肺腺癌A 549綠色熒光裸鼠模型中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源初探

方 天，胡若愚，胡文娟，劉 彪，尤金煒，惲?xí)r鋒（.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，南京 000；.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胸心外科，南京 000）

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肺腺癌A 549綠色熒光裸鼠模型中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源初探

方 天1，胡若愚2，胡文娟1，劉 彪1，尤金煒1，惲?xí)r鋒1
（1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，南京 210002；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胸心外科，南京 210002）

【摘要】目的 建立綠色熒光裸小鼠皮下接種肺腺癌A 549模型，研究肺腺癌腫瘤血管生成過(guò)程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源。方法 建立肺腺癌A 549皮下接種GFP裸小鼠模型，應(yīng)用免疫熒光染色法進(jìn)行CD 31染色，標(biāo)記腫瘤血管；采用熒光顯微鏡觀察并拍攝腫瘤組織冰凍切片；免疫組化檢測(cè)腫瘤組織血管中內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)。結(jié)果 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GFP蛋白和CD 31蛋白可共表達(dá)于部分間質(zhì)血管；部分血管表達(dá)CD 31蛋白而不表達(dá)GFP蛋白。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：腫瘤組織中部分間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)GFP蛋白。結(jié)論 組成腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞部分來(lái)源于裸鼠體內(nèi)，部分來(lái)源于腫瘤細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】肺腺癌A 549；血管生成；內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞

腫瘤的生成、轉(zhuǎn)移與腫瘤新的血管生成關(guān)系密切，腫瘤血管生成一直是人們認(rèn)識(shí)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)程和進(jìn)行腫瘤治療的一個(gè)重要途徑［1］。近年來(lái)，血管靶向藥物對(duì)于腫瘤治療有一定療效［2］，但抗腫瘤血管靶向藥物耐藥或者療效不佳（20%～37%）［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)發(fā)生染色體變異的內(nèi)皮細(xì)胞是由腫瘤干細(xì)胞分化而來(lái)，這可能是腫瘤血管生成的另一種重要方式［4］。腫瘤干細(xì)胞的異質(zhì)性，可塑性導(dǎo)致其功能的多樣性，它通過(guò)各種方式為腫瘤提供全面的生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)及其他條件［5－6］。在肺腺癌的研究中，腫瘤干細(xì)胞與宿主裸鼠體細(xì)胞到底誰(shuí)是腫瘤血管的主要來(lái)源是認(rèn)識(shí)肺腺癌血管新生的重要課題。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)此作初步探索，找出組成腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，從而為肺腺癌腫瘤血管治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)5～6周齡綠色熒光（GFP）裸小鼠12只，雄性。GFP裸小鼠由本科室選育【SCXK（軍）2012－0047】；實(shí)驗(yàn)室【SYXK（軍）2012－0014】。主要試劑和儀器：肺腺癌A 549來(lái)自本院腫瘤科饋贈(zèng)。胎牛血清、RPMI－1640培養(yǎng)液和0. 25%胰蛋白酶均購(gòu)自GIBCO公司。CD 31多克隆抗體（Abcam公司），山羊抗兔CY3（谷歌生物）；GFP抗體，即ANTI-EGFP，（博奧森公司）；DAPI（谷歌生物）；抗熒光淬滅封片劑（谷歌生物）。組化試劑盒DAB顯色劑（DAKO公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2肺腺癌A 549皮下接種GFP裸小鼠模型的制備

GFP裸小鼠是將GFP基因?qū)隑ALB/ c-nu/ nu小鼠而得。具體培育過(guò)程：通過(guò)（GFP）C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠與BALB/ c裸小鼠進(jìn)行雜交，獲得子一代（F1），選取F1代小鼠進(jìn)行自交，產(chǎn)生子二代（F2）代，從F2代中選擇帶綠色熒光的雄性裸小鼠與雌性熒光雜合子，進(jìn)行全同胞交配，獲得的熒光裸小鼠再與BALB/ c小鼠進(jìn)行回交，回交后代再自交，產(chǎn)生子三代（F3），F(xiàn)3代回交后代再自交，產(chǎn)生子四代（F4），如此重復(fù)，直至十五代（F15），便可成功選育出在體內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)GFP的綠色熒光裸小鼠。

肺腺癌A 549細(xì)胞株培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中（1640培養(yǎng)液+ 10%胎牛血清，pH 7. 2），置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合率，0. 25%胰蛋白酶消化傳代。接種于生長(zhǎng)狀況良好的5～6周齡GFP裸小鼠，共10只。待移植腫瘤直徑1～2 cm時(shí)，無(wú)痛處死荷瘤GFP裸小鼠，取移植腫瘤塊放置福爾馬林浸泡待用。

