小兒止咳顆粒對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的免疫調(diào)控作用研究

劉映玲　鄭艷萍　黃慧芳　鄭　敏　許雙虹　深圳市中醫(yī)院　518033　廣東深圳市福華路1號(hào)

·實(shí)驗(yàn)研究·

小兒止咳顆粒對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥的免疫調(diào)控作用研究

劉映玲鄭艷萍黃慧芳鄭敏許雙虹深圳市中醫(yī)院518033廣東深圳市福華路1號(hào)

摘要目的：觀察小兒止咳顆粒對(duì)哮喘模型大鼠血清與肺泡灌洗液中白三烯C4（LTC-4）、干擾素-γ （IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）的影響，從而探討其治療咳嗽變異性哮喘的作用機(jī)制。方法：36只SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，模型組，地塞米松組，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組，每組6只。除空白對(duì)照組外，余組均采用雞卵白蛋白（OVA）致敏并反復(fù)多次激發(fā)的方法建立大鼠哮喘模型。從腹腔注射OVA氫氧化鋁懸液致敏第15天起行霧化激發(fā)，在霧化激發(fā)前模型組以10 ml/kg生理鹽水灌胃，地塞米松組以0.3 mg/kg地塞米松溶液灌胃，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組分別以12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg小兒止咳顆粒溶液灌胃?？瞻讓?duì)照組以10 ml/kg生理鹽水灌胃。治療結(jié)束后收集血清及肺泡灌洗液（BALF），運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)各組血清及肺泡灌洗液中LTC-4以及IFN-γ、IL-4、IL-5的含量。結(jié)果：①與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體重明顯下降（P＜0.01）；而地塞米松組及小兒止咳顆粒各劑量組大鼠體重均較模型組有顯著提升（P＜0.01）。②與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠中血清LTC-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低（均P＜0.01），而血清IL-4與IL-5無(wú)明顯變化；地塞米松與小兒止咳顆粒各劑量均可降低模型大鼠血清中LTC-4水平（P＜0.01），高劑量組改善程度優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）；高劑量組可明顯提升模型大鼠血清中IFN-γ水平，與模型組、地塞米松組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。③與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠BALF中LTC-4、IL-4與IL-5水平顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平顯著下降（P＜0.01）；地塞米松與小兒止咳顆粒各劑量均可下調(diào)LTC-4、IL-4水平（P＜0.05或P＜0.01），小兒止咳顆粒各劑量組均可上調(diào)模型大鼠BALF中的INF-γ水平（P＜0.01）；地塞米松與小兒止咳顆粒中、高劑量可下調(diào)BALF中IL-5水平（P＜0.01）。結(jié)論：小兒止咳顆粒治療咳嗽變異性哮喘可能是通過(guò)下調(diào)炎癥介質(zhì)表達(dá)，改善免疫紊亂，從而減輕氣道炎癥而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞哮喘大鼠；氣道炎癥；免疫調(diào)控；小兒止咳顆粒；中醫(yī)藥療法

咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）為學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，又稱咳嗽型哮喘，是指以慢性咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的一種特殊類型支氣管哮喘，其主要發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞免疫失衡、氣道慢性炎癥形成密切相關(guān)［1-2］。小兒止咳顆粒是我院兒科治療小兒咳嗽變異性哮喘的常用中藥制劑，臨床療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察小兒止咳顆粒對(duì)哮喘模型大鼠血清與肺泡灌洗液中炎癥介質(zhì)白三烯C4（LTC-4）以及細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）的影響，來(lái)探討小兒止咳顆粒對(duì)咳嗽變異性哮喘氣道炎癥的免疫調(diào)控作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物健康SD雌性大鼠36只，體重180～200 g，SPF級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：0074582。

1.2藥物與試劑小兒止咳顆粒（百部、紫菀、款冬花、桔梗、荊芥、牛蒡子、枳殼、陳皮、茯苓、甘草等），由深圳市中醫(yī)院制劑室制備（粵藥制字011220），每包10 g。地塞米松溶液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：100016-201216。雞卵白蛋白（OVA）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)：A5503。ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，LTC-4批號(hào)：CSBE08534r；IFN-γ批號(hào)：CSB-E04579r；IL-4批號(hào)：CSB-E04635r；IL-5批號(hào)：CSB-E07435r。

