殺菌劑的使用，許多木霉還具有降解和轉(zhuǎn)化一些可能有害或持久存在的有害的環(huán)境污染物及多種有機大分子的能力，其中包括有害的生物異源物質(zhì)如DDT、馬拉硫磷、茅草枯、內(nèi)硫肽、五氯硝基苯和五氯苯酚[3-4]。不同的木霉菌株生長需要相對不同的營養(yǎng)和環(huán)境條件，如果要廣泛應用木霉防治植物病害，首先要解決的問題就是要獲得木霉高生物量的不同產(chǎn)物。很多研究表明，木霉的孢子不但具有很好的生防效果，而且能提高出苗率、促進植株生長、增加產(chǎn)量等[5-6]。木霉類制劑主要包括分生孢子制劑、厚垣孢子和菌絲體制劑[7]，木霉一般除產(chǎn)生大量的分生孢子外，菌絲上也會產(chǎn)生較多的厚垣孢子[8]。由于木霉分生孢子產(chǎn)量大，木霉菌生防制劑所采用的劑型主要為分生孢子制劑，目前在歐美等國家已有大量商品化的產(chǎn)品，主要采用綠色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)等菌種生產(chǎn)。

很多的研究者應用廉價的培養(yǎng)基對木霉的發(fā)酵條件進行了一系列研究，其中包括液體培養(yǎng)和半固體培養(yǎng)。在實驗室獲得木霉菌發(fā)酵產(chǎn)孢的優(yōu)化條件對木霉孢子的大量生產(chǎn)具有重要意義，木霉的產(chǎn)孢條件受營養(yǎng)條件、溫度、光照、pH值、通氧量、接菌量等多項因素的影響[9-10]，研究這些液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢條件以期獲得較高量的孢子，是實現(xiàn)木霉菌在生物防治方面廣泛應用的前提。目前國內(nèi)對于長枝木霉(T.longibrachiatum)在林木病害生物防治方面的研究還很少[11]。本研究以經(jīng)濟易得的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基為營養(yǎng)基質(zhì)，從培養(yǎng)溫度、pH值、供氧量、接菌量幾個方面研究了長枝木霉菌株T05產(chǎn)分生孢子、菌絲和厚垣孢子的條件，通過搖瓶法液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢條件的優(yōu)化研究，以期為今后大批量工業(yè)化生產(chǎn)長枝木霉菌劑提供理論數(shù)據(jù)基礎。

1　材料與方法

1.1菌種來源和培養(yǎng)基

長枝木霉菌株(T.longibrachiatum)T05，是自我采集、自行分離得到的1株木霉菌株，保存在東北林業(yè)大學森林病蟲病理實驗室(4 ℃)。

培養(yǎng)基：PDA(去皮馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，瓊脂條20 g，加水定容至1 L)；PDB(去皮馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)。

1.2菌種培養(yǎng)與分生孢子的收集

將菌株T05接種到直徑9 cm的PDA平板中心，在25 ℃下培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢后用10 mL無菌水將分生孢子洗脫下來(菌絲頂端或中間還有厚垣孢子，但被洗脫下來的主要是分生孢子)，用血球計數(shù)器調(diào)制成1×107個·mL-1的懸浮液，備用。

1.3T05液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢條件的篩選

1.3.1不同溫度下的產(chǎn)孢情況和菌絲生物量

在250 mL的三角瓶中加入100 mL PDB培養(yǎng)液，每瓶接種1.2中的孢子懸浮液1 mL，分別在20、23、25、27、30 ℃下于150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，分別在3、5、7 d鏡檢分生孢子和厚垣孢子的產(chǎn)生情況，并稱量菌絲干質(zhì)量。

1.3.2不同初始pH值下的產(chǎn)孢情況和菌絲生物量

在250 mL的三角瓶中分別加入100 mL PDB培養(yǎng)液，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值分別為2、4、6、8、10、12、14，每瓶接種1.2中的孢子懸浮液1 mL，分別于24、29 ℃下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，7 d鏡檢與稱質(zhì)量同1.3.1。

1.3.3不同供氧條件下(裝液量不同)的產(chǎn)孢情況和菌絲生物量

在250 mL三角瓶中分別加入20、40、80、160 mL的PDB培養(yǎng)液，每瓶接種1.2中的孢子懸浮液1 mL，分別于24、29 ℃下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，3、5、7 d鏡檢與稱質(zhì)量同1.3.1。

1.3.4不同初始接菌量下的產(chǎn)孢情況和菌絲生物量

在250 mL三角瓶中加入100 mL的PDB培養(yǎng)液，每瓶分別接種1.2中的孢子懸浮液0.05、0.50、1.00、1.50 mL，分別于25、30 ℃下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，3、5、7 d鏡檢與稱質(zhì)量同1.3.1。

