伊維菌素原藥對(duì)大鼠的亞急性吸入毒性研究

紀(jì) 磊，岑江杰，林師道，胡成云，方 華，徐 劍，陳 杰（浙江省化工研究院有限公司，杭州 310023）

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伊維菌素原藥對(duì)大鼠的亞急性吸入毒性研究

紀(jì) 磊，岑江杰，林師道，胡成云，方 華，徐 劍，陳 杰
（浙江省化工研究院有限公司，杭州 310023）

【摘要】目的 研究伊維菌素原藥對(duì)大鼠亞急性吸入毒性，求出最大無(wú)作用劑量。方法 采用SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，共72只，隨機(jī)分成6組，每組12只，雌雄各半。設(shè)190、380、750 mg/ m3等3個(gè)劑量組和1個(gè)溶劑對(duì)照組（0. 03%吐溫－80溶液），另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照和1個(gè)附加組（750 mg/ m3）。采用動(dòng)式（口鼻式）吸入染毒，每天染毒1次，持續(xù)4 h，每周染毒5 d，直至28 d，附加組動(dòng)物停止染毒后繼續(xù)觀察14 d。試驗(yàn)結(jié)束后，分別對(duì)動(dòng)物作血液常規(guī)、生化、體重及臟器系數(shù)等測(cè)定，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 750 mg/ m3劑量組雌雄大鼠在染毒后期出現(xiàn)被毛蓬松、呆滯、流涎、震顫等中毒反應(yīng)。750 mg/ m3劑量組雌鼠食物利用率下降，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平升高（P＜0. 01），肝臟器系數(shù)（臟體比）升高（P＜0. 05），且病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠肝細(xì)胞混濁腫脹現(xiàn)象；750 mg/ m3劑量組雄鼠染毒第4周的體重下降，血清尿素氮（BUN）和ALT水平升高（P＜0. 01），總膽固醇（CHOL）水平下降（P＜0. 05）。結(jié)論 伊維菌素原藥對(duì)大鼠亞急性吸入毒性試驗(yàn)的最大無(wú)作用劑量雌、雄性均為380 mg/ m3（4 h/ d）。

【關(guān)鍵詞】伊維菌素原藥；亞急性吸入毒性；最大無(wú)作用劑量

伊維菌素（ivermectin，IVM）是由阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的半合成大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)多組分抗生素，自1981年投入市場(chǎng)作為獸用驅(qū)蟲(chóng)藥后，IVM因其高效及安全的殺蟲(chóng)效果，已被廣泛應(yīng)用于殺滅寄生在家畜及水產(chǎn)動(dòng)物等體內(nèi)的線(xiàn)蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物。但即便如此，隨著伊維菌素市場(chǎng)需求量的不斷增大，其對(duì)健康的影響仍應(yīng)該受到重視。目前伊維菌素的毒性文獻(xiàn)報(bào)道較少，為了解較長(zhǎng)時(shí)間暴露伊維菌素可能引起的毒性效應(yīng)，我們根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB15670－1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》并參考經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品測(cè)試方法［1－2］對(duì)伊維菌素的大鼠亞急性吸入毒性進(jìn)行了研究。

1　材料和方法

1.1受試物

伊維菌素原藥，本白色粉未，無(wú)刺激性氣味，難溶于水，含量為90%，由浙江某農(nóng)藥公司提供。

1.2儀器

HOPE-8052型吸入染毒裝置、美普達(dá)UV-6100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、日立7020型全自動(dòng)血生化分析儀、MEK-7222K全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀、優(yōu)利特－ 200自動(dòng)尿液分析儀、Thermo Shandon Excelsior脫水機(jī)、Thermo Shandon Histocentre 2石蠟包埋機(jī)、Leica RM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)。

1.3動(dòng)物及環(huán)境

試驗(yàn)采用72只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，雌鼠體重184～203 g，雄鼠體重198～211 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（滬）2008－ 0016】提供。本研究在本機(jī)構(gòu)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行【SYXK（浙）2009－0125】，動(dòng)物房?jī)?nèi)通風(fēng)10～12 次/ h，人工照明，12 h/12 h明暗交替，室溫20°C～26°C，相對(duì)濕度40%～70%，動(dòng)物單獨(dú)編號(hào)，同性別2只一籠，飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(nèi)，動(dòng)物自由攝食，飲用滅菌水，飼料為全價(jià)營(yíng)養(yǎng)輻照飼料。本研究編號(hào)為APS2013120258A，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理小組審核批準(zhǔn)后實(shí)施，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.4劑量設(shè)計(jì)

