長(zhǎng)枝木霉菌株T05發(fā)酵液抑菌力參數(shù)篩選1)

吉海龍　　　　　　　伊洪偉　　　　池玉杰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)　　　(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所)　　　(東北林業(yè)大學(xué))

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長(zhǎng)枝木霉菌株T05發(fā)酵液抑菌力參數(shù)篩選1)

吉海龍伊洪偉池玉杰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所)(東北林業(yè)大學(xué))

為了得到抑菌活性更高的發(fā)酵液，研究了長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)菌株T05發(fā)酵液及發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)灰霉病菌(灰葡萄孢(Botrytiscinerea))和楊樹(shù)爛皮病菌(污黑腐皮殼(Valsasordida))的抑菌活性，并以V.sordida作為指示菌對(duì)發(fā)酵液的培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH值、接菌量這4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明：T05發(fā)酵液對(duì)B.cinerea和V.sordida都有一定的抑制作用，對(duì)B.cinerea的最高抑菌率為PDB發(fā)酵液過(guò)濾除菌后在48 h的55.48%，對(duì)V.sordida的最高抑制率為改良馬丁培養(yǎng)基發(fā)酵液過(guò)濾除菌后48 h的48.68%；培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)2種病原菌的抑菌作用更為顯著，在24 h的抑菌率都為100%，在96 h時(shí)對(duì)2種病原菌的抑菌率分別為84.1%和82.6%，均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌活性。篩選后獲得最高抑菌率的最佳發(fā)酵組合為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、溫度28 ℃、初始pH=6、500 mL的三角瓶裝液量250 mL的條件下接菌量為0.5 mL。在該條件下T05發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物在96 h對(duì)V.sordida的抑菌率從82.9%上升到99.0%。

長(zhǎng)枝木霉；液態(tài)發(fā)酵；抑菌活性；參數(shù)篩選；楊樹(shù)爛皮病菌

We studied the antifungal activity of fermentation broth and its ethyl acetate extracts ofTrichodermalongibrachiatumstrain T05, and screened and optimized four parameters including culture time, culture temperature, the initial pH value, and the initial inoculum volume by usingValsasordidaas an indicator pathogen to get higher antifungal activity of the fermentation liquid. The fermentation broth of T05 could inhibit both Botrytis cinerea andV.sordida, the highest inhibition rate toB.cinereawas 55.48% by 48 h after the fermentation broth in PDB was removed bacteria by filter, whereas, the highest inhibition rate toV.sordidawas 48.68% by 48 h after the fermentation broth in Martin medium was removed bacteria by filter. The ethyl acetate extracts of T05 fermentation broth after culturing for 7 d had a stronger antifungal activity both toB.cinereaandV.sordida, the inhibition rate by 24 h were both 100%, and the highest inhibition rate by 96 h were 84.1% and 82.6%, respectively. After screening the optimal parameter combinations to get the highest inhibition rate were: culturing for 6 days, culture temperature of 28 ℃, the initial pH of 6, and the initial inoculum volume of 0.5 mL in 500 mL conical flask bottled 250 mL medium, and the inhibition rate at 96 h was increased from 82.9% to 99%.

