靈芝酸A對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

劉海鵬，鄭克彬，單小松（河北大學(xué)附屬醫(yī)院，神經(jīng)外科，河北保定071000）

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靈芝酸A對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

劉海鵬，鄭克彬，單小松
（河北大學(xué)附屬醫(yī)院，神經(jīng)外科，河北保定071000）

【摘要】目的 探討靈芝酸A對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞凋亡、侵襲及KDR表達(dá)的影響。方法 制備靈芝酸A，以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞U251細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)液所含靈芝酸A的不同濃度，將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（等量細(xì)PBS）、靈芝酸A低濃度組（0. 1 mmol/ L）和高濃度組（0. 5 mmol/ L）。用RT-PCR和Western blot法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)KDR基因的表達(dá)，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞體外增殖能力，流式細(xì)胞技術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡情況，TUNEL染色檢測(cè)各組細(xì)胞的的凋亡，細(xì)胞侵襲小室法檢測(cè)各組細(xì)胞的體外侵襲力。結(jié)果 RT-PCR和Western blot顯示，靈芝酸A高濃度組和低濃度組較空白對(duì)照組的KDR mRNA和蛋白表達(dá)都明顯下降；靈芝酸A高濃度組和低濃度組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢，降低G1期細(xì)胞比例，S期和G2/ M期比例增高；與空白對(duì)照組相比，高濃度組和低濃度組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P＜0. 01），增殖、侵襲能力顯著下降（P＜0. 05）；高濃度組和低濃度組細(xì)胞相比促進(jìn)凋亡和抑制KDR表達(dá)的作用更明顯（P＜0. 05）。結(jié)論 靈芝酸A可誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和侵襲能力，并能抑制KdrDR mRNA和蛋白的表達(dá)，提示這可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】靈芝酸A；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體；細(xì)胞周期；凋亡

靈芝又稱仙草，屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬，有提高機(jī)體免疫力、降壓調(diào)脂及抗腫瘤等多種藥用價(jià)值，目前已引起醫(yī)療界的廣泛關(guān)注，尤其是其在抗腫瘤方面［1］。研究發(fā)現(xiàn)，其抗腫瘤的主要成分是從靈芝孢子粉中提取的靈芝酸A［2－3］。神經(jīng)膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的類型，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半［4］。目前關(guān)于靈芝酸A治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究頗多，但主要局限于抗腫瘤機(jī)制方面，在藥理作用及療效方面還有待進(jìn)一步的研究［5－6］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體II激酶功能區(qū)受體（vascular endothelial growth factorⅡ，VEGFR2/ kinase domain receptor，KDR）在許多類型腫瘤中高表達(dá)，其阻滯劑可調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤生長(zhǎng)［7－8］。本文主要研究靈芝酸A對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的生物學(xué)影響及KDR表達(dá)的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)于2013年8月－2015年8月在河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U251）來(lái)源北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理教研室提供，并由本實(shí)驗(yàn)室凍存；DMEM、磷酸鹽緩沖液（phosphatic buffered saline，PBS）、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海Best- Bio貝博公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司、DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；Western blot及苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、IP細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒（增強(qiáng)型）、20× TBS緩沖液等均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；碘化丙錠PI和RNase酶購(gòu)自Sigma公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；靈芝酸A購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；KDR和GAPDH基因的引物由上海吉瑪制藥公司合成并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證；兔抗人KDR單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/ mL左氧氟沙星的DMEM培養(yǎng)基中的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞，置于37℃5%CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)、傳代。把用50 mmol/ L甲醇溶解好的靈芝酸A放于4℃的冰箱中保存。依據(jù)靈芝酸A的濃度不同分為低濃度組（0. 1 mmol/ L）、高濃度組（0. 5 mmol/ L）和對(duì)照組（1%甲醇0. 2 mL）。將3組細(xì)胞放于37℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)KDR mRNA表達(dá)

用TRIzol試劑盒提取培養(yǎng)48 h后U251細(xì)胞的總RNA量，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，KDR上游引物：5 '-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA -3’，下游引物：5’-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物795 bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物：5’-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3’，下游引物：5’TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為509 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃變性2 min、62℃退火1 min、72℃延伸1 min，循環(huán)35次，再于72℃延伸8 min。經(jīng)1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像儀觀察結(jié)果，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7. 0軟件分析條帶灰度值，KDR/ GAPDH比值代表KDR mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Westernblotting檢測(cè)KDR蛋白表達(dá)

提取培養(yǎng)48 h后各組的總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。將50 μg總蛋白進(jìn)行上樣、8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜并用10%脫脂奶粉封閉2 h，加入KDR、GAPDH（1∶800稀釋），于搖床上4℃孵育過(guò)夜。用三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗滌3次，每次10 min，洗膜后加入二抗（1∶5000）。最后暗室曝光，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白條帶，獲取圖像并進(jìn)行條帶灰度值分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.2.4CCK8法檢測(cè)U251細(xì)胞的增殖

