立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡及PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路的影響

劉志輝（江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西景德鎮(zhèn) 333000）

?

立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡及PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路的影響

劉志輝
（江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西景德鎮(zhèn) 333000）

【摘要】目的 探討立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的凋亡及對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/內(nèi)皮型一氧化氮（eNOS）信號(hào)通路的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分為正常組，模型組（33. 3 mol/ L葡萄糖），立普妥組（33. 3 mol/ L葡萄糖+0. 1，1，10 μmol/ L）；MTT法檢測(cè)各組HUVEC活力；倒置顯微鏡拍照檢測(cè)各組HUVEC形態(tài)；Annexin V-FITC/ PI流式雙染法檢測(cè)各組HUVEC凋亡；Gries法檢測(cè)各組HUVEC上清NO含量；Western blot分析PI3K/ AKT激活狀況及eNOS的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組比較，高糖組中HUVEC皺縮，變圓變亮，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡率顯著提高，NO含量及eNOS、PI3K表達(dá)量及AKT磷酸化程度降低，差異均具有顯著性（P＜0. 05）；與模型組比較，1，10 μmol/ L立普妥組中HUVEC形態(tài)恢復(fù)，細(xì)胞活力上升，PI3K表達(dá)量提高，差異均具有顯著性（P＜0. 05）；0. 1，1，10 μmol/ L立普妥組HUVEC凋亡程度下降，NO含量、eNOS表達(dá)量提高，AKT磷酸化水平上升，差異均具有顯著性（P＜0. 05）。結(jié)論 立普妥可抵抗高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡，是通過(guò)激活PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】立普妥；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）；凋亡；PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路

糖尿病（diabetes mellitus）是一種以慢性高血糖為特征的內(nèi)分泌疾病，其并發(fā)癥涉及心，眼，腎，糖尿病足和神經(jīng)病變，這些都和血管損傷有關(guān)［1］。血管內(nèi)皮在維持正常的血流速度及血管張力，氧化應(yīng)激，抑制血管炎癥等方面具有重要作用。且糖尿病的預(yù)后及并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展與整體血糖水平的升高密切相關(guān)［2］。因此，進(jìn)一步深入研究高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制對(duì)防治糖尿病血管病變具有重要的臨床意義。

立普妥，又稱阿托伐他汀鈣片，是3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶選擇性抑制劑，可通過(guò)降低肝臟中膽固醇及脂質(zhì)蛋白合成量來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)脂代謝目的，已大量用于臨床糖尿病，冠心病的治療。如立普妥通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝對(duì)2型糖尿病合并急性腦梗死患者具有治療作用［3］。立普妥可通過(guò)提高維生素D水平及骨密度含量來(lái)治療老年2型糖尿病患者［4］。通過(guò)超聲能觀察到立普妥可以逆轉(zhuǎn)2型糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊［5］。不同劑量立普妥對(duì)老年急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者有顯著治療作用［6］。并且立普妥對(duì)同型半胱氨酸［7］，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）［8］，腫瘤壞死因子-α［9］，高糖［10］誘導(dǎo)的HUVEC凋亡，但具體機(jī)制未知，因此本文在此基礎(chǔ)探討立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡抑制作用的機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，貨號(hào)：C-1161，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。立普妥，由輝瑞制藥提供，批號(hào)：95837021。葡萄糖購(gòu)自阿拉丁，批號(hào)：G116307；兔抗eNOS，AKT，p-AKT，PI3K，GADPH單克隆抗體購(gòu)自杭州Epitmics公司；NO檢測(cè)試劑盒，Annexin V-FITC流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)分別為：S0021，C1063；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2分組方法

將HUVEC分為3組，即正常組：正常HUVEC，模型組：33. 3 mol/ L葡萄糖，立普妥組：33. 3 mol/ L葡萄糖+0. 1，1，10 μmol/ L立普妥。

