青花菜肉桂酰輔酶A還原酶基因的克隆與表達特征分析

李小艷　裴徐梨　荊贊革　唐征

摘 要 為研究肉桂酰輔酶A還原酶在青花菜生長發(fā)育中的作用，采用RT-PCR技術克隆青花菜BoCCR基因全長cDNA序列，并利用qRT-PCR檢測其在不同器官中的表達模式。結果表明：BoCCR基因開放閱讀框為987 bp，推導編碼328個氨基酸。預測蛋白分子量為36.86 ku，PI值為6.04。該蛋白親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，為親水性蛋白。高級結構預測表明青花菜BoCCR蛋白具有完整的二級結構，三級結構的α-螺旋主要位于外部，β-折疊位于內(nèi)部。分子進化分析顯示CCR蛋白在植物進化過程中，各屬形成單獨的分枝，可以區(qū)分其親緣關系。熒光定量技術檢測到青花菜的BoCCR基因在花蕾發(fā)育早期表達最高，推測該基因可能與青花菜花粉發(fā)育相關。

關鍵詞 青花菜；肉桂酰輔酶A還原酶；基因克??；表達分析

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

青花菜（Brassica oleracea var. italica）是一種以綠色或紫色花球作為主要食用器官的世界性蔬菜，其營養(yǎng)十分豐富。一直以來，水果和蔬菜的消費都與健康具有相關性，而富含抗癌物質(zhì)芥子油苷的青花菜被認為是重要的保健蔬菜之一，受到了越來越多消費者的喜愛。

木質(zhì)素是植物體內(nèi)的第二大有機物質(zhì)，總量僅次于纖維素，在植物生長發(fā)育中具有重要的生物學功能[1]。木質(zhì)素主要位于植物特化細胞的次生細胞壁上，其不僅能夠通過細胞壁的木質(zhì)化過程，提高細胞壁的機械強度，還對病原菌侵害和逆境脅迫具有抵御作用[2]。植物花粉的發(fā)育與花粉壁具有密切聯(lián)系[3]?；ǚ郾诮Y構復雜，而木質(zhì)素是其重要的組成部分，因此木質(zhì)素代謝可能對植物的花粉發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。

肉桂酰輔酶A還原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）是木質(zhì)素生物合成過程中的第1個關鍵酶。其能夠還原3種羥基肉桂酸的CoA酯，生成相應的肉桂醛，然后催化木質(zhì)素單體合成[4]。CCR基因家族是一個小的多基因家族，存在2個以上的基因拷貝，而在水稻中僅發(fā)現(xiàn)1個基因拷貝[5]。近年來CCR基因已經(jīng)在水稻[6]、棉花[7]、小麥[8]等模式植物以及美洲南瓜[9]、茶樹[10]、馬尾松[11]等非模式植物中成功克隆，但研究多集中在植物性狀改良方面，而關于CCR基因在花粉發(fā)育過程中的作用報道極少。

本研究利用RT-PCR技術，從青花菜高代自交系‘WN12-95B中成功克隆到肉桂酰輔酶A還原酶基因。通過生物信息學的方法對其基因及氨基酸序列進行分析，同時通過qRT-PCR技術檢測了青花菜BoCCR基因的表達特性，為深入了解該基因在青花菜花粉發(fā)育過程中的作用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料（青花菜高代自交系‘WN12-95B）由溫州科技職業(yè)學院（溫州市農(nóng)科院）提供，常規(guī)田間管理。于始花期取根、莖、葉、嫩莢、不同發(fā)育階段的花蕾（<2 mm，2～4 mm，>4 mm）用于肉桂酰輔酶A還原酶基因的時空表達特征分析。

植物總RNA提取試劑盒、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、熒光染料SYBR GreenⅠ、DNA Marker 2 000等購于大連TaKaRa公司；所用引物由南京金斯瑞有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及目標基因的克隆 青花菜RNA的提取采用植物總RNA提取試劑盒，過程按照試劑盒說明書進行。得到的總RNA使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)本實驗室轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中肉桂酰輔酶A還原酶基因序列設計全長PCR擴增引物（5′-GGCGTCAATGGCTGAAAAG-3′；5′- TGCTTATTACTTTGGAAGATCACC-3′）。擴增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[12]。

