Nrf2抗氧化通路在CCl4所致大鼠急性肝損傷中的保護(hù)作用

周清平，蔣孝華，符小波（.南華大學(xué)附一醫(yī)院感染科，湖南衡陽 400；.湖南耒陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南耒陽 4800）

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Nrf2抗氧化通路在CCl4所致大鼠急性肝損傷中的保護(hù)作用

周清平1，蔣孝華1，符小波2
（1.南華大學(xué)附一醫(yī)院感染科，湖南衡陽 421001；2.湖南耒陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南耒陽 421800）

【摘要】目的 研究Nrf2氧化損傷通路在CCl4所致大鼠急性肝損傷中的保護(hù)作用。方法 將20只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為溶劑對照組和CCl4組，每組10只，另選10只雄性Wistar大鼠，通過載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大鼠雄原核顯微注射，獲得了目的基因Nrf2-tk整合與特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大鼠，作為CCl4+ Nrf2整合組。溶劑對照組靜脈給予1%聚山梨酯－80，共4 d，CCl4組和Nrf2-tk整合組靜脈給予1%聚山梨酯－80，共4 d，第4天給予1%聚山梨酯－80 30 min后，靜脈給予7. 5 mg/ kg CCl4，24 h后處死大鼠。測定血清中AST、ALT和LDH的水平，分別測定肝臟組織中MDA、GSH、GSSG的含量，并計算GSH/ GSSG比值。留取肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化。結(jié)果 和溶劑對照組相比，CCl4組大鼠的血清AST，ALT和LDH的水平明顯升高（P＜0. 05），Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因組大鼠的AST，ALT和LDH的水平亦有輕度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0. 05）。肝臟的MDA含量以及GSH/ GSSG比值顯示Nrf2-tk整合組可以有效降低CCl4造成的脂質(zhì)過氧化損傷和谷胱甘肽的消耗，肝臟病理觀察結(jié)果顯示和CCl4組相比，Nrf2-tk整合組明顯減輕了CCl4造成的損傷。結(jié)論 Nrf2抗氧化損傷通路在CCl4所致大鼠急性肝損傷中的起著重要的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】Nrf2；轉(zhuǎn)基因大鼠；四氯化碳；急性肝損傷

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體對抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)控因子［1］。其通過與抗氧化反應(yīng)元件（an-tioxidant response element，ARE）結(jié)合調(diào)控下游抗氧化酶和II相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧自由基的能力，從而降低氧化應(yīng)激對細(xì)胞、組織及器官造成損傷［2］。目前，Nrf2抗氧化損傷通路在急性肝損傷中的保護(hù)作用的研究還較少，我們擬通過以四氯化碳（CCl4）損傷大鼠為研究對象，通過血液的生化檢查，肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)分析來研究Nrf2抗氧化損傷通路在急性肝損傷中的保護(hù)作用?，F(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1試劑和儀器

山羊抗人Nrf2多克隆抗體，大鼠抗人Nrf2單克隆抗體，大鼠抗人βactin單克隆抗體購自美國Sigma公司，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，MTT粉末，免疫組化SP試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)公司。PLLtk真核表達(dá)載體、RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、pSV2neo篩選質(zhì)粒購于美國Invitrogen公司、PTC200 PCR擴(kuò)增儀，Westernblot轉(zhuǎn)印儀，蛋白電泳儀購自美國BioRad公司。另備酶標(biāo)儀，漩渦振蕩器，24孔板，OMEM培養(yǎng)液，DMSO，移液槍等。

1.2大鼠Palb/ Ealb驅(qū)動Nrf2載體表達(dá)

本研究選擇大鼠血清白蛋白基因啟動子（ALB gene promoter，Palb）與位于Palb上游的增強(qiáng)子（ALB gene enhancer，Ealb）作為調(diào)控元件驅(qū)動目的基因Nrf2的表達(dá)。引進(jìn)了通過PCR獲得的含Kozak序列的Nrf2與不含該序列的Nrf2構(gòu)建載體pLLtk與pLLtk cut，轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2與HC11，進(jìn)一步提高了表達(dá)。

1.3劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移

用marker筆在6孔板背后均勻劃橫線，大約每隔0. 5～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過2條線。在空中加入約5×105個細(xì)胞，24 h后用移液槍頭垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗細(xì)胞洗3次，去除劃下的細(xì)胞，加入有Nrf2基因的無血清培養(yǎng)基，放入37℃5%CO培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，拍照。使用透射電鏡觀察、照相。

1.4Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因大鼠的產(chǎn)生

選取7～8周的Wistar大鼠，雄性，共20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012－0001】。選擇重組載體pLLtk，經(jīng)過兩步純化，并通過雄原核顯微注射技術(shù)作用于大鼠，獲得了目的基因Nrf2-tk整合與特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大鼠，PCR，Western-blot，定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因的整合。用Nrf2-tk抗兔多克隆抗體對轉(zhuǎn)基因大鼠肝臟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析［3］。