1.3免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表明蛋白的表達(dá)

從荷瘤GFP裸小鼠體內(nèi)，在無(wú)菌條件下取腫瘤組織塊，4%多聚甲醛浸泡24 h，30%蔗糖脫水48 h，OCT包埋保存于－80℃，制作冷凍切片。按照常規(guī)熒光免疫步驟檢測(cè)腫瘤組織塊中內(nèi)皮細(xì)胞的分子標(biāo)記物CD31的表達(dá)情況，簡(jiǎn)要如下：4℃丙酮固定15 min，PBS液漂洗，山羊血清封閉，傾去，勿洗。滴加兔抗鼠多克隆抗體CD 31（1∶50）到切片上，4℃孵育過(guò)夜；PBS充分漂洗后加入CY3山羊抗兔IgG（1∶300），37℃孵育，PBS漂洗；DAPI復(fù)染細(xì)胞核；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察CD 31和GFP蛋白表達(dá)情況。

1.4免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中GFP蛋白的表達(dá)

制作冰凍切片步驟同上。常規(guī)免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中GFP蛋白的表達(dá)，簡(jiǎn)要步驟：抗原修復(fù)，血清封閉；滴加ANTI-EGFP（1：200），切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。滴加HRP（1：200）山羊抗兔的IgG覆蓋于組織上。DAB顯色；復(fù)染細(xì)胞核；脫水封片，中性樹(shù)膠封片。倒置顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2　結(jié)果

2.1免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

從腫瘤組織切片免疫熒光染色結(jié)果看出：血管標(biāo)記物CD 31多克隆抗體免疫熒光染色標(biāo)記肺腺癌A549皮下接種腫瘤組織，DAPI染核（圖1A、D、G），倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果：內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)記物CD31蛋白在肺腺癌腫瘤間質(zhì)血管有強(qiáng)烈的陽(yáng)性表達(dá)，顯示CY3紅色熒光信號(hào)，紅色熒光信號(hào)顯示出腫瘤組織間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞簇包裹形成微血管管腔，并且管腔大小以及形態(tài)均清晰可見(jiàn)，但還有部分紅色熒光信號(hào)顯示無(wú)明顯管腔形態(tài)或管腔不規(guī)則（圖1B、E、H）。而GFP蛋白則顯示GFP綠色熒光信號(hào)，即腫瘤組織中部分腫瘤間質(zhì)細(xì)胞和部分圍成血管的內(nèi)皮細(xì)胞有綠色熒光（圖1 C、F、I）。進(jìn)一步采用熒光顯微鏡觀察未進(jìn)行CD 31染色的腫瘤組織冰凍切片，腫瘤組織中GFP表達(dá)得出同樣結(jié)論：有部分血管管腔中的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)GFP，而大部分血管管腔中內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)GFP（圖2）。腫瘤組織塊間質(zhì)血管側(cè)面剖面免疫熒光染色結(jié)果顯示：CD 31有強(qiáng)烈的陽(yáng)性染色，血管管腔顯示CY3紅色熒光信號(hào)（圖3B），而顯示出的GFP綠色熒光信號(hào)則相對(duì)很弱（圖3C），這表示組成腫瘤組織間質(zhì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞只有一部分表達(dá)GFP，且表達(dá)GFP的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于腫瘤宿主動(dòng)物即GFP裸小鼠。

圖1　CD 31蛋白和GFP蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果

由GFP單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，腫瘤組織中部分腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和組成腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)綠色熒光蛋白（即GFP，圖3 D、E、F），這一結(jié)果與免疫熒光實(shí)驗(yàn)中熒光顯微鏡下觀察到腫瘤組織冰凍切片發(fā)出GFP綠色信號(hào)熒光的結(jié)果一致（圖1 C、F、I；圖2B、D；圖3C），這表明腫瘤組織冰凍切片中腫瘤間質(zhì)及間質(zhì)血管管腔均有GFP蛋白表達(dá)，即免疫熒光實(shí)驗(yàn)中所發(fā)出的綠色熒光是由綠色熒光蛋白發(fā)出的特異性綠色熒光。這一結(jié)果說(shuō)明，熒光裸鼠體內(nèi)正常成體細(xì)胞在特定條件下定向分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤組織中的血管新生。