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類(lèi)廣譜的生防真菌，利用木霉菌防治植物真菌病害的機(jī)制是多種多樣的，不同的木霉菌株表現(xiàn)出不同的生防能力。木霉菌對(duì)多種植物病原菌都有較好的防治效果[1]，在蔬菜和水果病害防治上的應(yīng)用是很多的，如番茄灰霉病、黃瓜苗期立枯病、豇豆炭疽病、萵苣小菌核病等[2-4]，在對(duì)草莓灰霉病的防治中也取得了可喜的成果[5]。木霉能夠通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生作用、誘導(dǎo)抗性、協(xié)同拮抗作用等機(jī)制抑制病原菌的生長(zhǎng)，木霉固體和液體發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病原菌均具有高效的抑制作用，是生防的重要作用機(jī)制之一[6-7]，如綠木霉(T.virens)發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的抑制效果在48 h分別達(dá)到63.6%和62.0%[8]，因此獲得較為理想的抑菌發(fā)酵條件也是實(shí)現(xiàn)木霉廣泛應(yīng)用的前提，培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接菌量都是影響木霉菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物種類(lèi)和含量較重要的指標(biāo)[9-10]。筆者研究了長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T05對(duì)灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和楊樹(shù)爛皮病菌(Valsasordida)對(duì)峙生長(zhǎng)的抑菌活性、揮發(fā)性物質(zhì)和4種分生孢子提取物的抑菌效果，揭示了其部分抑菌機(jī)制，本研究繼續(xù)對(duì)菌株T05的發(fā)酵液及發(fā)酵液乙酸乙脂提取物的抑菌活性進(jìn)行了研究，以進(jìn)一步揭示其抑菌機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上，用改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株發(fā)酵液，對(duì)培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接菌量4個(gè)影響發(fā)酵產(chǎn)物種類(lèi)和含量的關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化篩選，目的為得到抑菌活性更高的發(fā)酵液，其中能產(chǎn)生更多、更有效的抑菌活性成分，為今后實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)枝木霉菌劑的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種來(lái)源和培養(yǎng)基

菌種來(lái)源：長(zhǎng)枝木霉菌株T05，是自我采集、自行分離得到的1株木霉菌株；楊樹(shù)爛皮病菌自我采集于哈爾濱市道邊楊樹(shù)并分離得到；灰霉病菌由他人惠贈(zèng)。以上所有菌種保存于PDA斜面上存放于東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲(chóng)病理實(shí)驗(yàn)室(4 ℃)。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g煮汁，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)；PDB培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)；改良馬丁培養(yǎng)基(蛋白胨5.0 g，K2HPO4·3H2O為1.0 g，酵母浸出粉2.0 g，MgSO4·7H2O為0.5 g，葡萄糖20.0 g，加水定容至1 L)。

1.2T05發(fā)酵液抑菌性能的測(cè)定

將分別用PDB和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d(180 r·min-1、25 ℃下?lián)u床培養(yǎng))的T05發(fā)酵液，用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，分別各取100 mL濾液經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，20 min)和經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器(0.22 μm)除細(xì)菌和孢子后，用移液器取1 mL滴于PDA平板上，并用滅菌的刮涂器涂抹均勻，然后在平板中心處接種直徑為10 mm的B.cinerea和V.sordida菌餅，用十字交叉法每隔24 h觀(guān)測(cè)菌落生長(zhǎng)直徑，設(shè)3次重復(fù)，以1 mL無(wú)菌水涂抹平板作為對(duì)照。抑菌率計(jì)算公式為：抑菌率=((病原菌對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑)×100%。

1.3T05發(fā)酵液乙酸乙酯提取物抑菌性能的測(cè)定

將在PDA平板上生長(zhǎng)7 d的T05分生孢子，用10 mL無(wú)菌水洗下，用血球計(jì)數(shù)器調(diào)制成濃度為107菌落·mL-1的孢子懸浮液，接種1 mL孢子懸浮液到裝有250 mL改良馬丁培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，3個(gè)重復(fù)，恒溫振蕩培養(yǎng)(180 r·min-1、25 ℃)7 d后，將發(fā)酵液用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾得到菌絲并測(cè)其干質(zhì)量，將濾液按體積比1∶1與乙酸乙酯混合，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱(200 r·min-1、25 ℃)萃取1 d后去除無(wú)機(jī)相，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)相，然后用20 mL 10%的Tween 80溶液溶解萃取物，將所得的濃縮液用0.22 μm濾膜除菌后與100 mL 50 ℃的PDA培養(yǎng)基混合后倒平板(一般倒3個(gè)平板)，接種直徑10 mm的B.cinerea和V.sordida菌餅，以20 mL 10%的Tween 80除菌后與100 mL 50 ℃的PDA培養(yǎng)基混合后倒平板、接種直徑10 mm的病原菌作為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于生化培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，每24 h用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)1.2的公式計(jì)算抑菌率。