1.5動物分組及給藥方案

另選將20只7～8周的Wistar大鼠，，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012 －0019】。雄性，將其隨機(jī)分為溶劑對照組和CCl4組，每組10只。將造模成功的Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因大鼠，作為Nrf2-tk整合組。溶劑對照組靜脈給予1%聚山梨酯－80，共4 d，CCl4組和Nrf2-tk整合組靜脈給予1%聚山梨酯－80，4 d，第4天給予1%聚山梨酯－80 30 min后，靜脈給予7. 5 mg/ kg CCl4。

1.6檢測指標(biāo)

經(jīng)靜脈給予CCl424 h后，將3組大鼠內(nèi)眥靜脈取血，制備血清，測定血清化學(xué)指標(biāo)AST、ALT和LDH的水平，血清化學(xué)指標(biāo)通過HITACHI 7020型自動生化分析儀測定。內(nèi)眥靜脈取血后處死大鼠，取出肝臟稱重，分別切取50 mg組織制作組織勻漿，使用TBA法測定肝臟組織中MDA含量；另取50 mg組織制作組織勻漿，使用改良Hisson法測定肝臟組織中GSH、GSSG，計算GSH/ GSSG比值。留取肝臟左葉，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化。

1.7統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

2.120只大鼠通過雄原核顯微注射技術(shù)成功建立7只原代轉(zhuǎn)基因大鼠模型，整合率為35%（7/20）。定量PCR對轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量，可知7只建模成功的轉(zhuǎn)基因大鼠其后代均為多拷貝重復(fù)，且拷貝數(shù)在各家系不相同，但同一家系轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)是相同的。

2.2Western-blotting分析

Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因大鼠的整合與多拷貝重復(fù)基因的連接方式，結(jié)果表明：7只轉(zhuǎn)基因大鼠外源基因整合方式以多拷貝頭尾串聯(lián)連接為主。Real-time PCR分析轉(zhuǎn)基因大鼠Nrf2-tk的轉(zhuǎn)錄，除肝臟與睪丸外其他組織與器官均沒檢測到Nrf2-tk的轉(zhuǎn)錄，說明Nrf2-tk的表達(dá)具有良好的組織特異性。用Nrf2-tk抗兔多克隆抗體對tk5F1tk455大鼠肝臟切片進(jìn)行棉衣組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Nrf2-tk在部分肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞占總肝細(xì)胞的55%～75%（圖1）。

圖1　Real-time PCR分析Nrf2-tk mRNA的表達(dá)Note：M：100bp ladder，1：blank control，2：Hep-G2 cells（without transfection）and 3：Hep-G2 transfection of pCMV-tk. 4：Hep-G2 transfection of pLL-tk，5. Hep-G2 transfection of pLL-tk cut，6. HC-11 cells（without transfection）7. HC-11 transfection of pCMV-tk. 8. HC-11 transfection of pLL-tk，9. HC-11 transfection of pLL-tk.Fig. 1 Analysis of the expression of mRNA Nrf2-tk by Real-time PCR

2.3Real-time PCR結(jié)果顯示

陽性對照質(zhì)粒pCMV-tk，PLLtk與PLLtk cut轉(zhuǎn)染Hep-G2細(xì)胞有390 bp的Nrf2-tk DNA特異性擴(kuò)增條帶，而陰性對照未轉(zhuǎn)染Hep-G2細(xì)胞和空白對照沒有特異性擴(kuò)增條帶。HC-11細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，僅陽性質(zhì)粒pCMV-tk轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)390 bp的Nrf2-tk DNA特異性擴(kuò)增條帶。495 bp的對照組GAPDH條帶在所有細(xì)胞樣本均出現(xiàn)，空白對照無。表明質(zhì)粒pLLtk與pLLtk cut具有Nrf2-tk mRNA組織特異性轉(zhuǎn)錄活性。

2.43組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果

CCl4組大鼠經(jīng)靜脈給予CCl47. 5 mg/ kg后，血清中AST，ALT，LDH水平升高，與溶劑對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 01）。與CCl4組比較，Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因組AST，ALT，LDH水平明顯下降（P ＜0. 01）（表1）。

表1　3組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果（±s）Tab. 1 Biochemical indexes of serum in 3 groups（±s）

表1　3組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果（±s）Tab. 1 Biochemical indexes of serum in 3 groups（±s）

注：與溶劑對照組比較，a：P＜0. 01；與CCl4組比較，b：P＜0. 01。Note：Compared with the solvent control group，a：P＜0. 01；compared with the CCl4 group，b：P＜0. 01.

