龍脷葉中氨基酸的成分分析

譚建寧　馬雯芳　李耀華　廣西中醫(yī)藥大學　530001　南寧市明秀東路179號

龍脷葉中氨基酸的成分分析

譚建寧馬雯芳李耀華廣西中醫(yī)藥大學530001南寧市明秀東路179號

摘要目的：對龍脷葉中氨基酸成分進行分析。方法：采用TLC法對龍脷葉中L-谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸進行薄層色譜分析；采用日立L-8800型全自動氨基酸分析儀分析龍脷葉中18種氨基酸。結果：龍脷葉中游離氨基酸薄層鑒別分離度好，專屬性強；龍脷葉中氨基酸總量達16.32%，其中谷氨酸含量最高（2.31%），蛋氨酸含量最低（0.06%）。結論：本法簡便可行，結果準確，重復性好，可用于龍脷葉的質量研究。

關鍵詞龍脷葉；氨基酸；TLC；含量測定

龍脷葉Sauropus spatuli folius Beille為大戟科植物，主要分布在廣西、廣東、福建等地，具有清肺熱、抗菌、止咳作用，壯族民間常用于治療急性支氣管炎、上呼吸道感染、支氣管哮喘，是臨床常用的壯藥［1］。龍脷葉含有皂苷、甾體類、氨基酸和脂肪酸等成分［2-3］。氨基酸是一種重要生物活性物質［4］，其中組氨酸、蘇氨酸的缺乏可使小鼠對傷寒沙門氏菌的易感性增高，賴氨酸缺乏可使小鼠炭疽芽胞桿菌的抵抗力下降，而皮下注射半胱氨酸可增強動物的某些非特異性免疫功能及增強對可產氣莢膜梭狀芽胞桿菌、葡萄糖球菌毒素的抵抗力［5］。氨基酸是龍脷葉的抗菌活性成分，目前對龍脷葉中氨基酸成分的研究尚未見報道。本實驗對龍脷葉中L-谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸進行薄層色譜分析，并采用全自動氨基酸分析儀測定龍脷葉中氨基酸的含量，旨為進一步研究龍脷葉的活性成分提供實驗基礎。

1　實驗材料

1.1儀器L-8800型全自動氨基酸分析儀（日立）；BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司）；CDUPT型超純水機（成都超純科技有限公司）；KQ5200B型超聲提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；FW135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2試藥L-谷氨酸對照品（批號：111576-200201，供鑒定用）；精氨酸對照品 （批號：140685-201305，供含量測定用）；脯氨酸對照品（批號：111659-200301，供鑒定用）；亮氨酸對照品（批號：110876-200204，供鑒定用）；龍脷葉對照藥材（批號：121623-201001，供鑒定用）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、正丁醇、正己烷及其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3藥材龍脷葉于2014年10月購自玉林藥材批發(fā)市場，經廣西中醫(yī)藥研究院嚴克儉助理研究員鑒定為大戟科植物龍脷葉 Sauropus spatuli folius Beille的干燥葉。5批龍脷葉產地分別為廣西靖西（批號：141001、141002），玉林（批號：141004）和梧州（批號：141003、141005）。

2　實驗方法

2.1對照品溶液的制備分別取L-谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、亮氨酸對照品適量，精密稱定，加水制成每1 ml含0.50 mg的溶液，作為龍脷葉薄層色譜對照品溶液。再分別取以上各氨基酸對照品0.03～0.09 g，精密稱定，置同一個500 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。臨用時精密吸取2.0 ml 置10 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。作為氨基酸成分分析的對照品溶液。

2.2對照藥材溶液的制備取龍脷葉對照藥材1.0 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，加入適量水，超聲提取40 min，濾過，濾液蒸干，加水定容至5 ml，作為龍脷葉對照藥材溶液。

2.3供試品溶液的制備取龍脷葉粉末（過20目篩）1.0 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，以水為溶劑，超聲提取40 min，濾過，濾液蒸干，加水定容至5 ml，作為龍脷葉薄層色譜供試品溶液。另取龍脷葉藥材適量，于65℃干燥至恒重后進行常規(guī)酸水解處理。精密稱定藥材粗粉（過100目篩）0.4 g，置水解管中，精密加入6 mol/L HCl溶液20 ml，抽真空狀態(tài)下封管，置于110℃烘箱中水解24 h，取出，冷卻，濾過，精密量取濾液1 ml蒸干。殘留物用去離子水溶解，再蒸干，反復進行2次，最后殘留物用去離子水溶解定容至25 ml，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。作為氨基酸成分分析的供試品溶液。