1.3.1～1.3.4中的每個處理都為3個重復。

2　結(jié)果與分析

2.1溫度對產(chǎn)孢情況和菌絲生物量的影響

在不同溫度條件下3、5、7 d內(nèi)，菌株T05分生孢子的產(chǎn)生情況和菌絲生物量見表1。由表1可知，在試驗范圍內(nèi)，分生孢子的產(chǎn)量總體上隨著溫度的升高而遞增，在30 ℃下培養(yǎng)5 d時達到最高，為22.5×105菌落·mL-1，其次是在30 ℃下培養(yǎng)3 d時，此時的分生孢子量也已經(jīng)為9.5×105菌落·mL-1。因此，確定30 ℃為菌株T05液體發(fā)酵產(chǎn)生分生孢子的最適溫度，在此溫度下最適培養(yǎng)時間為5 d。在觀察中也發(fā)現(xiàn)，除了在20、23 ℃下3 d時，厚垣孢子的量較少外，其他各處理也產(chǎn)生較大量的厚垣孢子，隨著培養(yǎng)時間的加長，厚垣孢子的產(chǎn)量也增加，5～7 d最多。厚垣孢子生長在菌絲頂端和中間，是不連續(xù)或連續(xù)的單個和多個厚壁、內(nèi)部原生質(zhì)稠密的細胞，一般情況下菌絲量大，厚垣孢子的數(shù)量也多。培養(yǎng)溫度為20 ℃、5 d時菌絲干質(zhì)量最大，為1.003 4 g，并且各個培養(yǎng)溫度下均在5 d時菌絲干質(zhì)量達到最大。隨著溫度的升高，菌絲生物量呈緩慢下降的趨勢。所以，對于以生產(chǎn)菌絲和厚垣孢子為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，可以選擇培養(yǎng)溫度20 ℃、培養(yǎng)5 d為最適。

表1溫度和培養(yǎng)時間對T05菌株分生孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

溫度/℃培養(yǎng)時間/d分生孢子/105菌落·mL-1菌絲干質(zhì)量/g2031.250.899154.501.003474.500.85762332.250.705054.000.738770.500.78342532.500.687253.750.711677.250.710027300.575655.750.730474.750.59473039.500.7093522.500.584573.250.5290

2.2初始pH對產(chǎn)孢情況和菌絲生物量的影響

在不同初始pH條件下分別在24、29 ℃下培養(yǎng)7 d時，菌株T05在第7天分生孢子的產(chǎn)生情況和菌絲生物量見表2。由表2可知，在不同初始pH條件下，在培養(yǎng)溫度分別為24 ℃和29 ℃時，有較一致的分生孢子產(chǎn)生曲線，在較酸的條件下(pH<8)都不利于T05產(chǎn)生分生孢子，觀察中發(fā)現(xiàn)在初始pH=2時均不產(chǎn)生分生孢子，此時僅產(chǎn)生少量的厚垣孢子；以后隨著pH值的上升，分生孢子和厚垣孢子的量都上升，分生孢子的數(shù)量都是在初始pH=12時達到最大，在24 ℃下為129.0×105菌落·mL-1，在29 ℃下為553.0×105菌落·mL-1；當pH值繼續(xù)增加到14時，分生孢子分別下降到73.0×105、516.0×105菌落·mL-1，但是均高于pH=10時的分生孢子量。因此，對于以獲得分生孢子為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，確定菌株T05無論溫度是在24 ℃還是在29 ℃下，產(chǎn)生分生孢子的最適pH值都為12。但是，在29 ℃下的分生孢子量遠大于在24 ℃下，這與2.1的溫度測試結(jié)果相似。通過將2.2與2.1的結(jié)果對比可以看出，在適宜高溫29～30 ℃下提高初始pH值到12，可以20多倍地提高分生孢子的產(chǎn)量。

培養(yǎng)溫度分別為24、29 ℃時，也有較一致的菌絲生物量曲線，均在pH=6時菌絲干質(zhì)量達最大，分別為0.649 4、0.679 8 g；均在pH=2時菌絲干質(zhì)量有最小值，分別為0.112 2、0.220 6 g。在觀察中也發(fā)現(xiàn)，在pH值4～14時，在2個溫度下菌株T05也都能產(chǎn)生大量的厚垣孢子。因此，對于以獲得菌絲和厚垣孢子為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，初始pH=6為最適。

