長枝木霉菌株T05抑菌活性與拮抗機制1)

吉海龍　　　　　　　伊洪偉　　　　池玉杰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)　　　(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所)　　　(東北林業(yè)大學(xué))

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長枝木霉菌株T05抑菌活性與拮抗機制1)

吉海龍伊洪偉池玉杰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所)(東北林業(yè)大學(xué))

研究了長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)菌株T05的抑菌活性與拮抗機制，包括菌落的對峙培養(yǎng)試驗，揮發(fā)性物質(zhì)和4種分生孢子提取物的抑菌試驗。對峙培養(yǎng)試驗表明，T05對灰霉病菌(灰葡萄孢(Botrytiscinerea))和楊樹爛皮病菌(污黑腐皮殼(Valsasordida))均表現(xiàn)出很強的抑菌活性，抑菌率分別高達(dá)88.4%和91.9%；其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對B.cinerea有較強的抑菌活性，抑菌率高達(dá)91.9%，而對V.sordida抑菌作用較弱，最高為37.2%；甲醇、乙醇、NaOH、超聲波破碎水抽提4種分生孢子提取物對V.sordida的抑菌試驗表明，NaOH提取物100倍液的抑菌率最高，為76.3%，而甲醇和乙醇提取物的抑菌效果稍弱，超聲波水法的提取物僅對病菌有微弱的抑制作用。

長枝木霉；抑菌活性；拮抗機制；灰霉病菌；楊樹爛皮病菌

We studied the antifungal activity and antagonistic mechanism ofTrichodermalongibrachiatumstrain T05, including confrontation culture test of dual colonies, antifungal test of volatile substance, and antifungal test of four kinds of conidium extracts. By the confrontation test, T05 had a strong antifungal activity to gray mold fungusBotrytiscinereaand poplar canker fungusValsasordida, and the highest inhibition rates were 88.4% and 91.9%, respectively. The volatile substance produced by T05 had a stronger antifungal activity toB.cinereaand the highest inhibition rate was 91.9%, but it had a weaker antifungal activity toV.sordidaand the highest inhibition rate was only 37.2%. We applied three kinds of solvents-methanol, ethanol, NaOH, and ultrasonic-water, to extract the antifungal active substances of conidia, and measured the inhibition effects of different conidial extracts toV.sordida. The extract with NaOH diluting 100 folds had the highest inhibition rate of 76.33%, whereas, the inhibition rate of extracts with methanol and ethanol was little lower than that with NaOH. But the extracts with ultrasonic-water only had weak inhibition effects.

灰霉病由半知菌的灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染引起，是一種世界性重要病害，其特點是寄主廣泛，能夠引起多種植物的壞死。楊樹爛皮病又稱楊樹腐爛病，主要危害楊樹，其危害嚴(yán)重，發(fā)生普遍。該病在新植楊樹中發(fā)生較重，嚴(yán)重降低了造林成活率[1]。以往防治這些重要植物病害的途徑主要以化學(xué)防治為主，但是大量化學(xué)藥劑的使用不僅對環(huán)境造成污染，同時增加了病原菌的抗藥性，因此，研究抗植物病原菌的有益拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物的抑菌機理，是一種重要的生防途徑。木霉菌(Trichodermaspp.)是一種適應(yīng)能力強、抗病廣、拮抗機制多樣化的生防菌[2-3]，在自然界存在豐富，在灰葡萄孢的防治中已經(jīng)取得不錯的效果，報道顯示木霉菌主要作用機制包括營養(yǎng)和空間競爭作用、重寄生作用、抑菌溶菌作用、抗菌作用等[4]。哈茨木霉(T.harzianum)、綠色木霉(T.viride)、黃綠木霉(T.aureoviride)、鉤狀木霉(T.hamatum)等對灰葡萄孢的拮抗作用及抑菌活性顯著，其抑菌率最高可達(dá)98%[5]。目前防治植物病原菌的木霉菌劑多以分生孢子等無性孢子為主要成分，研究這些無性孢子抑菌活性物質(zhì)的提取與抑菌活性，有助于深入了解孢子防病的機制[6]。本試驗研究了長枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T05對灰霉病菌和楊樹爛皮病菌的抑菌活性、揮發(fā)性物質(zhì)和4種分生孢子提取物的抑菌效果，從而進(jìn)一步揭示其抑菌機制，為今后該菌株在灰霉病和楊樹爛皮病等的田間生物防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種來源和培養(yǎng)基