2.410%微乳液的制備取十二烷基硫酸鈉（SDS）、正丁醇、正己烷和水，按3.0∶14.0∶2.0∶2.2的比例混勻，即得。

2.5龍脷葉的薄層色譜分析參照薄層色譜法［6］試驗，分別精密吸取供試品溶液、氨基酸對照品溶液、龍脷葉對照藥材溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板（20 cm× 20 cm），以10%微乳液為展開劑展開，取出，晾干，噴以2%茚三酮乙醇試液（臨用配制），電吹風熱風吹至斑點顯色清晰。

2.6氨基酸成分分析［7-8］采用日立L-8800型全自動氨基酸分析儀。分析柱：陽離子交換樹脂柱（4.6 mm×60 mm，3 μm）；分析時間：45 min；緩沖液流速：0.4 ml/min（緩沖液泵壓力8～11.5 Pa），茚三酮流速：0.3 ml/min（茚三酮泵壓力0.9～1.2 kPa）；緩沖液改變次數(shù)5次；柱溫：56℃；氮氣壓力：20 kPa；供試品和對照品溶液進樣量均為20 μl。

3　結果

3.1龍脷葉中游離氨基酸薄層色譜分析結果見圖1。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。

基金項目：廣西自然科學基金項目（編號：2013GXNSFAA019171）；廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥繼承創(chuàng)新工程壯瑤醫(yī)藥研究與開發(fā)項目（編號：GZZY13-10）

圖1　龍脷葉中游離氨基酸TLC圖

3.2龍脷葉中氨基酸成分的分析結果按照2.6項測定條件，對龍脷葉中18種基礎氨基酸進行分析測定，結果見表1。

表1　龍脷葉中18種基礎氨基酸的測定結果

4　討論

龍脷葉中含有蛋氨酸（0.06%）、纈氨酸（1.07%）、蘇氨酸（0.82%）、異亮氨酸（0.84%）、苯丙氨酸（1.07%）、亮氨酸（1.58%）、賴氨酸（0.62%）等7種人體必需氨基酸，含有組氨酸（0.27%）、胱氨酸（0.08%）、絡氨酸（0.58%）、精氨酸（1.29%）等4種半必需氨基酸。龍脷葉總氨基酸總量達16.32%，表明龍脷葉具有較高的藥用和食用價值。

龍脷葉中氨基酸成分的薄層色譜以微乳系統(tǒng)作為展開劑，可以有效克服由于氨基酸成分水溶性強、極性大造成斑點拖尾的缺點。在預試驗中，本課題組對龍脷葉中氨基酸的薄層色譜展開系統(tǒng)進行篩選，分別考察了正丁醇∶冰醋酸∶水（4∶1∶1）、氯仿∶甲醇∶水（7∶3∶1）、10%微乳液、30%微乳液、60%微乳液等多種不同展開系統(tǒng)，其中以10%微乳液的分離效果最好，斑點集中清晰，比移值適中，專屬性強。

氨基酸是構成生物體蛋白質分子的基本單位，與生物的生命活動密切相關，尤與人類健康有著緊密的關系。本研究采用全自動氨基酸分析儀分析測定了龍脷葉中18種基礎氨基酸的含量，為龍脷葉的質量評價和營養(yǎng)評價提供初步的基礎數(shù)據(jù)。

參考文獻

［1］廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所.廣西藥用植物名錄［M］.南寧：廣西人民出版社，1986：198.

［2］廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東省中藥材標準［M］.廣州：廣東科學技術出版社，2004：70.

［3］莫惠雯，曾艷婷，韋建華，等.龍脷葉揮發(fā)油化學成分的GC-MS分析［J］.廣西中醫(yī)藥，2015，38（5）：70-72.

［4］Egydio P M，Catarina C S，F(xiàn)loha E S，et al.Free amino acid composition of Annona（Annonaceae）fruitspecies of economic interest［J］.Industrial Crops and Products，2013，45：373-376.

［5］徐琪壽.氨基酸藥理學研究進展［J］.氨基酸和生物資源，1996，18（1）：30-32.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：附錄34-35.

［7］章麗，劉松雁.氨基酸測定方法的研究進展［J］.河北化工，2009，32（5）：27-29.

［8］徐瑾，葉愛英，丁敬敏.百合中氨基酸組成測定與營養(yǎng)功能分析［J］.氨基酸和生物資源，2011，33（3）：18-20.

（2016-05-03收稿/編輯陳明偉）

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1003-0719（2016）03-0076-03