抗毒合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂*

杜向紅，杜云鋒，張　偉，李國峰，林帥軍，劉　偉

(1.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫(yī)學(xué)院分析測試中心，河南 鄭州450046)

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抗毒合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂*

杜向紅1，杜云鋒1，張偉1，李國峰1，林帥軍2，劉偉2

(1.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫(yī)學(xué)院分析測試中心，河南 鄭州450046)

目的:研究抗毒合劑的質(zhì)量控制方法。方法:采用薄層色譜法對抗毒合劑中藥材進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定抗毒合劑中綠原酸、木犀草苷的含量。結(jié)果:抗毒合劑中供試品薄層色譜中，在與對照品相應(yīng)位置上顯相同斑點；綠原酸、木犀草苷對照品分別在0.08～1.00 μg(r=0.999 9)、0.077 8～0.972 5 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為98.93%、97.25%。結(jié)論:該質(zhì)量控制方法簡便準(zhǔn)確、靈敏度高，可以用于抗毒合劑的質(zhì)量控制。

抗毒合劑;綠原酸;木犀草苷;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

抗毒合劑為河南省人民醫(yī)院經(jīng)驗配方，具有清熱解毒的作用,臨床主要用于治療上呼吸道感染、病毒性肺炎、流行性腮腺炎等?？苟竞蟿┲饕纱笄嗳~、板藍(lán)根、金銀花、連翹、柴胡、葛根組成，采用水提醇沉法制成。其中金銀花除有清熱解毒之功效外，還有宣散風(fēng)熱、清解血毒之功；連翹有散結(jié)消腫之功；此兩藥共為君藥。大青葉解毒、涼血、止血，板藍(lán)根涼血消斑、利咽止痛，柴胡解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣，三者均能輔助君藥。本研究對抗毒合劑從定性鑒別、定量分析兩方面來建立抗毒合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而更好地控制合劑的質(zhì)量。

1　藥品、試劑與儀器

抗毒合劑(批號20121101，20121201，20130101)和陰性樣品均由河南省人民醫(yī)院提供。綠原酸(批號091024)、連翹苷(批號110821)、葛根素(批號111224)、靛藍(lán)(批號120325)、靛玉紅(批號110915)，均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；乙腈為色譜純；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司產(chǎn)品； AE240電子分析天平，瑞士METTLER公司產(chǎn)品。

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1金銀花的鑒別

取本品5 mL，置蒸發(fā)皿中，80 ℃蒸干，加甲醇5 mL 使溶解，濾過，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。同法制備缺金銀花陰性對照溶液。另按《中國藥典》2010版一部中金銀花項下方法制備金銀花對照藥材。再取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1∶15∶1∶1∶2)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下觀察。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照無干擾。見圖1。

1～3.供試品；4.對照藥材；5.對照品；6.陰性對照品

2.1.2連翹的鑒別

取本品20 mL，用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，濾過，作為供試品溶液。同法制得缺連翹陰性對照溶液。另取連翹藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min后濾過，濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。再取連翹苷作對照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸(17∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茴香醛硫酸溶液，在100 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材和對照品相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照則無干擾。見圖2。

1～3.供試品；4.對照藥材；5.對照品； 6.陰性對照品

2.1.3葛根的鑒別

取本品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并萃取液，蒸干，加甲醇1 mL溶解，濾過，作為供試品溶液。同法制得缺葛根陰性對照溶液。另取葛根藥材2 g，加甲醇30 mL，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，濾過，濃縮至2 mL，作為對照品藥材。再取葛根素對照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述4種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(16∶6∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下觀察。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材和對照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。見圖3。

1～3.供試品；4.對照品；5.對照藥材；6.陰性對照品

2.1.4大青葉的鑒別[1]

取本品15 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL，溶解，濾過，作為供試品溶液。同法制得缺大青葉陰性對照溶液。另取大青葉藥材1 g，取甲醇20 mL，超聲(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，濾過蒸干，用三氯甲烷定容至1 mL，作為對照品藥材。再取靛藍(lán)、靛玉紅對照品適量，分別加三氯甲烷制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板，以氯仿-丙酮(15∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材和對照品相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖4。

1～3.供試品；4.對照藥材；5.靛玉紅對照品；6.靛藍(lán)對照品；7.陰性對照品

2.2綠原酸、木犀草苷的含量測定

按照參考文獻(xiàn)[2-5]。

2.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱。流動相為乙腈(A)-1 mL/L磷酸水溶液(B)梯度洗脫：0-21 min，10%→18% A；21-33 min，18%→23% A。檢測波長：0-21 min，327 nm；21-33 min，360 nm。柱溫25 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品和木犀草苷對照品適量，置于100 mL棕色容量瓶中，加500 mL/L甲醇制成每毫升含綠原酸40 μg、木犀草苷38.9 μg的混合溶液。