1.3細(xì)胞活力檢測(cè)（MTT法）

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HUVEC消化，并調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔板，按1. 2分組方法進(jìn)行給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并倒置顯微鏡下拍照，后每孔加MTT（5 mg/ mL）20 μL，4 h后，棄上清，并每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。

1.4Annexin V-FITC流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HUVEC，消化，細(xì)胞濃度調(diào)整為8×103個(gè)細(xì)胞/ ml，接種于6孔板，按1. 2分組方法進(jìn)行給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照Annexin VFITC/ PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的方法，用0. 25%的胰蛋白酶（不含EDTA）消化，PBS洗滌，2000 r/ min離心5 min，收集細(xì)胞；加入Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL，混勻，于室溫避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5細(xì)胞內(nèi)NO含量

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HUVEC，消化，細(xì)胞濃度調(diào)整為8×103個(gè)細(xì)胞/ mL，接種于6孔板，按1. 2分組方法進(jìn)行給藥，培養(yǎng)48 h，后離心收集細(xì)胞，反復(fù)凍融，使細(xì)胞內(nèi)容物流出，取上清檢測(cè)NO含量，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6Westernblotting

將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HUVEC，消化，細(xì)胞濃度調(diào)整為8×103個(gè)細(xì)胞/ mL，接種于6孔板，按1. 2分組方法進(jìn)行給藥，培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞樣本，加入RAPI裂解液裂解細(xì)胞，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌三次。次日加二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌三次，Biorad系統(tǒng)曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS17. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x－± s表示，t檢驗(yàn)分析組間差異的顯著性。P＜0. 05表示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞形態(tài)及活力的影響

如圖1所示，與正常組比較，模型組中HUVEC細(xì)胞皺縮，細(xì)胞變圓變亮；與模型組比較，1，10 μmol/ L立普妥組中細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)。如圖2所示，與正常組比較，模型組中HUVEC細(xì)胞活力下降，具有顯著性差異（P＜0. 01）；與模型組比較，1，10 μmol/ L立普妥組細(xì)胞活力提高，具有顯著性差異（P＜ 0. 05）。說(shuō)明1，10 μmol/ L立普妥能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞形態(tài)異常及活力下降。

圖1　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞形態(tài)的影響Note：A：normal group；B：model group；C：0. 1 μmol/ L lipitor；D：1 μmol/ L lipitor；E：10 μmol/ L lipitor.Fig. 1 Effect of lipitor on morphology of HUVEC

圖2　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC活力的影響Note：Compared with normal group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01.Fig. 2 Effect of lipitor on viability of HUVEC induced by high glucose

2.2立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響

如表1所示，與正常組比較，模型組中HUVEC早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著提高，具有顯著性差異（P＜0. 01）；與模型組比較，0. 1，1，10 μmol/ L立普妥組HUVEC早期凋亡和晚期凋亡數(shù)目都顯著降低，具有顯著性差異（P＜0. 05）。

表1　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響（±s）Tab. 1 Effect of lipitor on apoptosis of HUVEC

表1　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響（±s）Tab. 1 Effect of lipitor on apoptosis of HUVEC

注：與正常組比較，aaP＜0. 01；與模型組比較，bP＜0. 05，bbP＜0. 01。Note：Compared with normal group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01.

induced by high glucose（±s）組別　　劑量（μmol/ L）早期凋亡（%）晚期凋亡（%）正常組組　?。?. 52±0. 13　 2. 57±0. 19模型組（33. 3 M）　?。?. 78±0. 55aa34. 41±3. 09aa0. 1　7. 98±1. 21b　26. 22±2. 99b立普妥組　1　6. 59±0. 59bb15. 84±1. 67bb10　3. 22±0. 30bb　 9. 78±0. 55bb

2.3立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中NO含量的影響

如圖3所示，與正常組比較，模型組中NO含量下降，具有顯著性差異（P＜0. 01）；與模型組比較，0. 1，1，10 μmol/ L立普妥組中NO含量顯著提高，具有顯著性差異（P＜0. 05）。