1.2.2 BoCCR基因序列的生物信息學分析 將BoCCR基因序列在NCBI的BLASTp（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中進行同源性比對并利用ORF FINDER程序預測BoCCR基因的開放閱讀框。運用Signal P和pI/MW分析BoCCR蛋白的信號肽、切割位點以及分子量和等電點。系統(tǒng)進化樹的構建使用MEGA 5.0進行。DNAMAN用于蛋白的疏水性/親水性分析。Predict Protein軟件（http：//www.predictprotein.org）用于構建蛋白質(zhì)二級和三級結構模型。

1.2.3 BoCCR基因的表達特征分析 采用熒光定量PCR技術對青花菜BoCCR基因在不同組織以及不同發(fā)育時期花蕾的表達特征進行分析。反應過程在BIO-RAD IQ5 Real-time PCR System上完成。BoCCR表達特征分析引物為：5′-CGGTGTAATATC

CTTGTTGAG-3′和5′-GTTGTGAAGTGAATGAGAG

TT-3′。BoActin基因（引物序列：5′-GACAACTTAC

AACTCCATCAT-3′和5′-CTCATACGGTCAGCGAT

A-3′）為內(nèi)參基因。反應條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，40個循環(huán)[12]。每個反應體系重復3次。相對表達量采用2-ΔΔCT法計算，ΔCT=CT，目標基因-CT， actin[13]。

2 結果與分析

2.1 青花菜BoCCR基因的克隆與序列結構分析

以青花菜cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后克隆得到1條BoCCR基因條帶（圖1），該基因的開放閱讀框為987 bp，推導編碼328個氨基酸（圖2），GenBank登錄號為：KX518606。Signal P蛋白信號肽分析顯示BoCCR基因無信號肽序列。該蛋白的分子量為36.86 ku，等電點為6.04。

2.2 青花菜BoCCR基因序列的同源比對

青花菜BoCCR蛋白序列同源性比對結果顯示該蛋白與蕓薹屬植物（甘藍、油菜、白菜）的氨基酸序列同源性極高。其次與擬南芥、薺菜、玉山筷子芥、野草莓、油棕、海棗、無油樟也具有較高的氨基酸序列同源性。結構域分析表明青花菜CCR蛋白屬于NADB_Rossmann超基因家族，含有NADP結合區(qū)域和酶活性區(qū)域兩個結構域，其中NADP結構域為植物CCR蛋白的保守結構。

2.3 青花菜BoCCR蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了深入研究青花菜BoCCR蛋白與其他植物之間的進化關系，采用MEGA 5.0成功構建系統(tǒng)進化樹，結果如圖3。CCR 蛋白在進化的過程中， 可以明顯區(qū)分植物親緣關系。分化較早的無油樟最先分為一支，其次棕櫚科植物海棗和油棕形成一個單獨的分支，草莓與其他植物親緣關系較遠，也單獨位于一個分枝；分化較晚的十字花科植物中，蕓薹屬的青花菜、甘藍、油菜、白菜聚為一支，其他十字花科植物聚為另一支，分子進化結果與植物學的傳統(tǒng)分類基本一致。

2.4 青花菜BoCCR蛋白的親水性和疏水性分析

青花菜BoCCR蛋白的親水性和疏水性預測結果顯示其親水性最大位點為第282位精氨酸（Arg），最大值為2.38；最小位點為第161位絲氨酸（Ser），最小值為-2.08；疏水性最大值為2.68，位點出現(xiàn)在第238位的亮氨酸（Leu），其次最大位點出現(xiàn)在第128 位的丙氨酸（Ala）。青花菜BoCCR蛋白的親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故推測其為親水性蛋白。