1.3動(dòng)物模型制備36只大鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，模型組，地塞米松組，小兒止咳顆粒低、中、高劑量組，每組6只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后參考Palmans等［3］方法，采用OVA致敏并反復(fù)多次激發(fā)的方法建立大鼠哮喘模型。除空白對(duì)照組外，其余造模大鼠分別于第1天、第8天腹腔注射新鮮配制的OVA氫氧化鋁懸液，自第15天起將大鼠置于半封閉的有機(jī)玻璃箱內(nèi)進(jìn)行超聲霧化以激發(fā)哮喘，每次吸入1%OVA混懸液，霧化時(shí)間為30 min。哮喘激發(fā)每日1次，連續(xù)4周。以大鼠腹肌明顯收縮，呼吸加深加快，急促、咳嗽，嚴(yán)重者呈深、慢呼吸或呼吸節(jié)律不整，行動(dòng)遲滯或俯伏不動(dòng)等表現(xiàn)為激發(fā)成功，提示造模成功［4］。空白對(duì)照組以等量生理鹽水代替OVA氫氧化鋁溶液腹腔注射及OVA溶液霧化吸入。

基金項(xiàng)目：深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)項(xiàng)目（編號(hào)：JCYJ20140408153413103）

1.4給藥方法從腹腔注射OVA氫氧化鋁懸液致敏第15天，霧化激發(fā)開(kāi)始前2小時(shí)給予各組干預(yù)措施。小兒止咳顆粒以生理鹽水溶解，高、中、低劑量組分別以50 g/kg、25 g/kg、12.5 g/kg（以原藥計(jì)算）灌胃，灌胃容量為10 ml/kg；地塞米松組以0.3 mg/kg灌胃，灌胃容量為10 ml/kg；空白對(duì)照組和模型組以10 ml/kg生理鹽水灌胃。每天1次，共給藥40 d。

1.5標(biāo)本采集與處理最后一次給藥2 h后，摘除眼球取血，離心取上清液。取血完畢后大鼠行氣管插管至右肺并結(jié)扎，用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次3 ml，反復(fù)灌洗3次，回收率均大于50%。采用ELISA方法，按試劑盒操作，測(cè)定血清及肺泡灌洗液中LTC-4、IFN-γ、IL-4、IL-5水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)檢測(cè)重復(fù)3次取均值，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水平α=0.05。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1大鼠的一般情況空白對(duì)照組大鼠表現(xiàn)活潑好動(dòng)，飲食如常，動(dòng)作靈敏，毛色光滑，呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠造模后開(kāi)始出現(xiàn)躁動(dòng)不安、搔抓、舔肢體、打噴嚏等癥狀，繼而出現(xiàn)不同程度的呼吸困難癥狀，如張口呼吸頻率及幅度增加，嚴(yán)重者紫紺，煩躁，同時(shí)毛色晦暗無(wú)光澤，甚至脫落，提示大鼠哮喘模型制備成功。與模型組比較，小兒止咳顆粒高、中劑量組大鼠癥狀明顯減輕，無(wú)呼吸急促，無(wú)紫紺，大鼠毛色光澤較好，精神也較好，與地塞米松組癥狀緩解相當(dāng)。小兒止咳顆粒的低劑量組大鼠與哮喘模型組相比較，癥狀稍有減輕。提示地塞米松與小兒止咳顆粒對(duì)哮喘模型大鼠的癥狀均有改善作用。

2.2大鼠的體重變化見(jiàn)表1。

表1干預(yù)前后各組大鼠體重變化情況　?。╣±s）

表1干預(yù)前后各組大鼠體重變化情況　?。╣±s）

注：與空白對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與地塞米松組比較，③P＜0.01

組別　　干預(yù)前體重　　干預(yù)后體重　　干預(yù)前后體重差n　　劑量（g/kg）空白對(duì)照組　189.5±6.66　289.7±5.09　100.2±5.42模型組　188.8±5.91　248.7±4.76　59.8±6.31①地塞米松組　188.0±5.18　268.0±7.54　80.0±5.22②小兒止咳顆粒低劑量組　188.3±6.80　277.2±5.19　88.8±4.26②③小兒止咳顆粒中劑量組　188.8±6.43　283.8±10.93　95.0±4.82②③66666 --5 0 0.003 12.5 25小兒止咳顆粒高劑量組　189.8±4.36　288.0±8.15　98.2±6.21②③6

表1顯示，40d后模型組大鼠體重明顯下降，顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01）。而地塞米松組以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量組大鼠干預(yù)后體重增加值均明顯高于模型組（均P＜0.01）；小兒止咳顆粒低、中、高劑量組大鼠體重增長(zhǎng)均優(yōu)于地塞米松組（均P＜0.01）。提示了哮喘可導(dǎo)致大鼠體重增加緩慢，而予地塞米松與小兒止咳顆粒治療后可改善這種狀況。

2.3小兒止咳顆粒對(duì)哮喘大鼠血清細(xì)胞因子的影響見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠血清中細(xì)胞因子的水平比較　?。╬g/ml，±s）

表2　各組大鼠血清中細(xì)胞因子的水平比較　?。╬g/ml，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與地塞米松組比較，③P＜0.01