將U251細(xì)胞按4000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板上，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白孔作為對(duì)照。每孔加入CCK-8 20 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度（D）值，取5個(gè)復(fù)孔的平均數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel按50 μg/孔的濃度置于聚碳酸酯微孔濾膜上進(jìn)行聚合，每孔下室中加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，上室加入U(xiǎn)251細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，進(jìn)行固定、染色并光鏡下計(jì)數(shù)膜下表面的細(xì)胞。每張微孔膜計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)小室，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞侵襲率（%）=穿膜細(xì)胞數(shù)/上室中接種的細(xì)胞總數(shù)×100%

1.2.6細(xì)胞周期檢測(cè)

將細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化、PBS沖洗、70%乙醇固定，4℃過(guò)夜。用PBS沖洗，將細(xì)胞混合成1. 0× 105/ mL的細(xì)胞懸液，并以細(xì)胞懸液∶PI =1∶1加入適量PI液，4℃下避光孵育30 min，300目篩網(wǎng)過(guò)濾；流式細(xì)胞儀分析DNA含量，軟件分析G1、S、G2/ M各期的細(xì)胞數(shù)及所占比例。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染72 h后，將細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，消化完全后移入Ep管，4℃、2 000 r/ min，離心5 min，棄上清。PBS洗滌2次，加入500 μL buffer，5 μL Annexi n V -FITC，混勻；加5 μL PI混勻后室溫、避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)Ex =488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em =530 nm）。

1.2.8TUNEL染色

細(xì)胞分組后72 h，行U251細(xì)胞爬片并棄培養(yǎng)液，自然晾干；4%多聚甲醛溶液固定，在室溫下用新鮮配制的3%H202進(jìn)行處理，0. 1%TritonX-100（溶于0. 1%枸櫞酸鈉溶液）打孔，行顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片及觀察。每張切片觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，凋亡細(xì)胞百分比即為凋亡指數(shù)（m）。AI（%）=凋亡細(xì)胞彩總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞凋亡計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），結(jié)果以±s表示，P＜0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1靈芝酸A降低KDR mRNA的表達(dá)水平

RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)相關(guān)干預(yù)后U251細(xì)胞KDR mRNA水平高濃度組＜低濃度組＜空白對(duì)照組，且任意兩組間的比較均滿足上述關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。由此說(shuō)明低濃度和高濃度的靈芝酸A均能抑制KDR mRNA的表達(dá)，且高濃度的抑制效果更明顯（圖1）。

圖1　各組KDR mRNA的表達(dá)水平Fig. 1 KDR mRNA expression level of each group

2.2靈芝酸A降低KDR蛋白的表達(dá)水平

表達(dá)量與空白對(duì)照組相比明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）；而低濃度組與空白對(duì)照組間相比KDR蛋白的表達(dá)量亦明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。說(shuō)明低濃度和高濃度的靈芝酸A均能抑制KDR蛋白的表達(dá)，且隨濃度的升高抑制效果更明顯（圖2）。

圖2　各組KDR蛋白的表達(dá)水平Fig. 2 KDR expression levels of each group

2.3CCK-8法檢測(cè)U251細(xì)胞增殖情況

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，3組在490 nm處的A值在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h時(shí)的大小依次是空白對(duì)照組＞低濃度組＞高濃度組，且任意兩組間比較均成立，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。繪制的生長(zhǎng)曲線示，高濃度組較空白對(duì)照組和低濃度組曲線明顯降低（表1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0. 05），低濃度組較空白對(duì)照組曲線亦降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。表明靈芝酸A抑制U251細(xì)胞增殖，且隨濃度升高抑制作用更明顯。

表1　三組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力的比較490 nm（±s，n =5）Tab. 1 Comparison of cell viability between three groups of cells at different time points 490 nm（±s，n =5）

表1　三組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力的比較490 nm（±s，n =5）Tab. 1 Comparison of cell viability between three groups of cells at different time points 490 nm（±s，n =5）

注，Note：P＜0. 05

組別　24 h　48 h　72 h　96 h　120 h空白對(duì)照組　0. 41±0. 04　0. 63±0. 02　1. 44±0. 07　1. 86±0. 16　2. 92±0. 27低濃度組　0. 36±0. 02　0. 45±0. 05　1. 08±0. 13　1. 43±0. 12　2. 14±0. 15高濃度組　0. 24±0. 03　0. 31±0. 04　0. 62±0. 08　0. 97±0. 14　1. 38±0. 12

2.4靈芝酸A降低細(xì)胞體外侵襲力降低

3組穿過(guò)濾過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)依次為：空白對(duì)照組＞低濃度組＞高濃度組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0. 01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靈芝酸A可以抑制U251細(xì)胞的體外侵襲力，且隨濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

由圖3及表2可知，與空白對(duì)照組相比，低濃度組和高濃度組G1期細(xì)胞比例均明顯降低（P＜0. 05），且高濃度組較低濃度組明顯（P＜0. 05）；而S、G2/ M期細(xì)胞比例則明顯升高（P＜0. 05）。