菌種來源：長枝木霉菌株T05，是自我采集、自行分離得到的1株木霉菌株；楊樹爛皮病菌(污黑腐皮殼(Valsasordida)，無性階段金黃殼囊孢(Cytosporachrysosperma))自我采集于哈爾濱市道邊楊樹并分離得到；灰霉病菌(灰葡萄孢)由他人惠贈。以上所有菌種保存于PDA斜面上存放于東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲病理實驗室(4 ℃)。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g煮汁，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 L)；木屑麥麩培養(yǎng)基(木屑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78%，麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，石膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，含水率60%～70%)。

1.2T05與2種病原菌的對峙培養(yǎng)試驗

1.2.1T05與2種病原菌的生長速率測定

將PDA平板上培養(yǎng)5 d的T05及生長良好的B.cinerea和V.sordida菌落邊緣用無菌打孔器打成直徑10 mm的菌餅，分別接入已制備好的PDA平板中央，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，每個處理3個重復(fù)，每隔12 h用十字交叉法測量各菌落直徑，計算其生長速率。生長速率(cm·d-1)=菌落平均直徑/生長時間。

1.2.2T05與2種病原菌平板對峙培養(yǎng)及拮抗系數(shù)測定

用無菌的打孔器分別打取直徑10 mm的T05及2種病原菌菌餅，同時分別對稱接種在制備好的PDA平板兩端，二者之間距離為3 cm，以一端只接2個病原菌菌餅為對照，每個處理和對照均3個重復(fù)。置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，每12 h測量菌落相向半徑并觀察木霉菌對病原菌的覆蓋情況。計算抑菌率并統(tǒng)計拮抗系數(shù)。拮抗系數(shù)等級分級標(biāo)準(zhǔn)參照產(chǎn)祝龍等的分級標(biāo)準(zhǔn)[7]：Ⅰ，木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積=100%；Ⅱ，3/4<木霉菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積<100%；Ⅲ，2/3<木霉菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積<3/4；Ⅳ，1/3<木霉菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積<2/3；Ⅴ，0<木霉菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積<1/3；Ⅵ，病原菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積為100%。抑菌率計算公式為：抑菌率=((對照菌落半徑-病原菌相向半徑)/對照菌落半徑)×100%。

1.2.3T05與2種病原菌菌絲間相互作用的顯微觀察

在無菌條件下，用微量移液槍移取融化狀態(tài)下的PDA培養(yǎng)基少許，均勻涂布在載玻片上，然后用接種環(huán)分別挑取菌株T05和2種病原菌菌塊，距離1.5～2.0 cm。定期在顯微鏡下觀察并拍照，并描述T05與2種病原菌相互作用后菌落的形態(tài)特征。

1.3T05揮發(fā)物對2種病原菌的抑菌效果

采用對扣法。將PDA平板上培養(yǎng)5 d的T05與2種病原菌，用直徑10 mm的打孔器打菌餅，在直徑9 cm培養(yǎng)皿的蓋和底上倒PDA培養(yǎng)基，于中心處分別接種T05與2種病原菌菌餅，以不接T05而只接病原菌為對照，設(shè)3個重復(fù)，用封口膜封口，于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每隔12 h用十字交叉法測量菌落生長直徑。抑菌率計算公式為：抑菌率=((病原菌對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑)×100%。

1.4T05分生孢子提取物對V. sordida的抑制作用

1.4.1菌種培養(yǎng)、擴(kuò)繁與分生孢子的收集

將菌株T05接種到直徑9 cm的PDA平板中心，在25 ℃下培養(yǎng)5～7 d，產(chǎn)孢后用無菌水將分生孢子洗脫下來(菌絲頂端或中間還有厚垣孢子，但被洗脫下來的主要是分生孢子)，調(diào)配成1×107個孢子/mL的懸浮液，在無菌條件下將10 mL該孢子懸浮液接種到裝有木屑麥麩培養(yǎng)基的袋中，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)用以進(jìn)一步擴(kuò)繁菌種，待長滿孢子后用無菌水將孢子洗脫，用兩層紗布除去木屑麥麩，取濾液于5 000 r·min-1下離心30 min，收集沉淀物(孢子)供提取用。

1.4.2分生孢子抑菌物質(zhì)提取

甲醇法：取10 g孢子沉淀物加入150 mL甲醇，充分振蕩混勻，在常溫下浸泡24 h，于3 000 r·min-1下離心15 min，收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀((60±1)℃)水浴減壓濃縮，獲得膏狀提取物記為A。