預(yù)先進(jìn)行大鼠急性吸入毒性試驗(yàn)和3周反復(fù)吸入毒性試驗(yàn)，得出伊維菌素原藥急性吸入LD50（吸入4 h）為3690（2710－5010）mg/ m3。3周反復(fù)吸入試驗(yàn)顯示：在380 mg/ m3劑量條件下動(dòng)物無(wú)明顯中毒癥狀及體重和進(jìn)食量無(wú)明顯差異，在750 mg/ m3劑量條件下，第5天起動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn)流涎、被毛潮濕等中毒癥狀，在染毒結(jié)束回籠2 h后逐漸恢復(fù)，次日染毒前癥狀基本消失。3周染毒期間動(dòng)物無(wú)死亡。因此正式試驗(yàn)中，將動(dòng)物按體重隨機(jī)分成190、380、750 mg/ m3等3個(gè)劑量組，1個(gè)溶劑對(duì)照組（0. 03%吐溫－80溶液）、1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)附加組（750 mg/ m3），每組12只，雌雄各半。

1.5供試品配制

供試品先加入1%吐溫－80進(jìn)行乳化，用蒸餾水配成不同濃度乳化液，作為各劑量組和附加組的試驗(yàn)用液?？瞻讓?duì)照組不使用任何溶劑和供試品，吸入染毒直接通空氣。溶劑對(duì)照組采用0. 03%吐溫－80蒸餾水溶液，其它條件同試驗(yàn)組。

1.6染毒方法

采用HOPE-8052型動(dòng)式吸入（口鼻式）染毒裝置，染毒裝置柜體容積為0. 06 m3。大鼠用固定器固定后插于染毒柜上，僅暴露口鼻。設(shè)定染毒裝置參數(shù)：藥物流速1. 3 mL/ min、進(jìn)氣流速2. 2 m3/ h、染毒時(shí)間4 h。用磁力攪拌器低速攪拌受試液，啟動(dòng)染毒裝置，發(fā)生氣溶膠。染毒期間染毒柜內(nèi)保持溫度在20℃～26℃、氧含量不低于19%，染毒期間動(dòng)物禁食、禁水，染毒結(jié)束，取出動(dòng)物回籠、自由進(jìn)食飲水。每天連續(xù)經(jīng)呼吸道吸入染毒4 h，每周染毒5 d，直至28 d，附加組動(dòng)物在染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察2周。

1.7濃度測(cè)定

在染毒柜內(nèi)動(dòng)物呼吸帶，用大氣采樣機(jī)串聯(lián)氣泡吸收管（以10 mL甲醇為吸收液）采集5 L（流量1 L/ min、采集時(shí)間5 min）染毒氣溶膠，應(yīng)用紫外分光光度法（以受試物為標(biāo)樣，以245 nm為測(cè)定波長(zhǎng)），于第1、2、3、4、5、15、22、28天，每天3次，采樣測(cè)定動(dòng)物呼吸道染毒濃度，平均值為實(shí)測(cè)濃度。

1.8觀察指標(biāo)

1.8.1一般指標(biāo)：試驗(yàn)期間每日觀察大鼠的活動(dòng)和中毒癥狀，并進(jìn)行周進(jìn)食量和周體重變化的記錄，并測(cè)定食物利用率。

1.8.2血生化和血常規(guī)測(cè)定：于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠經(jīng)眼眶靜脈采血，進(jìn)行血液生化和血常規(guī)測(cè)定。血液生化指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHOL）、膽堿酯酶（CHE）、血糖（GLU）等。血常規(guī)指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）及其分類(lèi)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）、血小板壓積（PCT）等。

1.8.3尿常規(guī)測(cè)定：試驗(yàn)結(jié)束前1 d留取6 h尿液進(jìn)行尿常規(guī)測(cè)定，指標(biāo)包括尿pH值、亞硝酸鹽（NIT）、蛋白質(zhì)（PRO）、糖（GLU）、維生素C（VC）、隱血（BLD）、比重（SG）、膽紅素（BIL）、尿膽原（URO）、酮體（KET）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）等。

1.8.4臟器系數(shù)及病理檢查：試驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，檢查各臟器肉眼可見(jiàn)病變，稱(chēng)取腦、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸和卵巢等臟器濕重，計(jì)算臟器系數(shù)。對(duì)溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組、高劑量組及附加組動(dòng)物主要臟器以及大體解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織取樣固定于15%中性甲醛溶液，作組織病理學(xué)檢查。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1受試物染毒濃度實(shí)測(cè)結(jié)果

在染毒期間實(shí)測(cè)動(dòng)物呼吸帶受試物濃度24次，測(cè)得190、380、750 mg / m3和附加組的受試物平均濃度分別為184、380、739、741 mg/ m3。