1.4T05發(fā)酵液的抑菌力條件篩選

1.4.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲生物量和發(fā)酵液提取物抑菌性能的影響

按照1.3的方法，將菌株T05分別發(fā)酵培養(yǎng)至2、4、6、8、10、15、20 d，測(cè)菌絲干質(zhì)量，發(fā)酵液獲得乙酸乙酯萃取物后，將V.sordida做為指示病原菌，檢測(cè)96 h的抑菌率。

1.4.2培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生物量和發(fā)酵液提取物抑菌性能的影響

按照1.3的方法，在1.4.1獲得最佳培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，分別在15、20、25、28、30、35、40 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)菌絲干質(zhì)量，發(fā)酵液獲得乙酸乙酯萃取物后，檢測(cè)96 h對(duì)V.sordida的抑菌率。

1.4.3初始pH對(duì)菌絲生物量和發(fā)酵液提取物抑菌性能的影響

按照1.3的方法，在獲得最佳培養(yǎng)時(shí)間和最適培養(yǎng)溫度的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)液初始pH值調(diào)為2、4、6、8、10、12、14，在各pH進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)菌絲干質(zhì)量，發(fā)酵液獲得乙酸乙酯萃取物后，檢測(cè)96 h對(duì)V.sordida的抑菌率。

1.4.4接菌量對(duì)菌絲生物量和發(fā)酵液提取物抑菌性能的影響

按照1.3的方法，在獲得最佳培養(yǎng)時(shí)間、最適培養(yǎng)溫度和最適初始pH值的基礎(chǔ)上，在初始接菌量分別為0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mL的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)菌絲干質(zhì)量，發(fā)酵液獲得乙酸乙酯萃取物后，檢測(cè)96 h對(duì)V.sordida的抑菌率。

2　結(jié)果與分析

2.1T05發(fā)酵液的抑菌性能

在PDB和改良馬丁培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d的T05發(fā)酵液，分別經(jīng)高壓滅菌和細(xì)菌過(guò)濾器除菌后對(duì)B.cinerea和V.sordida的抑菌結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，T05的發(fā)酵培養(yǎng)液分別經(jīng)高壓滅菌和細(xì)菌過(guò)濾器除菌后，對(duì)2種病原菌都有一定的抑制作用，表明菌株T05能夠產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)；過(guò)濾除菌的抑菌率都高于高壓滅菌的抑菌率，表明一些抑菌物質(zhì)是熱穩(wěn)定性的，而另一些是熱不穩(wěn)定性的。2種培養(yǎng)基的發(fā)酵液經(jīng)高壓滅菌后，對(duì)2種病原菌的抑制基本上都是隨著時(shí)間的變化而逐漸減弱，都是在24 h的抑菌率最高；而2種培養(yǎng)基的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾器除菌后分別對(duì)2種病原菌的抑制差別不大，都是在48 h達(dá)到最高，然后逐漸下降。其中PDB發(fā)酵液過(guò)濾除菌后對(duì)B.cinerea的最高抑菌率為48 h的55.48%，改良馬丁培養(yǎng)基發(fā)酵液過(guò)濾除菌后對(duì)V.sordida的最高抑制率為48 h的48.68%。

表1　T05發(fā)酵液對(duì)B. cinerea和V. sordida的抑制

2.2T05發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的抑菌性能

在改良馬丁培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d的T05菌株發(fā)酵液，經(jīng)乙酸乙酯萃取后對(duì)B.cinerea和V.sordida的抑菌結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，T05發(fā)酵液產(chǎn)生的活性物質(zhì)經(jīng)乙酸乙酯萃取后對(duì)2種病原菌都表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌活性，在24 h的抑菌率都為100%，以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢下降。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B.cinerea在60 h后開(kāi)始緩慢生長(zhǎng)，V.sordida在48 h后開(kāi)始逐漸生長(zhǎng)，發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)在96 h時(shí)對(duì)2種病原菌的抑菌率分別為84.1%和82.6%，以后逐漸下降。

表2T05發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)B.cinerea和V.sordida的抑制

培養(yǎng)時(shí)間/hB.cinerea處理直徑/cm對(duì)照直徑/cm抑菌率/%V.sordida處理直徑/cm對(duì)照直徑/cm抑菌率/%240 0.48100.00 1.92100.04801.51100.00.092.8796.7720.152.7594.50.475.0590.7960.543.3984.11.357.7982.6