組別　n　AST/ IU/ L　ALT/ IU/ L　LDH/ IU/ L溶劑對照組　10　102±19　38±5. 4　251±53 CCl4組　10　1163±393 a　1748±402 a　3273±1082 a CCl4 + Nrf2整合組　7　204±104 b　158±104 b　1293±301 b

2.53組大鼠肝臟MDA和GSH/ GSSG的比值

與溶劑對照組比較，CCl4組肝臟組織中的MDA水平明顯升高，GSH/ GSSG比值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）。與CCl4組比較，CCl4+ Nrf2轉(zhuǎn)染組肝臟組織MDA水平明顯下降，肝臟組織GSH/ GSSG比值明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0. 05）（表2）。

表2　3組大鼠肝臟MDA和GSH/ GSSG的比值Tab. 2 The ratio of MDA and GSH/ GSSG in liver of 3 groups

2.63組大鼠肝臟大體檢查

肉眼觀察可見溶劑對照組大鼠肝臟濕潤有光澤，呈紅褐色。CCl4組大鼠肝臟失去光澤，顏色灰暗。CCl4+ Nrf2轉(zhuǎn)染組大鼠肝臟病變明顯減輕，顏色趨于良好。

2.7組織學(xué)觀察

溶劑對照組大鼠，肝小葉輪廓清晰，肝組織以中央靜脈為中心呈條索狀向四周放射狀排列，肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞未見變性、壞死及脂肪變性（圖1A）。CCl4組可觀察到肝組織損傷，肝細(xì)胞濁腫、氣球樣變性，以肝小葉中央靜脈為中心的壞死，肝小葉內(nèi)可見灶性壞死區(qū)，可見多量的凋亡細(xì)胞（圖1B，D，圖2A-C）。與CCl4組比較，CCl4+ Nrf2整合組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，變性壞死細(xì)胞較少，整體情況優(yōu)于CCl4組（圖1C）。

圖2　3組大鼠肝組織病理切片（HE×40）Fig. 2 Pathological sections of rat liver tissue in 3 groups（HE×40）

圖3　CCl4組大鼠肝組織病理切片：點(diǎn)狀或病灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤，有凋亡細(xì)胞存在，肝細(xì)胞增生。（HE×40）Fig. 3 Rat liver tissue pathology in CCl4group：Point or focal necrosis，inflammatory cell infiltration，cell apoptosis and proliferation liver cell proliferation.（HE×40）

3　討論

肝臟疾病作為人類最常見的疾病之一，對人類健康和社會造成嚴(yán)峻威脅。肝臟損傷是各種肝臟疾病的病變結(jié)果，其防治是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重大課題［4］。因此通過建立肝損傷動物模型，研究肝病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，探索肝損傷的治療方向，具有重要的臨床意義［5－6］。近年來，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)在人類肝臟疾病模型建立中發(fā)揮了重要的作用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以選擇性的殺死動物體的某些特定類型的細(xì)胞，從而模仿某種疾?。?－8］?；谝陨涎芯?，本研究擬通過載體將基因Nrf2整合入大鼠模型，制作出特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大鼠，并進(jìn)一步通過注射CCl4誘導(dǎo)Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因大鼠的肝臟損傷，進(jìn)而明確Nrf2氧化損傷通路在CCl4所致大鼠急性肝損傷中的保護(hù)作用。

Nrf2/ ARE是近年新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體抵抗內(nèi)外氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［9－10］。氧化應(yīng)激作用下，Nrf2可啟動ARE調(diào)控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達(dá)，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、血紅素氧合酶-1（HO-1）等，從而增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抗性，為肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展起到積極的防護(hù)作用［9－10］。研究發(fā)現(xiàn)，在Nrf2敲除的大鼠中，正常情況和誘導(dǎo)情況下的Ⅱ相酶水平如GST、NQO1、γ-GCS顯著減少。

在本研究中，我們通過雄原核顯微注射技術(shù)成功建立了原代Nrf2轉(zhuǎn)基因大鼠模型［11－12］，隨后我們采用RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因大鼠Nrf2-tk的轉(zhuǎn)錄，除肝臟與睪丸外其他組織與器官均沒檢測到Nrf2-tk的轉(zhuǎn)錄，說明Nrf2-tk的表達(dá)具有良好的組織特異性。用Nrf2-tk抗兔多克隆抗體對tk5F1tk455大鼠肝臟切片進(jìn)行棉衣組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Nrf2-tk在部分肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞占總肝細(xì)胞的55% ～75%，證明Nrf2轉(zhuǎn)基因大鼠模型建立良好。