表2初始pH值對T05菌株分生孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

溫度/℃初始pH值分生孢子/105菌落·mL-1菌絲干質(zhì)量/g2420 0.112242.00.523863.00.649484.00.58521029.00.461912129.00.46231473.00.388429200.220644.00.521965.00.67988153.00.461410373.00.350812553.00.278014516.00.2585

2.3供氧條件對產(chǎn)孢情況和菌絲生物量的影響

在不同供養(yǎng)條件下(不同裝瓶量)培養(yǎng)溫度分別為24、29 ℃時，菌株T05在第3、5、7天分生孢子的產(chǎn)生情況和菌絲生物量見表3。由表3可知，在24 ℃下250 mL三角瓶裝液量80 mL、培養(yǎng)時間為5 d時，分生孢子產(chǎn)量最大，為25.0×105菌落·mL-1；在29 ℃下250 mL三角瓶裝液量40 mL、培養(yǎng)時間為5 d時，分生孢子產(chǎn)量最大，為211.0×105菌落·mL-1，其次是在同樣條件下3 d時，分生孢子量為156.0×105菌落·mL-1?？梢姡?9 ℃下的分生孢子量遠大于在24 ℃下，由此確定菌株T05產(chǎn)生分生孢子的最適供氧條件是在29 ℃下250 mL三角瓶裝液量40 mL、培養(yǎng)時間為5 d。

培養(yǎng)溫度分別為24、29 ℃時，有較一致的菌絲生物量規(guī)律，都是隨著裝瓶量的增加，菌絲干質(zhì)量也逐漸增加，都是在裝瓶量為160 mL、培養(yǎng)時間為7 d時，菌絲干質(zhì)量達到最大，分別為0.970 6、0.769 8 g，培養(yǎng)溫度為24 ℃下的菌絲生物量高于在29 ℃時的，可見溫度低有利于菌絲生物量的積累，這與2.1的溫度測試結(jié)果相似。在觀察中也發(fā)現(xiàn)，在24 ℃下不同裝液量的各個處理在3、5、7 d時都能產(chǎn)生大量的厚垣孢子；在29 ℃下20 mL裝液量在3、5、7 d時都產(chǎn)生少量的厚垣孢子，40～80 mL裝液量在3、5、7 d時就產(chǎn)生逐漸增多到大量的厚垣孢子，160 mL裝液量在3、5、7 d時都只產(chǎn)生厚垣孢子，而不產(chǎn)生分生孢子。因此，對于以獲得菌絲和厚垣孢子為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，初始裝液量較多較有利。

表3　供氧條件對T05菌株分生孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量

2.4接菌量對產(chǎn)孢情況和菌絲生物量的影響

在不同接菌量條件下培養(yǎng)溫度分別為25、30 ℃時，菌株T05在第3、5、7天分生孢子的產(chǎn)生情況和菌絲生物量見表4。由表4可知，在25 ℃下初始接菌量為1.5 mL，培養(yǎng)時間為7 d時，分生孢子數(shù)量達最大，為9.0×105菌落·mL-1；而且不同初始接菌量均是7 d達最大值。在30 ℃下初始接菌量為0.5 mL、培養(yǎng)7 d時，分生孢子數(shù)量達最大，為35.25×105菌落·mL-1；其次是在接菌量1.0 mL、培養(yǎng)5 d時，分生孢子量達到22.5×105菌落·mL-1。由此確定菌株T05產(chǎn)分生孢子最適的接菌量為30 ℃下250 mL三角瓶中接菌0.5 mL。

不同的初始接菌量之間，菌絲干質(zhì)量相差不大。在2個溫度下都是初始接菌量為0.05 mL，培養(yǎng)時間為5 d時，菌絲干質(zhì)量達最大，在25 ℃下為0.804 1 g，在30 ℃下為0.911 0 g。因此，對于已獲得菌絲為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，初始接菌量較少較有利。

表4接菌量對T05菌株分生孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量的影響

接菌量/mL培養(yǎng)時間/d分生孢子/105菌落·mL-125℃30℃菌絲干質(zhì)量/g25℃30℃0.0531.250 0.54830.831650.751.000.80410.911074.256.000.62990.71110.5031.0000.61770.798150.506.250.70860.792973.5035.250.78610.85231.0032.509.500.55150.787253.7522.500.64960.819877.253.250.79340.69521.5030.501.000.68090.736751.502.250.62760.771579.001.500.73120.6892