2.3T05不同液體發(fā)酵條件下菌絲生物量和抑菌性能

2.3.1不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05發(fā)酵培養(yǎng)至不同時(shí)間的菌絲干質(zhì)量和發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率見(jiàn)表3。由表3知，T05生長(zhǎng)很快，最初隨著時(shí)間的延長(zhǎng)生物量增加，到第6天達(dá)到最高，為7.121 g·L-1，以后又逐漸下降。從宏觀(guān)上可以看到，接菌1 d后三角瓶中就出現(xiàn)呈球狀的菌絲體，3 d后可以觀(guān)察到大量菌絲體且培養(yǎng)基顏色逐漸加深呈黃色，10 d后培養(yǎng)基顏色逐漸變?yōu)榧t褐色；從第2天開(kāi)始T05產(chǎn)生的代謝物質(zhì)就能對(duì)病原菌產(chǎn)生抑菌作用，隨著時(shí)間的推移代謝產(chǎn)物逐漸積累，其抑菌能力也在不斷的增強(qiáng)，96 h在第6天時(shí)的抑菌能力達(dá)到最強(qiáng)，抑菌率高達(dá)82.90%，以后隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌能力逐漸降低。不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液提取物對(duì)病菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響也不同。因此，在25 ℃條件下，產(chǎn)菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵時(shí)間均為6 d。

表3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)T05菌絲生物量和發(fā)酵液抑菌率的影響

培養(yǎng)時(shí)間/d菌絲干質(zhì)量/g·L-1抑菌率/%25.71064.1045.84371.4067.12182.9086.68374.80105.63268.30154.67165.40204.42764.10

2.3.2不同溫度的菌絲生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05不同培養(yǎng)溫度的菌絲干質(zhì)量和發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率見(jiàn)表4。由表4可知，T05在15～40 ℃均能生長(zhǎng)，適當(dāng)?shù)蜏馗欣诰z的生長(zhǎng)，在20 ℃時(shí)其菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，為7.956 g·L-1，以后繼續(xù)增加培養(yǎng)溫度其菌絲干質(zhì)量逐漸減少；T05在不同溫度下產(chǎn)生的代謝物質(zhì)對(duì)病原菌均有不同程度的抑菌作用，96 h的抑菌率為53.7%～87.4%，初期隨著培養(yǎng)溫度的增加抑菌能力逐漸增加，當(dāng)溫度增至28 ℃時(shí)抑菌活性達(dá)到最高，抑菌率為87.4%，以后隨著培養(yǎng)溫度的增加抑菌能力緩慢下降。因此，在不同培養(yǎng)溫度條件下6 d時(shí)，產(chǎn)菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵溫度分別為20、28 ℃。

表4培養(yǎng)溫度對(duì)T05菌絲生物量和發(fā)酵液抑菌率的影響

培養(yǎng)溫度/℃菌絲干質(zhì)量/g·L-1抑菌率/%156.54653.70207.95679.60257.55383.00287.12187.40306.29085.90355.54382.70405.34177.20

2.3.3不同初始pH值的菌絲生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05不同初始pH值下的菌絲干質(zhì)量和發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率見(jiàn)表5。由表5可知，過(guò)酸或過(guò)堿都不利于菌絲的生長(zhǎng)，從pH等于2開(kāi)始，隨著pH值的增加，T05菌絲的生物量也隨之增加，當(dāng)pH為6時(shí)，菌絲產(chǎn)量達(dá)到最大，為7.433 g·L-1。當(dāng)pH繼續(xù)增加，菌絲生物量隨之下降；過(guò)酸或過(guò)堿也不利于抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，當(dāng)pH=6時(shí)，發(fā)酵液的抑菌能力最強(qiáng)，96 h的抑菌率高達(dá)93.9%，因此，在最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d、最佳發(fā)酵溫度為28 ℃的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)的最佳初始pH值均為6。