乙醇法：同甲醇法，只是將甲醇換成乙醇(φ=95%)，且于5 000 r·min-1下離心15 min，減壓濃縮后獲得的膏狀提取物記為B。

堿法：同甲醇法，只是將甲醇換成NaOH(φ=1%)，且于5 000 r·min-1下離心15 min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀((70±1)℃)水浴減壓濃縮，獲得膏狀提取物記為C。

超聲波水法：又根據(jù)超聲波強度、相對離心力大小及不同的提取次數(shù)分為3種(組)處理方式。①將10 g孢子沉淀物加入到150 mL去離子水中充分振蕩混勻，在功率6下用超聲波粉碎儀將孢子細(xì)胞破碎15 min，于10 000 r·min-1下離心30 min，收集上清液按上法減壓濃縮((50±1)℃)，獲得膏狀提取物記為D1。②方法同①，只是在功率4下用超聲波粉碎儀將孢子細(xì)胞破碎5 min，于3 000 r·min-1下離心15 min，分別收集沉淀物和上清液，上清液按上法減壓濃縮后獲得膏狀提取物記為D2。③?、谑占某恋砦铮椒ㄍ?，只收集上清液，按上法減壓濃縮后獲得膏狀提取物記為D3。

1.4.3提取物抑菌活性的測定

用無菌水將上述各種方法的提取物稀釋成2、20倍母液，各取1 mL分別加入至49 mL PDA培養(yǎng)基中搖勻，分倒在3個培養(yǎng)皿中制成平板，使其最終稀釋倍數(shù)為100、1 000倍，以加入1 mL無菌水代替母液作為對照；取培養(yǎng)7 d的V.sordida菌餅(直徑5 mm)1塊接種于平板中央，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。5 d后用十字交叉法測量病菌菌落直徑，按下式計算抑菌率，抑菌率=((對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑)×100%。A1、A2分別代表甲醇法提取物分別稀釋100、1 000倍，其他提取物命名規(guī)則相同。

2　結(jié)果與分析

2.1T05與2種病原菌的對峙培養(yǎng)試驗

2.1.1T05與2種病原菌的生長速率與營養(yǎng)空間占領(lǐng)能力

由表1可知，T05和病原菌單獨培養(yǎng)時，T05的生長速度最快，60 h～3 d后菌絲布滿培養(yǎng)皿，其生長速率在48 h時達(dá)到最大，為3.80 cm·d-1，平均生長速率達(dá)到了2.79 cm·d-1。而B.cinerea和V.sordida的最大生長速率分別為0.90、1.95 cm·d-1，平均生長速率僅為0.68、1.47 cm·d-1，二者的生長速度明顯低于T05。T05的平均生長速率分別是2種病原菌的4倍和2倍，表明在基質(zhì)中營養(yǎng)豐富的初期，T05生命力極強并能夠迅速占領(lǐng)營養(yǎng)空間，顯示了很強的對營養(yǎng)和空間的競爭力，在與其他同類生物對營養(yǎng)基質(zhì)競爭作用中占據(jù)天然優(yōu)勢。

表1　T05和2種病原菌的生長速率

2.1.2T05與2種病原菌平板對峙培養(yǎng)及拮抗系數(shù)

在對峙培養(yǎng)過程中，木霉菌株T05比2種病菌生長都快得多，都是在36 h后2種菌絲開始交接，交接后2種病原菌菌落幾乎停止生長，且初期交接處產(chǎn)生較明顯的抑菌圈；當(dāng)對峙培養(yǎng)48 h時，T05開始逐步圍繞病原菌周圍生長，占領(lǐng)病原菌的生長空間；72～84 h后T05向病原菌菌落中心擴(kuò)展和延伸，使病原菌菌落逐步縮小，逐漸被消解(圖1)。與V.sordida接觸后，T05對病菌顯示了很強的對峙能力和競爭力，先在V.sordida菌絲下緊貼培養(yǎng)基生長，隨后向菌落中心擴(kuò)展和延伸，最后逐漸覆蓋病菌，10 d后將其全部覆蓋，充分表現(xiàn)了對V.sordida的抑制作用。從表2可以看出：T05對2種病原菌的抑菌率和拮抗活性從36 h開始隨時間的推移逐步增加，從60 h開始，其對B.cinerea和V.sordida表現(xiàn)出很強的拮抗活性，對其抑菌率分別高達(dá)66.2%～91.9%和63.2%～88.4%，拮抗系數(shù)都達(dá)到Ⅱ級。