3　結(jié)論與討論

由于木霉菌劑多為孢子制劑，實現(xiàn)木霉孢子的大量生產(chǎn)是使木霉菌能夠在防治植物病害上大面積應用的前提。以往研究顯示，溫度是影響木霉生長的重要因子。本試驗測試不同溫度、不同時間條件下長枝木霉菌株T05產(chǎn)孢情況發(fā)現(xiàn)，在不同溫度下菌株T05的孢子在試驗范圍內(nèi)隨溫度的升高產(chǎn)量呈遞增的趨勢，孢子最大產(chǎn)量和次產(chǎn)量分別在溫度為30 ℃的第5天和第3天，這與臺蓮梅[11]的研究結(jié)果一致。以往報道顯示，康氏木酶在一定的pH范圍內(nèi)才能產(chǎn)生孢子，過酸或者過堿的環(huán)境都不利于孢子的產(chǎn)生。本試驗中長枝木霉菌株T05在pH值為2～8的條件下分生孢子產(chǎn)量相對很少，繼續(xù)升高pH值，分生孢子產(chǎn)生量迅速增大，當pH為12時，分生孢子產(chǎn)生量達到最大，是所有單項測試中的最大值，繼續(xù)升高pH值到14時，分生孢子的產(chǎn)生量出現(xiàn)下降，這與長枝木霉菌株T115D[11]在pH為7、8時產(chǎn)孢量較大不同，分析原因可能是不同菌株在特定環(huán)境條件下形成了獨特的產(chǎn)孢條件。從數(shù)據(jù)結(jié)果上看，pH值構(gòu)成菌株T05分生孢子產(chǎn)量的重要因素。供氧條件對木霉產(chǎn)生孢子有很大的影響，不同的裝液量提供了不同的供氧狀態(tài)。本試驗中，在24 ℃下培養(yǎng)5 d時，250 mL三角瓶裝液量80 mL產(chǎn)孢量最大，而在29 ℃下培養(yǎng)5 d時，250 mL三角瓶裝液量40 mL產(chǎn)孢量最大。但在29 ℃下的分生孢子量遠大于在24 ℃下。可見，溫度升高，菌株T05產(chǎn)孢速度快，耗氧量增加。綜合在不同溫度和不同裝液量條件下的培養(yǎng)結(jié)果可知，在分生孢子的產(chǎn)生上溫度高低要求不同的裝瓶量，溫度越高，會迅速產(chǎn)生更多的分生孢子，供氧量需求也急速增加。在5 d相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，少量的培養(yǎng)液中卻能產(chǎn)生更多量的分生孢子，既經(jīng)濟劃算又增加了產(chǎn)孢量。相同的培養(yǎng)環(huán)境條件，只有適當?shù)慕泳坎拍苓_到既不浪費營養(yǎng)，也不至于造成菌種的浪費。本研究試驗范圍內(nèi)，菌株T05產(chǎn)分生孢子最適的接菌量為30 ℃下250 mL三角瓶中裝瓶量100 mL的情況下初始接菌量為0.5 mL。以上從培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧條件和初始接菌量等4個方面的篩選結(jié)果來看，長枝木霉菌株T05產(chǎn)生分生孢子的適宜液態(tài)發(fā)酵條件為：在150 r·min-1振蕩培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)液初始pH=12、供氧條件為250 mL的三角瓶裝瓶量40 mL、在250 mL的三角瓶裝瓶量100 mL的情況下初始接菌量為0.5 mL，在這樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5～7 d。

本研究也從培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧條件和初始接菌量4個方面進行了獲得高菌絲生物量和厚垣孢子的條件篩選，在150 r·min-1振蕩培養(yǎng)條件下，產(chǎn)生菌絲和厚垣孢子的適宜液態(tài)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)最適溫度較低為20 ℃培養(yǎng)5 d；培養(yǎng)液初始pH值接近中性為6；供氧條件是初始裝液量較多較有利，為250 mL的三角瓶裝瓶量160 mL；初始接菌量是較少較有利，為250 mL的三角瓶裝瓶量100 mL的情況下接菌量為0.05 mL。

本試驗雖然只是實驗室內(nèi)的小規(guī)模試驗，但對大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的指導意義。

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1)國家林業(yè)局科技成果推廣項目([2004]57號);黑龍江省自然科學基金重點項目(ZD200901)。

Optimal Conditions forTrichodermalongibrachiatumStain T05 for Producing Conidia and Chlamydospores//

Chi Yujie

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Yi Hongwei(Fruit Tree Institute of Chongqing Agriculture Academy); Ji Hailong(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：110-113.

Trichodermalongibrachiatum; Liquid fermentation; Conidia; Sporulation quantity; Hyphae biomass; Chlamydospore

池玉杰，女，1964年4月生，東北林業(yè)大學林學院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2015年7月16日。

S718.81

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