3　討論

血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)［7］。當(dāng)腫瘤體積增長(zhǎng)大于一定大小時(shí)，在沒(méi)有新生血管長(zhǎng)入的條件下，腫瘤組織大多保持靜止?fàn)顟B(tài)或者退化［8］。新生血管長(zhǎng)入腫瘤組織以后血液供應(yīng)豐富，這是因?yàn)樾律転槟[瘤組織提供足夠的營(yíng)養(yǎng)、氧氣和大量的生長(zhǎng)因子，從而促使腫瘤迅速生長(zhǎng)。同時(shí)，血管生成也與腫瘤轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，腫瘤新生血管不成熟，腫瘤細(xì)胞更加容易穿透微血管壁發(fā)生轉(zhuǎn)移；腫瘤新生血管形成后，淋巴回流增加，腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，也是促使腫瘤轉(zhuǎn)移的重要影響因素［9］。經(jīng)典的血管生成是指由內(nèi)皮細(xì)胞排列圍成內(nèi)皮依賴(lài)性血管，即血管壁由分化成熟的內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，EC）存覆，該理論認(rèn)為腫瘤細(xì)胞不參與血管壁的構(gòu)成，此種生成方式一般包括出芽式血管生成、套入式血管生成［10］。而Maniotis等［11］對(duì)此有相反的觀點(diǎn)，通過(guò)對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤進(jìn)行深入的研究，Maniotis等首先明確提出腫瘤細(xì)胞自身也能形成血管管道從而為腫瘤提供血供。另外，意大利國(guó)家衛(wèi)生所的研究者們發(fā)現(xiàn)相同基因組改變的膠質(zhì)瘤細(xì)胞樣本中腫瘤衍生血管細(xì)胞的數(shù)值約為20%～90%，它們之間存在明顯的差異［12］，這表明其中很大一部分組成腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤來(lái)源的。因此，我們想在肺腺癌的研究中，首先找出組成腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，從而阻斷新的血管生成、毀壞現(xiàn)有的血管從根本上讓腫瘤挨餓不能吸取營(yíng)養(yǎng)和相關(guān)生長(zhǎng)因子，達(dá)到抑制癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的目的。

圖2　腫瘤組織冰凍切片中GFP表達(dá)Fig. 2 Expression of GFP on tumor frozen section

圖3　A、B、C腫瘤組織冰凍切片中CD31和GFP的表達(dá)；D、E、F免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織冰凍切片GFP蛋白的表達(dá)（×20）Fig. 3 A、B、C Expression of CD 31 and GFP on tumor frozen section；D、E、F Expression of GFP in tumor frozen section was detected by immunohistochemistry

為了研究肺腺癌腫瘤組織中內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室選育的綠色熒光（GFP）裸鼠建立肺腺癌細(xì)胞A549皮下接種模型，取完整腫瘤組織塊制作冰凍切片，再利用腫瘤血管標(biāo)志物CD31多克隆抗體對(duì)肺腺癌A549皮下接種腫瘤組織冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色標(biāo)記，結(jié)合熒光顯微拍攝，觀察并拍攝CD 31和GFP在腫瘤血管中的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)室科研人員于2005年從美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)表達(dá)GFP的C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10sb/ J小鼠，與普通BALB/ c裸小鼠進(jìn)行雜交繁育，選育出GFP裸小鼠。利用GFP裸小鼠具有T細(xì)胞功能缺陷和系統(tǒng)表達(dá)GFP的雙重特點(diǎn)，跟蹤正常體細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的走向及發(fā)展，結(jié)合現(xiàn)代分子影像學(xué)技術(shù)，研究癌細(xì)胞以及宿主動(dòng)物之間的關(guān)系。在熒光顯微鏡下，本實(shí)驗(yàn)室培育的GFP裸小鼠大部分器官都表達(dá)綠色熒光，包括心臟、肺臟、脾臟、胰腺、食管、胃和十二指腸，其中皮膚、血細(xì)胞、肌肉也表達(dá)綠色熒光；該GFP轉(zhuǎn)基因裸小鼠既保留了裸小鼠的生物學(xué)特性，在全身組織器官中又能穩(wěn)定表達(dá)GFP。本實(shí)驗(yàn)即是利用其血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）表達(dá)強(qiáng)烈信號(hào)的綠色熒光蛋白，使其腫瘤組織內(nèi)的血管在熒光顯微鏡下清晰可見(jiàn)，結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31標(biāo)記GFP裸小鼠肺腺癌模型腫瘤血管來(lái)研究肺腺癌組成新生腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)記物CD31蛋白在肺腺癌腫瘤間質(zhì)血管有強(qiáng)烈的陽(yáng)性表達(dá)，顯示CY3紅色熒光信號(hào)，紅色熒光信號(hào)顯示出腫瘤組織間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞簇包裹形成微血管管腔，并且微血管管腔大小以及形態(tài)均清晰可見(jiàn)，但部分紅色熒光信號(hào)顯示無(wú)明顯管腔或管腔不規(guī)則。而GFP表達(dá)結(jié)果則顯示出腫瘤組織中部分腫瘤細(xì)胞和部分圍成血管的內(nèi)皮細(xì)胞有綠色熒光，即表達(dá)綠色熒光蛋白，進(jìn)一步由GFP但克隆抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實(shí)，腫瘤組織在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中所觀察到的綠色熒光信號(hào)確實(shí)特異性的，是由綠色熒光蛋白發(fā)出的。這一結(jié)果說(shuō)明，熒光裸鼠體內(nèi)正常成體細(xì)胞在特定條件下定向分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤組織中的血管新生。而有部分血管管腔中內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)GFP，則說(shuō)明部分組成血管的內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)自腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞，這些細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)GFP，這一結(jié)果有力的支持了腫瘤干細(xì)胞有可能向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的理論，其機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