圖3　不同組G1、S、G2期的比較Fig. 3 G1，S，G2 phase comparison of different group

表2　各組細(xì)胞周期分布及凋亡率（%）Tab. 2 Cell cycle distribution and apoptosis rate（%）

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)的DNA直方圖顯示：3組細(xì)胞凋亡率依次為高濃度組＞低濃度組＞對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05），表明靈芝酸A可以明顯促進(jìn)U251細(xì)胞的凋亡，且隨濃度的增加而增強(qiáng)（圖4）。

2.7TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡

TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，3組中均出現(xiàn)細(xì)胞核被染成棕黃色的U251凋亡細(xì)胞，且3組細(xì)胞凋亡數(shù)依次為高濃度組＞低濃度組＞對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05），表明靈芝酸A可以明顯促進(jìn)U251細(xì)胞的凋亡，且隨濃度的增加而增強(qiáng)（圖5）。

圖4　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡Fig. 4 Cell apoptosis was detected by flow cytometry of each group

圖5　TUNEL染色觀察各組細(xì)胞凋亡Fig. 5 TUNEL staining of each group

3　討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的類型，迄今為止病因尚未闡明。雖然臨床上有手術(shù)、藥物及放化療等各種治療手段，但其病死率、復(fù)發(fā)率仍居高不下，尋求新的、有效的治療手段已成為了當(dāng)務(wù)之急［9－10］。

自上世紀(jì)80年代以來(lái)，靈芝治療腫瘤的確切機(jī)制已引起了醫(yī)務(wù)工作者的廣泛興趣。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝酸能激活可直接破壞腫瘤細(xì)胞核形成的蛋白酶，且抑瘤效果與其含量有明顯依賴性［11－12］。與本項(xiàng)研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)研究表明靈芝酸A高濃度組和低濃度組較空白對(duì)照組的KDR mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，證明靈芝酸A在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖力和侵襲力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面起到關(guān)鍵作用，提示調(diào)控KDR基因可能直接或間接地參與人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期的調(diào)控和凋亡，其基因的表達(dá)水平改變與腫瘤細(xì)胞侵襲力關(guān)系密切［13－14］?？赡苁瞧湟至鲎饔玫臐撛跈C(jī)制之一。

人體是一個(gè)有機(jī)的整體，體外實(shí)驗(yàn)不可能做到完全模擬人體生理情況，因此靈芝酸A對(duì)人膠質(zhì)瘤的療效尚需臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。目前，從分子機(jī)制探討靈芝酸A的抗腫瘤作用尚處于探索階段，對(duì)于惡性腫瘤的治療效果也尚處于觀察階段，需要我們繼續(xù)進(jìn)行深入的研究以期早日攻克人膠質(zhì)瘤這一疾病。

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〔修回日期〕2016－01－20

Effect of Ganoderma acid A to human glioma cells U251 cells on proliferation，apoptosis and invasion

LIU Hai-peng，SHAN Xiao-song，ZHENG Ke-bin
（Affiliated Hospital of Hebei University，neurosurgery department，Hebei Baoding 071000，China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of ganoderic acid A（GA-A）on apoptosis，invasion and KDR expression of human U251 cells. Methods Ganoderic acid A（GA-A）was prepared，human U251 cells were treated with 0. 1，and 0. 5 mmol/ L GA-A，and the experiment was divided into blank control，low concentration and high concentration group. The expressions of KDR mRNA and KDR protein was assayed by RT-PCR and Western blot. The effect of GA-A on the proliferation and invasion capability of U251 cells was determined by CCK-8 and transwell assay in vitro，respectively. Flow cytometry was used to detect the influence of GA-A on the cell cycle and apoptosis of U251 cells，and TUNEL staining was detected the cell apoptosis too. Results Compared with the control group，KDR mRNA and protein expression of high concentration and low concentration group were significantly decreased（P＜0. 05），GA-A cansignificantly reduce the cell growth rate，reduce the proportion of cells in G1 phase and increase the proportion of S phase and G2 / M phase，cells apoptosis was significantly increased in the high concentration and low concentration group（P＜0. 01），and cells proliferation and invasion was significantly decreased（P＜0. 05）. Compared with low concentration group，the high concentration group induce cell apoptosis and inhibit the expression of KDR more significant（P＜0. 05）. Conclusions Ganoderma acid A can induce apoptosis in U251 cells，inhibit proliferation and invasion，and can inhibit the expression of KDR mRNA and protein，which may be one of the mechanisms of anti-tumor.

【Key words】Ganoderma acid A；Glioma cells；Vascular endothelial growth factor receptor；Cell cycle；Apoptosis

【中圖分類號(hào)】R739-45 R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0064-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 013

［作者簡(jiǎn)介］劉海鵬（1980－），男，碩士生，研究方向：膠質(zhì)瘤，郵箱：liuhaipengjzl@163. com。

［通訊作者］單小松，E-mail：zhjianjun_123@163. com。