2.5 青花菜CCR蛋白高級結構預測

蛋白質(zhì)的二級和三級結構均屬高級結構，其預測對于了解蛋白質(zhì)的生物功能具有重要作用。采用Predict Protein在線軟件預測青花菜CCR蛋白的高級結構，結果顯示該蛋白的二級結構包括α-螺旋（38%）、β-轉(zhuǎn)角（15%）和不規(guī)則卷曲（8%）。三級結構預測顯示CCR蛋白由10個α-螺旋和7個β-折疊組成，α-螺旋主要位于外部，β-折疊在內(nèi)部（圖4）。

2.6 青花菜BoCCR基因的表達特征分析

青花菜BoCCR基因在不同組織及不同發(fā)育時期花蕾的相對表達量分析結果表明，BoCCR在所有組織中均有表達，其中花蕾的表達量最高，其次為葉片，莖的表達量較低。BoCCR基因在花蕾發(fā)育早期（<2 mm）表達量特別高，為葉片中表達量的2倍，之后表達量急劇下降，發(fā)育中期（2～4 mm）表達量最低，后期（>4 mm）表達量略有增加（圖5）。

3 討論

木質(zhì)素是一種重要的次生代謝產(chǎn)物，在高等植物的生長發(fā)育過程中具有重要作用[14]。木質(zhì)素的合成是一個復雜的過程，其中涉及到許多酶的相互作用。CCR是木質(zhì)素合成途徑的第一個限速酶[15]，可調(diào)控木質(zhì)素合成過程中的碳流。迄今為止，CCR基因已經(jīng)在楊樹、小麥、亞麻、桉樹等作物中成功克隆，本試驗獲得了青花菜BoCCR基因，推導編碼328個氨基酸，結構域分析表明其屬于NADB_Rossmann超基因家族成員。BoCCR蛋白不存在信號肽，為非分泌型蛋白，與前人研究相符，表明其在細胞質(zhì)中合成。

蛋白質(zhì)的保守結構域預測可為深入了解蛋白質(zhì)作用機理提供有效途徑。通過BLASTp的結果發(fā)現(xiàn)青花菜BoCCR蛋白存在一個還原酶保守結構域，其能夠有效的結合輔因子NADPH，是CCR的催化位點。同時比對通過BLAST得到的不同物種的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)同屬植物之間的CCR蛋白分子結構差異不大，推測同屬的CCR基因家族在物種進化過程中相對保守，與前人結果相符。

本研究通過系統(tǒng)進化樹的構建，揭示了CCR蛋白的進化過程。海棗和油棕同屬于棕櫚科植物，為單子葉植物，在進化過程中較低等，首先被分出；其次為無油樟，它是雙子葉植物中最原始的一種，與其他雙子葉植物沒有明顯的親緣關系[16]；薔薇科的草莓較上面3種植物高等，但與其他科屬植物親緣關系較遠，也位于一個單獨的分支；十字花科植物為高等植物，其染色體與低等植物相比經(jīng)歷了多次全基因組復制事件，位于一個大的類群；而蕓薹屬植物的染色體又額外經(jīng)歷了三倍化現(xiàn)象[17]，與十字花科植物位于不同的分支。植物CCR蛋白的進化與進化相符， 各屬分別形成一個分枝， 呈現(xiàn)明顯的種屬特性。

分析青花菜BoCCR基因在不同組織中的相對表達量，結果可以看出BoCCR基因在根、莖、葉、花蕾、莢中均表達，在發(fā)育早期花蕾（<2 mm）中的表達量明顯高于其他組織，為葉片中的2倍。這種高表達特性可能與木質(zhì)素是花粉壁的主要組成成分有關。在小孢子發(fā)育初期，孢子壁隨著木質(zhì)素沉積而迅速加厚和轉(zhuǎn)化。該基因隨著花蕾發(fā)育表達豐度降低。推測原因其可能是隨著花粉的發(fā)育，花粉壁發(fā)育所需合成木質(zhì)素也逐漸降低，但具體作用機理有待進一步研究。本研究對青花菜BoCCR基因的克隆對今后研究BoCCR基因在花粉發(fā)育過程中的作用奠定一定的基礎。

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