表2　T05對B. cinerea和V. sordida的拮抗活性

a.B.cinerea，CK；b.T05與B.cinerea對峙；c.V.sordida，CK；d.T05與V.sordida。

圖1T05與B.cinerea和V.sordida84 h對峙培養(yǎng)

2.1.3T05與2種病原菌菌絲間相互作用的顯微觀察

通過觀察發(fā)現(xiàn)，T05菌絲以植入、纏繞、覆蓋等方式生長在病原菌上(圖2)；木霉不僅通過迅速生長與病菌競爭營養(yǎng)空間，其菌絲還侵入到病菌菌絲內(nèi)吸取營養(yǎng)，使病菌菌絲生長受到限制。T05與V.sordida對峙一段時間后，鏡檢交界處菌絲可發(fā)現(xiàn)病菌菌絲明顯扭曲、變干、變細(xì)，呈環(huán)狀，表現(xiàn)出衰落、萎縮、退化(圖3)。T05菌絲纏繞在病原菌菌絲上，并在其上產(chǎn)孢。隨著木霉菌覆蓋V.sordida菌落面積的增大，V.sordida菌落內(nèi)觀察到的木霉產(chǎn)孢簇和孢子也越來越多。

1.B. cinerea(物鏡10×)；2和4.T05；3.V. sordida(物鏡20×)；5.T05纏繞B. cinerea(物鏡60×)。

1.V. sordida(物鏡20×)；2.T05；3.T05重寄生B. cinerea(物鏡100×)；4.V. sordida后期呈環(huán)狀生長、表現(xiàn)出衰落(物鏡100×)。

2.1.4T05揮發(fā)物對2種病原菌的抑菌效果

在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，T05產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對B.cinerea表現(xiàn)出較強的抑菌活性，在對扣培養(yǎng)初期B.cinerea開始有一定的生長，隨后逐漸停止生長，后期菌絲變得發(fā)暗、發(fā)黃、干枯(圖4)。由表3可知，T05揮發(fā)性物質(zhì)對B.cinerea的抑菌能力隨時間的推移逐漸增大，在108 h時其抑菌率高達(dá)91.9%，最終B.cinerea死亡。而T05產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)雖然也對V.sordida有一定的抑制能力，但抑菌力相對較弱，培養(yǎng)過程中V.sordida的菌落能持續(xù)生長，直至滿皿，T05揮發(fā)性物質(zhì)對V.sordida的抑菌率在96 h達(dá)到最高，為37.2%。

表3　T05揮發(fā)物對B. cinerea和V. sordida的拮抗活性

a.96 h時T05揮發(fā)物對B. cinerea的抑制情況；b.96 h的B. cinerea，CK；c.96 h時T05揮發(fā)物對V. sordida的抑制情況；d.96 h的V. sordida，CK。

2.2分生孢子提取物對V. sordida的抑制作用

用甲醇、乙醇、NaOH和超聲波水法對菌株T05的分生孢子進(jìn)行提取，得到的抑菌結(jié)果見表4。從表4可以看出，①甲醇、乙醇和NaOH三種不同溶劑的分生孢子提取物對V.sordida都有較強的抑制作用，對母液稀釋100倍的抑菌效果顯著好于稀釋1 000倍的，其中將NaOH提取物稀釋100倍的抑菌率最高為76.33%，而甲醇和乙醇的提取物其抑菌效果稍弱。對3種不同溶劑抑菌作用的方差分析表明，各處理之間在顯著性水平α=0.05時差異顯著(表5)。②第2、3組超聲波水法的分生孢子提取物D2和D3僅對V.sordida有較弱的抑制作用，其中第3組稀釋100倍的D31抑菌率最高，為17.92%，而第2組中稀釋1 000倍比稀釋100倍的抑制作用更強。但是反常的是，第1組提取物D1不僅不能抑制V.sordida的生長，反而能促進(jìn)其生長，其中微量的提取物(稀釋1 000倍)比稀釋100倍的促生作用更強。因此，單獨對超聲波水法的3組處理方式進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明這3組處理方式在顯著性水平α=0.05時差異不顯著(表5)。

表4不同溶劑與超聲波水法分生孢子提取物對V.sordida的抑菌率

粗提物稀釋倍數(shù)菌落直徑/cm處理對照抑菌率/%A1 1002.509.0072.22acA210008.009.0011.11bB11002.709.0070.00aB210007.629.0015.33bC11002.139.0076.33cC210008.609.004.44dD111005.935.30-11.89aD1210006.975.30-31.51bD211004.975.306.23acD2210004.675.3011.89cD311004.355.3017.92cD3210004.705.3011.32c