組別　LTC-4　IFN-γ　IL-4　IL-5空白對(duì)照組　1264.32±230.36　182.33±6.60　89.53±7.47　67.70±2.60模型組　2103.79±123.26①　65.05±8.85①　84.48±6.02　73.30±1.96地塞米松組　1632.11±83.54②　59.67±4.29　77.08±6.78　68.40±1.11小兒止咳顆粒低劑量組　1784.48±209.29②　65.78±11.30　79.75±7.13　72.80±3.45小兒止咳顆粒中劑量組　1878.77±97.23②　70.63±10.82　76.24±6.96　68.43±1.94小兒止咳顆粒高劑量組　1086.28±23.91②③　151.83±11.40②③　78.65±6.81　67.53±2.80 n　　劑量（g/kg）6-6 -6　0.003 6　12.5 6　25 6　50

表2顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的血清LTC-4水平顯著升高（P＜0.01）；而經(jīng)地塞米松以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量干預(yù)后，模型大鼠血清LTC-4水平均明顯下降（P＜0.01），其中小兒止咳顆粒高劑量組的下降水平最顯著，與地塞米松組比較有顯著性差異（P＜0.01），接近空白對(duì)照組水平（P＞0.05）。造模后模型組的血清IFN-γ水平較空白對(duì)照組急劇下降（P＜0.01）；地塞米松及小兒止咳顆粒中、低劑量干預(yù)對(duì)模型大鼠血清IFN-γ水平無(wú)明顯影響（P＞ 0.05）；而小兒止咳顆粒高劑量組的血清IFN-γ水平顯著高于模型組和地塞米松組（均P＜0.01）。各組間血清IL-4、IL-5水平比較無(wú)明顯差異（均P＞0.05）。提示哮喘模型大鼠的血清LTC-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低，而血清IL-4與IL-5水平無(wú)明顯變化；地塞米松干預(yù)可下調(diào)哮喘大鼠的血清LTC-4水平，但對(duì)血清IFN-γ水平無(wú)作用；而小兒止咳顆粒既可下調(diào)血清LTC-4水平，又可提升血清IFN-γ水平，作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)趨勢(shì)。值得注意的是，模型組哮喘大鼠血清IL-4、IL-5水平與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，推測(cè)這可能由于哮喘大鼠模型是用OVA先腹腔致敏，然后霧化吸入卵蛋白激發(fā)，其激發(fā)的免疫反應(yīng)主要發(fā)生在肺組織局部，而細(xì)胞因子主要由激活的免疫細(xì)胞所分泌，在肺外組織炎癥可能并不突出，故而血清中的細(xì)胞因子無(wú)顯著變化。這也說(shuō)明了動(dòng)物哮喘模型與人類哮喘疾病仍存在較大區(qū)別。

2.4小兒止咳顆粒對(duì)哮喘大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的影響見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠BALF中細(xì)胞因子的水平比較?。╬g/ml±s）

表3　各組大鼠BALF中細(xì)胞因子的水平比較　（pg/ml±s）

注：與空白對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與地塞米松組比較，④P＜0.01

組別　LTC-4　IFN-γ　IL-4　IL-5空白對(duì)照組　381.22±65.97　34.19±5.00　23.64±1.86　68.49±4.46模型組　970.45±10.86①　18.19±4.34①　46.62±6.35①　170.45±10.86①地塞米松組　485.08±58.22③　19.48±0.73　38.98±0.45②　115.08±3.54③小兒止咳顆粒低劑量組　856.89±24.14③　33.48±2.62③④　33.32±2.63③④　176.33±6.00小兒止咳顆粒中劑量組　713.00±80.45③　36.74±1.15③④　30.83±0.78③④　132.23±10.01③小兒止咳顆粒高劑量組　349.27±74.52③④　42.57±3.74③④　27.80±2.12③④　89.63±6.01③④n　　劑量（g/kg）6-6-6　0.003 6　12.5 6　25 6　50