CCl4是經(jīng)典的肝毒物，其病變主要引起中央靜脈周圍肝細(xì)胞壞死，纖維增生為竇縫隙為主［13－14］。本研究中，CCl4組大鼠給予CCl424 h后，其體重下降，肝體比、腎體比增加，血清中AST，ALT和LDH水平顯著上升，肝臟組織病理學(xué)改變明顯，表明CCl4對大鼠造成了急性的肝臟損傷。與CCl4組比較，CCl4+ Nrf2整合組AST，ALT和LDH水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在CCl4+ Nrf2整合組大鼠肝臟的病理學(xué)觀察中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于CCl4組，細(xì)胞壞死減少，組織結(jié)構(gòu)清晰。表明Nrf2轉(zhuǎn)基因大鼠可以有效地減弱CCl4對肝臟造成的損傷。

MDA是組織中不飽和脂肪酸過氧化的最終產(chǎn)物，GSH/ GSSG比值反映了組織抵御氧化性損傷的水平，兩者是常用的抗氧化指標(biāo)［15－16］。在本研究中，給予CCl424 h后，大鼠肝臟組織中MDA水平明顯升高，GSH/ GSSG比值明顯降低都說明了CCl4對大鼠的肝臟產(chǎn)生了氧化性損傷。而CCl4 + Nrf2整合組大鼠肝臟組織中MDA水平與CCl4組比較，明顯降低；GSH/ GSSG比值與CCl4組比較，明顯升高。提示Nrf2可誘導(dǎo)體內(nèi)GSH的合成，進(jìn)而抑制CCl4對肝臟造成的損傷［17］。

經(jīng)CCl4處理后，對3組大鼠肝臟組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)分析組織學(xué)觀察，可見CCl4組可觀察到肝組織損傷，肝細(xì)胞濁腫、氣球樣變性，以肝小葉中央靜脈為中心的壞死，肝小葉內(nèi)可見灶性壞死區(qū)，可見多量的凋亡細(xì)胞。與CCl4組比較，CCl4+ Nrf2整合組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，變性壞死細(xì)胞較少，整體情況優(yōu)于CCl4組。以上結(jié)果表明Nrf2-tk轉(zhuǎn)基因大鼠可有效減輕生理功能與形態(tài)學(xué)改變的肝臟損傷。

綜上所述，根據(jù)本研究得到的結(jié)果，可以推測Nrf2/ ARE抗氧化通路可通過調(diào)動機(jī)體的抗氧化體系來抑制CCl4對大鼠的肝臟產(chǎn)生的損傷，但對于Nrf2/ ARE通路是否還存在其他的途徑來發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用仍需要進(jìn)一步探索。本研究成果為探討肝病的發(fā)病機(jī)制提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，為肝臟疾病診斷和治療的研究奠定了基礎(chǔ)［18－19］。

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〔修回日期〕2016－01－12

Effect of Nrf2 signal pathway on acute hepatotoxicity induced by CCl4in rat

ZHOU Qing-ping1，JIANG Xiao-hua1，F(xiàn)U Xiao-bo2
（1. Department of infectious diseases of the First Affiliated Hospital of University of South China，Hunan Hengyang 421001，China；2. Department of Internal Medicine of the People’s Hospital，Hunan Leiyang 421800，China）

【Abstract】Objective To determine the effect of Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2（Nrf2）on acute hephrotoxicity induced by CCl4 in male rat. Methods 20 male Wistar rats were randomly divided into control group and CCl4group，10 rats in each group，another 10 male Wistar rats were transgenic rats microinjection through the carrier，obtained the Nrf2-tk gene integration and specific transgenic rats，as the CCl4+ Nrf2 integration group. The groups was given 1%polysorbate 80 for 4 days，Then the CCl4and CCl4+ Nrf2 integration group were intraperitoneally injected with a single dose of CCl47. 5 mg·kg－1and were killed 24 h after CCl4injection. The serum chemical parameters including asparate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）and lactate dehydrogenase（LDH）were measured. Also malonaldehyde（MDA），glutathione（GSH），oxidized glutathione（GSSG）levels in the liver as well as glutathione（GSH）/ oxidized glutathione（GSSG）ratios were detected. Histopathologic changes in the liver were examined. Results F1generation TK transgenic rats in liver and testis and other tissues and organs were not detected the transcription of Nrf2-tk，indicating that Nrf2-tk expression in tissues is specific good. Nrf2 significantly reduced serum AST，ALT and LDH levels in a dose-dependent manner. The results of MDA levels and GSH/ GSSG ratios in liver and kidney showed that Nrf2reduced CCl4-induced hepatic lipid peroxidation，and ameliorated glutathione depletion. The histopathologic results showed that Nrf2 restrained liver and kidney damage induced by CCl4. Conclusion Nrf2 can effectively protect male rat from acute hepatotoxicity and nephrotoxicity induced by CCl4.

【Key words】Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2（Nrf2）；Transgenic rat models；CCl4；Acute hepatotoxicity induced

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0052-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 011