2.2一般狀況、進(jìn)食量及體重檢查

750mg/ m3劑量組雄鼠體重與溶劑對(duì)照組相比下降，差異與有極顯著性意義（P＜0. 01），其余各組動(dòng)物體重與溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0. 05）。各組進(jìn)食量與溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0. 05），750 mg/ m3劑量組雌鼠的食物利用率與溶劑對(duì)照組相比下降，差異有極顯著性意義（P ＜0. 01）（表1）。750 mg/ m3劑量組和附加組在染毒的第15～26天相繼觀察到個(gè)別或部分動(dòng)物出現(xiàn)被毛蓬松、流涎、被毛潮濕、俯臥及震顫癥狀。上述癥狀在動(dòng)物染毒結(jié)束回籠2 h后開(kāi)始緩解，次日染毒前均恢復(fù)正常。其他劑量組和對(duì)照組動(dòng)物均未觀察到中毒癥狀。附加組動(dòng)物中毒癥狀在2周觀察恢復(fù)期開(kāi)始后2～3 d消失，亦未見(jiàn)死亡。

2.3血液生化測(cè)定

血液生化測(cè)定顯示染毒結(jié)束750 mg/ m3劑量組雌雄大鼠的ALT水平顯著高于溶劑對(duì)照組（P＜0. 01）；雄鼠的BUN水平顯著高于溶劑對(duì)照組（P＜0. 01）；雄鼠的CHOL水平低于溶劑對(duì)照組（P＜0. 05），其他血液生化指標(biāo)未見(jiàn)異常改變（表2）。

表1　伊維菌素原藥對(duì)大鼠體重變化和食物利用率的影響Tab. 1 Effects of Ivermectin TC on body weight and feed efficiency in the rat

表2　伊維菌素原藥對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響Tab. 2 Effects of Ivermectin TC on blood biochemical index in the rat

表3　伊維菌素原藥對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響Tab. 3 Effects of Ivermectin TC on organ indexes in the rat

2.4血常規(guī)測(cè)定

血常規(guī)測(cè)定顯示染毒結(jié)束190 mg/ m3劑量組雄鼠RBC和HGB水平高于溶劑對(duì)照組（P＜0. 05），但與空白對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性，且在本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)值正常范圍內(nèi)，故無(wú)臨床意義；雌鼠的血液學(xué)指標(biāo)均未見(jiàn)異常改變。

2.5尿常規(guī)測(cè)定

尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示各劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）。

2.6臟器系數(shù)和病理學(xué)檢查

染毒結(jié)束時(shí)，動(dòng)物大體解剖顯示，190 mg/ m3劑量組1例雄鼠右腎缺如，左腎大，其余均未見(jiàn)腫瘤及其它肉眼可見(jiàn)的病變。臟器系數(shù)結(jié)果表明，750 mg/ m3劑量組雌鼠肝臟器系數(shù)高于溶劑對(duì)照組雌鼠，有顯著性差異（P＜0. 05）（表3）。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，750 mg/ m3劑量組部分雌鼠肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞混濁腫脹現(xiàn)象（圖1）。其它動(dòng)物受檢臟器均未見(jiàn)有意義的組織病理學(xué)改變。

圖1　伊維菌素引起高劑量組雌性大鼠肝臟混濁腫脹（HE×10）Note：A. In the solvent control group，there was no abnormal liver in the female rat；B. In the high dose group of 750mg/ m3，Hepatic cell cloudy swelling was observed in the female rat.Fig. 1 Ivermectin caused by high dose group of female rat liver cloudy swelling（HE×10）

3　討論

伊維菌素的作用機(jī)制在于：藥物與蟲(chóng)體細(xì)胞上的特異性高、親和力強(qiáng)的位點(diǎn)結(jié)合，影響蟲(chóng)體細(xì)胞膜中的谷氨酸鈉離子通道對(duì)氯離子的通透性，進(jìn)而引起抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的釋放增加，GABA作用于突觸前的神經(jīng)末梢，減少興奮性遞質(zhì)的釋放，使突觸后膜產(chǎn)生興奮性突觸后電位減少，突觸后神經(jīng)元因膜電位的去極化程度達(dá)不到閾值而不能進(jìn)入興奮狀態(tài)，從而引起抑制而使蟲(chóng)體麻痹、死亡［3－7］。此次實(shí)驗(yàn)研究我們對(duì)大鼠進(jìn)行反復(fù)吸入伊維菌素原藥28 d后，發(fā)現(xiàn)：在750 mg/ m3劑量組，雌雄大鼠在染毒后期出現(xiàn)被毛蓬松、呆滯、流涎、震顫等中毒反應(yīng)，雌鼠食物利用率下降、血液ALT水平與肝臟體比升高，且病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠肝細(xì)胞混濁腫脹現(xiàn)象；雄鼠血液ALT和BUN水平升高、第4周體重和CHOL水平下降。在750 mg/ m3以下劑量組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)有意義的改變。附加組（750 mg/ m3）動(dòng)物在停止染毒后14 d觀察期內(nèi)體重、食物利用率以及血生化水平等指標(biāo)均恢復(fù)正常。在本試驗(yàn)條件下，伊維菌素原藥對(duì)大鼠亞急性吸入毒性試驗(yàn)的最大無(wú)作用劑量雌、雄性均為380 mg/ m3（4 h/ d）。在反復(fù)吸入750 mg/ m3伊維菌素后，雌雄大鼠血液ALT水平上升，雄鼠BUN水平上升，雌鼠肝臟體比升高，且病理檢查肝臟有肝細(xì)胞混濁腫脹現(xiàn)象，因此初步判斷肝臟可能是伊維菌素作用靶器官。本試驗(yàn)結(jié)果為安全評(píng)價(jià)伊維菌素原藥的亞急性吸入毒性提供了有價(jià)值的毒理學(xué)資料，并為慢性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)提供良好參考。