表3顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠BALF中LTC-4水平明顯升高（P＜0.01）；而經(jīng)地塞米松以及小兒止咳顆粒低、中、高劑量干預(yù)后則顯著降低（P＜0.01），LTC-4下降幅度與小兒止咳顆粒的劑量呈正相關(guān)趨勢(shì)，劑量越大LTC-4水平下降越顯著，其中高劑量組與地塞米松組比較有顯著性差異（P＜0.01），并接近空白對(duì)照組水平（P＞0.05）。模型組BALF中IFN-γ水平較空白對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），但地塞米松對(duì)模型大鼠BALF中IFN-γ水平無(wú)改善作用（P＞0.05）；小兒止咳顆粒低、中、高各劑量干預(yù)均可明顯升高模型大鼠BALF中的IFN-γ水平（P＜0.01），均顯著優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01），并呈劑量依賴趨勢(shì)。模型組大鼠BALF中IL-4水平較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)地塞米松和小兒止咳顆粒各劑量干預(yù)后則有顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），IL-4下降幅度與劑量呈正相關(guān)趨勢(shì)，低、中、高各劑量組均優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）。在IL-5水平方面，模型組IL-5水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），經(jīng)地塞米松和小兒止咳顆粒中、高劑量組干預(yù)后下降明顯（均P＜0.01）；其中高劑量組優(yōu)于地塞米松組（P＜0.01）。提示哮喘模型大鼠的BALF中LTC-4、IL-4與 IL-5水平顯著升高，而IFN-γ水平顯著降低；地塞米松干預(yù)可下調(diào)哮喘大鼠 BALF中的LTC-4、IL-4與IL-5水平，但對(duì)IFN-γ無(wú)作用；而小兒止咳顆粒既可下調(diào)哮喘大鼠BALF中的LTC-4、IL-4與IL-5水平，又可提升IFN-γ水平，作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)趨勢(shì)。

3　討論

CVA一般情況下無(wú)支氣管哮喘常見(jiàn)的喘息、氣促等呼吸困難癥狀，而多以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的咳嗽為主要表現(xiàn)，但CVA可發(fā)展為典型哮喘。諸多研究證實(shí)了CVA與支氣管哮喘有類似的病理生理特征［1-2，5］。支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥［6］。白三烯已經(jīng)被證實(shí)是參與哮喘發(fā)病最重要的炎癥介質(zhì)之一，能直接引起支氣管平滑肌強(qiáng)烈收縮，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在氣道大量聚集［7］。而白三烯C4（LTC-4）是體內(nèi)白三烯的主要組成部分，參與哮喘發(fā)病過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)［8］。因此，通過(guò)LTC-4可推斷氣道炎癥情況。Th1/Th2失衡是支氣管哮喘的重要發(fā)病機(jī)制［5，9］。Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)，通過(guò)釋放IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF-β等細(xì)胞因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抑制哮喘病理過(guò)程；Th2主要參與B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生與速發(fā)型超敏反應(yīng)，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13和GM-CSF等細(xì)胞因子，影響T細(xì)胞分化，參與哮喘的氣道炎癥的形成［10］。由此可見(jiàn)，Th1占優(yōu)勢(shì)時(shí)，炎癥局限，預(yù)后良好；Th2占優(yōu)勢(shì)時(shí)，炎癥擴(kuò)散，預(yù)后不良［11］。在哮喘發(fā)病時(shí)，Th1細(xì)胞因子免疫反應(yīng)減弱，Th2細(xì)胞因子免疫反應(yīng)則異常增強(qiáng)。

CVA可歸屬于中醫(yī)“咳嗽”范疇，其咳嗽癥狀呈陣發(fā)性、忽發(fā)忽止、反復(fù)性發(fā)作、受風(fēng)加劇、多伴咽癢等特點(diǎn)?？紤]到患兒稚陰稚陽(yáng)之體，我們主張CVA的用藥宜溫潤(rùn)平和，重在理肺止咳，復(fù)其肅降，略兼疏散風(fēng)邪，因而采用小兒止咳顆粒治療。方中以百部、紫菀為君，兩藥均溫潤(rùn)，不寒不熱，藥性溫和，符合小兒稚陰稚陽(yáng)的體質(zhì)特點(diǎn)，有較好的止咳化痰功效，為常用止咳藥物；款冬花化痰降氣止咳，桔梗宣肺利咽化痰，二者一宣一降，以正肺氣，增強(qiáng)化痰止咳之功，為臣藥；荊芥疏風(fēng)解表利咽，牛蒡子疏風(fēng)宣肺利咽，枳殼降氣，陳皮理氣化痰，茯苓滲濕健脾以絕痰之化源，均為佐藥；甘草緩急和中，調(diào)和諸藥，又合桔梗利咽，為佐使之用。全方共奏化痰止咳、疏風(fēng)利咽之效。經(jīng)我院臨床應(yīng)用多年，療效顯著。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示：小兒止咳顆?？娠@著下調(diào)哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液（BALF）中LTC-4的表達(dá)，從而直接減輕氣道炎癥；顯著上調(diào)血清和肺泡灌洗液（BALF）中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)BALF中的Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-5的表達(dá)，從而改善Th1/Th2失衡狀態(tài)；其作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)趨勢(shì)。提示小兒止咳顆粒治療咳嗽變異性哮喘的作用可能是通過(guò)下調(diào)炎癥介質(zhì)表達(dá)，改善免疫紊亂，從而減輕氣道炎癥等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

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（2016-03-03收稿/編輯陳明偉）

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-0719（2016）03-0067-04