表5初始pH值對(duì)T05菌絲生物量和發(fā)酵液抑菌率的影響

初始pH值菌絲干質(zhì)量/g·L-1抑菌率/%23.46745.2045.73362.5067.43393.9087.16688.30104.66763.40122.93345.50140.4072.60

2.3.4不同接菌量的菌絲生物量和提取物的抑菌性能

菌株T05不同接菌量的菌絲干質(zhì)量和發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的抑菌率見(jiàn)表6。由表6可知，當(dāng)接菌量為0.10 mL時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，為7.682 g·L-1，以后隨著接菌量的繼續(xù)增加，菌絲體產(chǎn)量出現(xiàn)了下降，但變化不大；當(dāng)接菌量為0.50 mL時(shí)，其抑菌活性在96 h高達(dá)99.00%，病原菌幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)。因此，在最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d、最佳發(fā)酵溫度為28 ℃、最佳初始pH值為6的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)的最佳接菌量分別為0.10、0.50 mL。

表6　接菌量對(duì)T05菌絲生物量和發(fā)酵液抑菌率的影響

3　結(jié)論與討論

木霉作為一類(lèi)重要的生防菌，其對(duì)病原菌的防治機(jī)制是多種多樣的，木霉在液體發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌有抑制作用，因此研究其發(fā)酵液的抑菌活性也是探索其拮抗機(jī)制的一個(gè)重要方面。本試驗(yàn)中長(zhǎng)枝木霉菌株T05的發(fā)酵液經(jīng)高壓滅菌和過(guò)濾器除菌后，對(duì)灰霉病菌和楊樹(shù)爛皮病菌都有一定的抑制作用，過(guò)濾除菌的抑菌率高于高壓滅菌的抑菌率，表明菌株T05能夠產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，其中一些抑菌物質(zhì)是熱穩(wěn)定性的，而另一些是熱不穩(wěn)定性的。對(duì)B.cinerea的最高抑菌率為PDB發(fā)酵液過(guò)濾除菌后在48 h的55.48%，對(duì)V.sordida的最高抑制率為改良馬丁培養(yǎng)基發(fā)酵液過(guò)濾除菌后在48 h的48.68%；而培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)2種病原菌的抑菌作用更為顯著，在24 h的抑菌率都為100%，在96 h時(shí)對(duì)2種病原菌的抑菌率分別為84.1%和82.6%，均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌活性。有研究表明，哈茨木霉(T.harzianum)發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物可以降低致病疫霉(Phytophthorainfestans)菌體可溶性蛋白含量，降低保護(hù)酶活性，這是抑制病原菌的機(jī)理之一[11]。

本試驗(yàn)也以V.sordida作為指示菌，采用改良馬丁培養(yǎng)基，從培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、初始pH值、接菌量這4項(xiàng)影響發(fā)酵產(chǎn)物種類(lèi)和含量的關(guān)鍵因素指標(biāo)出發(fā)，對(duì)T05發(fā)酵液的菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件參數(shù)進(jìn)行了篩選，目的為得到抑菌活性更高的發(fā)酵液，能產(chǎn)生更多、更有效的抑菌活性成分。篩選后菌株T05獲得最高抑菌率的最佳發(fā)酵組合為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、溫度28 ℃、初始pH值為6、500 mL的三角瓶裝液量250 mL的條件下接菌量為0.5 mL，經(jīng)過(guò)逐級(jí)優(yōu)化篩選后，使T05發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物在96 h對(duì)V.sordida的抑菌率從82.9%上升到99%，病原菌幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)。獲得最高菌絲生物量的最佳發(fā)酵組合為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、溫度20 ℃、初始pH值6、500 mL的三角瓶裝液量250 mL的條件下接菌量為0.10 mL。