注：抑菌率數(shù)據(jù)后，同列不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著(Duncan氏新復(fù)極差檢驗，DMRT)。

表5　不同溶劑與超聲波水法分生孢子提取物對V. sordida菌落生長抑制方差分析結(jié)果

3　結(jié)論與討論

由長枝木霉菌株T05的生長速率和與2種病原菌的對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在基質(zhì)中含有豐富營養(yǎng)的初期，T05生長快，最大生長速率為3.80 cm·d-1，其平均生長速率分別是B.cinerea和V.sordida的4倍和2倍，能夠迅速生長并占領(lǐng)營養(yǎng)空間，顯示了對營養(yǎng)和空間具有很強的競爭能力，在與2種病原菌對營養(yǎng)空間的占領(lǐng)中占據(jù)天然優(yōu)勢；在與病菌對峙期間，T05也表現(xiàn)出極強的生命力、對峙能力和競爭力，后期能向病原菌菌落中心擴(kuò)展和延伸。顯微鏡觀察交界處菌絲，發(fā)現(xiàn)T05菌絲緊貼病菌菌絲生長或者纏繞病菌菌絲，后期覆蓋或深入病原菌菌落內(nèi)部生長，在菌絲上生長并產(chǎn)孢，使病菌菌絲被纏繞的部位出現(xiàn)明顯萎縮、退化，最終使菌絲斷裂、解體直至死亡[8-9]，該結(jié)果與Sivan et al.[10]的研究結(jié)果類似。對峙期間，菌株T05對2種病菌均表現(xiàn)出很強的拮抗活性，抑菌率分別高達(dá)66.2%～91.9%和63.2%～88.4%，拮抗系數(shù)均達(dá)到Ⅱ級。陳利軍等[11]指出木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌也有一定的抑菌作用，對番茄灰霉病菌B.cinerea的抑制作用達(dá)到61.78%，其揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分為6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6PP)，本試驗也研究了菌株T05的揮發(fā)性物質(zhì)對2種病原菌的抑菌效果，其對V.sordida的抑制效果相對較弱，推斷T05對V.sordida的抑制作用可能主要來源于營養(yǎng)與空間的競爭及非揮發(fā)性成分，但其揮發(fā)性物質(zhì)對B.cinerea有明顯地抑制作用(圖4)。菌株T05對病原菌的總體拮抗機制和抑菌活性來源于菌絲和分生孢子等菌體自身的抑菌作用、揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌作用、次生代謝產(chǎn)物的抑菌作用等。

木霉分生孢子對植物病原真菌和細(xì)菌的生長也有很強的抑制作用，為找出提取分生孢子中抗菌活性物質(zhì)的適宜溶劑與方法，以便為進(jìn)一步開發(fā)抗植物病害的木霉生物殺菌劑奠定基礎(chǔ)，本試驗采用3種溶劑和不同強度、不同相對離心力及不同提取次數(shù)的超聲波破碎法對長枝木霉菌株T05的分生孢子進(jìn)行了抗菌物質(zhì)提取，用各提取物對V.sordida進(jìn)行的抑菌試驗表明，甲醇、乙醇和NaOH三種不同溶劑的分生孢子提取物稀釋100倍后對V.sordida都有較強的抑制作用，其中NaOH提取物的抑菌率最高，為76.33%，而分生孢子經(jīng)超聲波破碎后的水提取物不能得到有效地抑制V.sordida生長的物質(zhì)。超聲波水法的分生孢子提取物的抑菌效果不好，一方面有可能是這些方法不能夠有效地提取到抑菌物質(zhì)，或者是這些方法破壞了分生孢子提取物的活性。宋桂經(jīng)等[12]用醇法和堿法將分生孢子中具有抑菌作用的物質(zhì)分離提取，這些提取物的抑菌作用仍很強，本試驗也表明堿法提取T05的分生孢子也是一種較好的提取方式，這為制備木霉分生孢子制劑提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

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Antifungal Activity and Antagonistic Mechanism ofTrichodermalongibrachiatumT05//

Ji Hailong

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Yi Hongwei(Fruit Tree Institute of Chongqing Agriculture Academy); Chi Yujie(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：114-119.

Trichodermalongibrachiatum; Antifungal activity; Antagonistic mechanism;Botrytiscinerea;Valsasordida(Cytosporachrysosperma)

吉海龍，男，1991年11月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:1156449598@qq.com。

池玉杰，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:chiyujienefu@126.com。

2015年7月16日。

S718.81

責(zé)任編輯：程紅。