有文獻(xiàn)報(bào)道［6］，伊維菌素的藥動(dòng)學(xué)顯示，給藥途徑（經(jīng)口或皮下注射）、動(dòng)物種類(lèi)對(duì)趨殺體內(nèi)外寄生蟲(chóng)的療效沒(méi)有影響，均吸收迅速，分布廣泛，對(duì)動(dòng)物經(jīng)口服用（犬、豬）或皮下注射（牛、羊），生物利用度均可達(dá)95%。伊維菌素原藥對(duì)大鼠急性經(jīng)口LD50（mg/ kg）：雄11. 6，雌24. 6－41. 6［7］，按GB15670－1995［1］判定，伊維菌素屬高毒。而我們測(cè)得伊維菌素原藥對(duì)大鼠急性吸入LC50（吸入4 h）為3690（2710－5010）mg/ m3，屬低毒。還有文獻(xiàn)報(bào)道，伊維菌素與P-糖蛋白抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，會(huì)對(duì)雄鼠生殖系統(tǒng)造成影響［8］；對(duì)雄性大白鼠經(jīng)口灌胃給予伊維菌素達(dá)到一定劑量時(shí)，可引起大白鼠睪丸及附睪臟器系數(shù)下降［9］；對(duì)雄性鯽空腹口灌給予伊維菌素時(shí)，雄性鯽生殖腺指數(shù)（GSI）下降［10］，而本次研究未觀察到雄性大鼠睪丸臟器系數(shù)下降，這可能與給藥途徑不同有關(guān)。伊維菌素的經(jīng)口與吸入毒性差異很大，說(shuō)明暴露途徑非常重要，在伊維菌素使用上要著重避免經(jīng)消化道接觸，獸醫(yī)或動(dòng)物醫(yī)院在使用伊維菌素時(shí)，要嚴(yán)格保管，防止丟失。

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〔修回日期〕2016－01－19

Study on the subacute inhalation toxicity of ivermectin TC in rats

JI Lei，CEN Jiang-jie，LIN Shi-dao，HU Cheng-yun，F(xiàn)ANG Hua，XU Jian，CHEN Jie
（Zhejiang Research Institute of Chemical Industry，Hangzhou 310023，China）

【Abstract】Objective To study the subacute inhalation toxicity of Ivermectin TC，and obtain its non-observed adverse effect level（NOAEL）. Methods It was performed on the doses of Ivermectin TC 190，380，750 mg/ m3，the solvent control group（0. 03%Tween-80 solution），the control group and additional group（there were 6 female and 6 male Sprague-Dawley rats for each group）. The animals inhaled with nose-only exposure for 4 weeks（4 h/ d，5 d/ week）. The additional group should be observed another 14 days after exposing. At the end of experiment，the rats were killed，the routine and biochemical detection，the body weight and organ to body weight ratios were all measured. Results In the high exposure group，clinical signs of rats included hair fluffy，dull，salivation，tremors were recorded at the exposure period；in female rats，feed efficiency was decreased，ALT and liver to body weight ratio were increased；in male rats，BUN and ALT were increased，CHOL and body weight for the 4th week were decreased. Histopathological examinations revealed that swelling in the liver cell was seen in some female rats at high exposure group. Conclusion The results suggested that the NOAEL of Ivermectin TC in SD rats was 380 mg/ m3（4 h/ d for 28 days）.

【Key words】Ivermectin TC；Subacute inhalation toxicity；NOAEL

【中圖分類(lèi)號(hào)】R114 R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0070-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 014

［作者簡(jiǎn)介］紀(jì)磊，男，本科，助理研究員，從事農(nóng)藥及化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)工作。