隨著腫瘤研究的不斷深入，目前腫瘤生物學(xué)的研究中最具有吸引力的是腫瘤干細(xì)胞（carcinoma stem cells，CSCs）的理論，該理論認(rèn)為腫瘤具有自我更新、分化潛能和侵襲能力等方面的誘導(dǎo)性和可逆性。成體細(xì)胞的可塑性是生物體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種成體干細(xì)胞在特定條件下可定向分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）或內(nèi)皮細(xì)胞（EC）參與血管新生。Shen等［13］的研究提示在某些條件的誘導(dǎo)下，腫瘤干細(xì)胞有可能向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，其機(jī)制可能是通過(guò)改變局部微環(huán)境（如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化），以有利于后續(xù)血管新生［14］。Yao等［15］認(rèn)為腫瘤微環(huán)境決定了腫瘤干細(xì)胞的可塑性，從而使腫瘤細(xì)胞模仿血管管道的而形成血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicy，VM）。腫瘤的維持、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于血管生成，血管生成為靶點(diǎn)的治療方法是近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)研究中重要的領(lǐng)域［16－17］。據(jù)報(bào)道，目前血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是已知最強(qiáng)的促血管生成因子［18］，多種腫瘤研究已經(jīng)證實(shí)阻斷VEGF信號(hào)通路能夠降低腫瘤組織中的微血管密度，從而達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)的目的［19］。臨床上抗VEGF治療方法主要是通過(guò)聯(lián)合化療或者放療發(fā)揮抗癌作用［20］。由于不同類(lèi)型的腫瘤抗VEGF療效不一，抗VEGF治療法經(jīng)常發(fā)生耐藥［21－23］，這或許與Dll4-Notch信號(hào)通路有關(guān)［24］。聯(lián)合采用DBZ或者DAPT（γ-分泌酶抑制劑）阻斷Notch信號(hào)，或許能夠提高VEGF抑制劑的療效，并與之產(chǎn)生抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。本文作者擬在此篇論文研究結(jié)論，即腫瘤干細(xì)胞有可能向功能性血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化的理論基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在機(jī)制上闡明VEGF抑制劑和γ-分泌酶抑制劑等如何阻斷血管生成因子通路，從而阻止腫瘤血管的生成。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Goh PP，Sze DM，Roufogalis BD. Molecular and cellular regulators of cancer angiogenesis［J］. Curr Cancer Drug Targets，2007，7：743－758.

［2］ Kos M，Dabrowski A. Tumours angiogenesis - the function of VEGF and BFGF in colorectal cancer［J］. Ann Univ Mariae Curie Sklodowsk，2002，57：556－561.

［3］ Rodrigesz FJ，Orr BA，Ligon KL，et al. Neoplastic cells are a rare component in human glioblastoma microvasculature［J］. Oncotarget，2012，3：98－106.

［4］ Butler JM，Kobayashi H，Rafii S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine fators［J］. Nat Rev Cancer，2010，10：138－146.

［5］ Nagy JA，Chang SH，Shih SC，et al. Heterogeneity of the tumor vasculature［J］. Semin Thromb Hemost，2010，36：321－331.

［6］ Carmeliet P，Jain RK. Priciples and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic disease［J］. Nat Rev Drug Discov，2011，10：417－427.

［7］ Ferrara N，Gerber H P，Couter J. The biology of VEGF and its receptors［J］. Nat Med，2003，9（6）：669－676.