2.2.3供試品溶液的制備

精密量取抗毒合劑1 mL，置50 mL的容量瓶中，用500 mL/L甲醇溶液定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.4陰性溶液的制備

按處方配比取除金銀花以外的其他藥材,照抗毒合劑的制法制成缺金銀花陰性合劑, 再按供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液。

2.2.5專屬性試驗

精密吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照品溶液各10 μL,注入液相色譜儀中。結(jié)果：供試品色譜中，在與綠原酸和木犀草苷對照品相對應(yīng)的保留時間檢出相對應(yīng)的色譜峰，缺金銀花陰性對照品在綠原酸和木犀草苷相應(yīng)的保留時間無色譜峰。見圖5。

A.對照品；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液

2.2.6線性關(guān)系考察

精密量取對照品溶液2,5,10,15,20,25 μL，按2.2.1項下色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：綠原酸Y=11.263X+1.925 9(r=0.999 9)；木犀草苷Y=0.831 3X+0.107 6(r=0.999 9)。結(jié)果表明：綠原酸在0.08～1.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；木犀草苷在0.077 8～0.972 5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，以綠原酸和木犀草苷的峰面積計算，RSD值分別為0.20%、0.45%。結(jié)果表明：儀器精密度良好。

2.2.8重復(fù)性試驗

取同一批號的供試品按2.2.3項下方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，進(jìn)樣測定。以綠原酸和木犀草苷的峰面積計算，RSD值分別為0.13%、0.17% 。結(jié)果表明:方法重現(xiàn)性良好。

2.2.9穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于配制后 0,3,6,9,12,24 h，精密吸取 10 μL測定。結(jié)果：綠原酸和木犀草苷的峰面積RSD值分別為2.39%、2.36%。結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10加樣回收率試驗

取批號20130101已知含量(綠原酸1.307 8 g/L、木犀草苷0.905 2 g/L) 的樣品0.5 mL，精密稱取6份，分別加入含有綠原酸0.50 g/L、木犀草苷0.49 g/L 的混合對照品溶液1 mL，以下按2.2.3項下方法制備加樣回收供試品溶液。精密吸取加樣回收供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定結(jié)果見表1。

表1　回收率試驗結(jié)果　　n=6

2.2.11含量測定

取3批樣品，按2.2.3項下方法制備供試樣品溶液，按規(guī)定的色譜條件測定并計算含量。結(jié)果見表2。

表2　含量測定結(jié)果

3　討　論

在金銀花、連翹、大青葉的薄層色譜鑒別中，筆者先采用《中國藥典》2010版一部中的單味藥材項下鑒別方法，但出現(xiàn)斑點間相互干擾，均未達(dá)到良好分離效果，重現(xiàn)性不好，故未錄入正文。用優(yōu)化后的方法對處方中金銀花、葛根、連翹和大青葉4味藥進(jìn)行定性鑒別，操作簡便、快速，重現(xiàn)性好。

本實驗曾用甲醇-水、甲醇-1 mL/L磷酸水溶液、乙腈-水和乙腈-1 mL/L磷酸水溶液為流動相，經(jīng)過實驗摸索，最終確定采用乙腈-1 mL/L磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，得到的色譜峰分離度好，靈敏度高，且保留時間適宜。

由于綠原酸與木犀草苷采用統(tǒng)一洗脫梯度測定，分離度好，峰形對稱且操作簡單，不相互干擾，一次本實驗采用轉(zhuǎn)換波長法同時測定兩個成分。

上述實驗結(jié)果表明采用的方法穩(wěn)定易行、重現(xiàn)性好，可用于抗毒合計質(zhì)量評價。

[1]陳海宏，孫建寧.大青葉的研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2004,13(8)：79-80.

[2]劉宜生.抗毒合計急性毒理實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2007, 8(2)：43.

[3]白雪梅，吳建翎，羅強.金銀花HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2007, 23(4)：299.

[4]李翔，劉貴陽，馬建麗.HPLC測定柴銀口服液中葛根素的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013, 33(18)：1548-1551.

[5]高淑娟，戴錫珍，姚華民.幾種清熱解毒中藥抗內(nèi)毒素作用的比較實驗[J].天津中醫(yī)，1998，27(3)：42.

(編輯陶珠)

2016-01-15；修回日期：2016-04-27

1001-6910(2016)07-0068-04

R284.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.07.32

杜向紅(1953-)，女(漢族)，河南鄭州人，主任藥師，主要從事中藥研究。

劉偉，教授，dyf323@163.com

河南省科技廳重點科技攻關(guān)項目(122102310069)

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