有研究顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，木霉菌絲體生物量增加到最大值后逐漸下降。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，木霉菌株T05的菌絲生物量最初隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，直到第6天達(dá)到最大值后又逐漸下降，其對(duì)V.sordida的抑菌率也在第6天達(dá)到最大值后逐漸下降，這與菌絲體的生長(zhǎng)規(guī)律比較相似，推測(cè)原因可能是初期菌絲生物量與抑菌活性物質(zhì)基本同步增加，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少，菌絲體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象直到生長(zhǎng)停止，代謝產(chǎn)物也減少，同時(shí)一些代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定，隨著時(shí)間的推移也逐步分解。溫度也是菌絲生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)蜏?20 ℃)下有助于菌絲體的生長(zhǎng)，菌絲干質(zhì)量最大，但不利于產(chǎn)生有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物；而適當(dāng)高溫(最適溫度為28 ℃)有助于次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如在25～40 ℃時(shí)，T05發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物都能更有效地抑制V.sordida的生長(zhǎng)。表明菌絲生物量與發(fā)酵液的抑菌率在不同條件下不一致，不是都成正比關(guān)系。過(guò)酸或過(guò)堿的培養(yǎng)條件都不利于菌株的生長(zhǎng)，同時(shí)也不利于菌株T05產(chǎn)生并積累次生抑菌活性物質(zhì)，當(dāng)pH=6時(shí)菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，其對(duì)病原菌的抑菌率也最高；當(dāng)pH≤4或pH≥10時(shí)，其對(duì)V.sordida的抑菌率均降到65%以下。接菌量對(duì)T05產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響也較為明顯，把握好接菌量也可以更高效地得到抑菌活性物質(zhì)。

本研究為深入研究木霉菌代謝產(chǎn)物提供了參考，同時(shí)也為研制和開(kāi)發(fā)生物防治木霉制劑提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

[1]高克祥，劉曉光，郭潤(rùn)芳，等．木霉菌對(duì)五種植物病原真菌的重寄生作用[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，33(1):37-42.

[2]ADEBANJO A, BANKOLE S A． Evaluation of some fungi and bacteria for biocontrol of anthracnose disease of cowpea[J]．Journal of Basic Microbiology,2004,44(1):3-9.

[3]ROBERTS D P, LOHRKE S M, MEYER S L F, et al． Biocontrol agents applied individually and in combination for suppression of soilborne diseases of cucumber [J]． Crop Protection,2005,24(2):141-155.

[4]RABEENDRAN N, JONES E E, MOOT D J, et al． Biocontrol ofSclerotinialettuce drop byConiothyriumminitansandTrichodermahamatum[J]. Biological Control,2006,39(3):352-362.

[5]朱虹，汪章勛，樊美珍，等．草莓灰霉病拮抗木霉菌株篩選及溫室防效測(cè)定[J].中國(guó)生物防治，2005，21(1)：52-54.

[6]HARMAN G E, HOWELL C R, VITERBO A, et al. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts[J]. Nature Reviews Microbiology,2004,2(1):43-56.

[7]HARMAN G E. Overview of mechanisms and uses ofTrichodermaspp.[J]. Phytopathology,2006,96(2):190-194.

[8]尹大川，鄧勛，CHET I，等.綠木霉(Trichodermavirens)T43對(duì)四種重要林木病原菌的抑制效果及抑菌機(jī)理[J].生態(tài)學(xué)雜志，2014，33(7)：1911-1919.

[9]于曉丹，張彩霞，林英，等.拮抗木霉菌株T21發(fā)酵條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(2)：215-216.

[10]王暉，孫曉東，呂國(guó)忠.鉤狀木霉Th12菌株液體發(fā)酵條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(13)：7568-7571.

[11]楊立賓，宋瑞清，李沖偉，等.哈茨木霉發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)致病疫霉生理指標(biāo)的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(2)：92-96.

Parameter Screening of Antifungal Activity of Fermentation Liquid ofTrichodermalongibrachiatumT05//

Ji Hailong

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Yi Hongwei(Fruit Tree Institute of Chongqing Agriculture Academy); Chi Yujie(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：120-124.

Trichodermalongibrachiatum; Liquid fermentation; Antifungal activity; Parameter screening;Valsasordida(Cytosporachrysosperma)

吉海龍，男，1991年11月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail: 1156449598@qq.com。

池玉杰，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2015年7月16日。

S718.81

1)國(guó)家林業(yè)局科技成果推廣項(xiàng)目([2004]57號(hào));黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD200901)。

責(zé)任編輯：程紅。