［8］ Nesbit M. Abrogation of tumor vasculature using gene therapy ［J］. Cancer metastasis Rev，2000，19（1/2）：45－49.

［9］ Weis SM，Cheresh DA. Tumor angiogenesis：molecular pathways and therapeutic targets［J］. Nat MED，2011，17（11）：1359－ 1730.

［10］ Liu J，Huang J，Yao WY，et al. the origins of vacularization in tumors［J］. Front Biosci，2012，17（1）：2559－2565.

［11］ Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry［J］. Am J Pathol，1999，155（3）：739 －752.

［12］ Ricci-Vitiani L，Pallini R，Biffoni M，et al. Tumor vascularization via endothelial differentiation of glioblastoma stemlike cells［J］. Nature，2010，468（7325）：824－828.

［13］ Shen R，Ye Y，Chen L，et al. Precancerous stem cells can serve as tumor vasculogenic progenitor［J］. Plos One，2008，3（2）：641－652.

［14］ Krohn A，Song YH，Muehlberg F，et al. CXCR4 receptor postitive spheroid forming cell are responsible for tumor invasion in vitro［J］. Cancer Lett，2009，280（1）：65－71.

［15］ Yao XH，Ping YF. Contribution of cancer stem cells to tumor vasculo-genic mimicry［J］. Protein cell，2011，2（4）：266 －272.

［16］ Rosca EV，Koskimoki JE，Rivera CG，et al. Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics［J］. Curr Pharm Biotechnol，2011，12（8）：1101－1116.

［17］ Goel S，Duda DG，Xu L，et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases［J］. Cancer Lett，2011，91（3）：1071－1121.

［18］ Shojaei F. Anti-angiogenic in cancer：Current challenges and future perspectives［J］. Cancer Lett，2012，320（2）：130 －137.

［19］ Sitohy B，Nagy JA，Dvorak HF. Anti-VEGF/ VEGFR therapy for cancer：Reassessing the target［J］. Cancer Res，2012，72（8）：1909－1914.

［20］ Goel S，Wong AH，Jain RK. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease［J］. Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2（3）：1－23.

［21］ Bergers G，Hanahan D. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy［J］. Nature Reviews Cancer，2008，8（8）：592－603.

［22］ Kerbel RS. Molecular origins of cancer：tumor angiogenic［J］. N Engl J Med，2008，358，（19）：2039－2049.

［23］ Kieran MW，Kalluri R，Cho YJ. The VEGF pathway in cancer and disease：responses，resistance，and path forward［J］. Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2（12）：1－17.

［24］ Liu SK，Bham SA，F(xiàn)okas E，et al. Delta-like ligand 4-notch blockade and tumor radiation response［J］. J Natl Cancer Inst，2011，103（23）：1778－1798.

〔修回日期〕2016－01－13

Research on the source of endothelial cells in tumor vessels by A 549 tumor model with GFP nude mouse

FANG Tian1，HU Ruo-yu2，HU Wen-juan1，LIU Biao1，YOU Jin-Wei1，YUN Shi-feng1
（1. Department of Comparative Medicine，National Science Education Base，Nanjing 210002，China，2. Department of thoracic surgery，Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University，Nanjing 210002，China）

【Abstract】Objective To explore the source of endothelial cells in tumor vessels by A 549 tumor model with GFP nude mouse. Methods To establish the A 549 lung cancer models with GFP nude mice，expression of CD 31 was determined by immunofluorescence to label tumor vessels；to observe and take a picture of the tumor frozen section by confocal microscopy and invert microscope；expression of GFP in tumor vessels was determined by immunohistochemistry. Result The results of immunofluorescence showed：Tumor interstitial vascular endothelial cells or endothelial cells clusters and micro-vascular lumen size and shape are clearly visible by immunofluorescence，and part of vessels with no obvious lumen or irregular lumen. We can see green fluorescent in tumor cells of tumor tissue and endothelial cells which form of tumor vessels. The results of immunohistochemistry showed：expression of GFP was determined in cytoplasm of tumor stromal cells and endothelial cells in tumor vessels. Conclusion The endothelial cells which formed tumor neovessels that derived from GFP nude mice partly and the other part derived from tumor cells.

【Key words】A 549；Vascularization；Endothelial cells；Carcinoma stem cells

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0046-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 010

［作者簡(jiǎn)介］方天（1984－），女，碩士，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科技師，Email：Fangtianlove@126. com。

［通訊作者］惲?xí)r鋒（1965－），男，博士，主任技師，教授，研究生導(dǎo)師，從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)工作，Email：yunshifeng1@163. com。