2.5立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中PI3K/ AKT信號(hào)通路的影響

如圖4所示，與正常組比較，模型組中PI3K表達(dá)及AKT磷酸化程度降低，具有顯著性差異（P＜0. 01）；與模型組比較，1，10 μmol/ L立普妥組PI3K表達(dá)量顯著提高，具有顯著性差異（P＜0. 01）；0. 1，1，10 μmol/ L立普妥組AKT磷酸化水平顯著提高，具有顯著性差異（P＜0. 05）。

2.6立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中eNOS表達(dá)量的影響

如圖5所示，與正常組比較，模型組中eNOS表達(dá)量降低，具有顯著性差異（P＜0. 01）；與模型組比較，0. 1，1，10 μmol/ L立普妥組中eNOS表達(dá)量顯著提高，具有顯著性差異（P＜0. 01）。

圖3　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中NO含量的影響Note：Compared with normal group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01.Fig. 3 Effect of lipitor on level of NO in HVEC induced by high glucose

3　討論

糖尿病心血管病變始于內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂以內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速，內(nèi)皮細(xì)胞分泌因子失衡，內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞反應(yīng)增多等主要表現(xiàn)。內(nèi)皮細(xì)胞作為血管的機(jī)械屏障受損，成為內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的主要表現(xiàn)。并且糖尿病患者大血管病變危險(xiǎn)性增高與高糖所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡具有典型的生化和形態(tài)學(xué)改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜出現(xiàn)囊泡、膜磷脂不對(duì)稱消失、細(xì)胞膜皺縮、核固縮、DNA有序片段化等。Song［11］，Chen等［12］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，HUVEC細(xì)胞凋亡顯著。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與上述報(bào)告一致，即高濃度葡萄糖作為誘導(dǎo)劑，可使HUVEC細(xì)胞皺縮，細(xì)胞變圓變亮，細(xì)胞凋亡率提高。立普妥對(duì)同型半胱氨酸［7］，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）［8］，腫瘤壞死因子-α［9］誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。立普妥能立普妥亦能減輕ox-LDL誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［13］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)一定劑量立普妥能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡，并改善細(xì)胞形態(tài)，與謝彬等［10］觀點(diǎn)一致。

圖4　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中PI3K/ AKT信號(hào)通路的影響Note：Compared with normal group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01.Fig. 4 Effect of lipitor on PI3K/ AKT signal pathway in HVEC induced by high glucose

高糖會(huì)使血管內(nèi)皮依賴性血管舒張功能減退，血流速度下降，且血管舒張功能與血糖濃度負(fù)相關(guān)，提示高濃度的葡萄糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的異常［2］。NO是源于內(nèi)皮細(xì)胞一種血管保護(hù)因子，廣泛分布于各種組織，在信息傳遞，心肺功能，臟器血流調(diào)節(jié)等方面具有重要作用。正常生理?xiàng)l件下，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化產(chǎn)生，在高糖等條件下所產(chǎn)生的大量超氧陰離子可抑制eNOS的生物活性，使NO生成減少，抑制NO生物活性，使NO的血管保護(hù)作用減弱，因此改善血管內(nèi)皮形態(tài)及NO及其合酶的含量具有重要意義。替米沙坦聯(lián)合立普妥能改善糖尿病大鼠內(nèi)皮形態(tài)及功能［14］。立普妥可通過(guò)提高NO含量來(lái)保護(hù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC縫隙連接，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［8］。立普妥聯(lián)合氨氯地平能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞損傷，與上調(diào)eNOS表達(dá)有關(guān)［15］。立普妥能通過(guò)提高NO含量來(lái)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷［16］。立普妥能夠促進(jìn)eNOS蛋白及mRNA表達(dá)，減少ox-LDL誘導(dǎo)的副作用，并可以選擇性地維持NO介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性動(dòng)脈松弛［17］。與上述報(bào)告一致，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)使NO及eNOS含量顯著下降，給予一定劑量立普妥能使NO含量及eNOS表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明立普妥可通過(guò)刺激NO表達(dá)來(lái)改善內(nèi)皮功能。

圖5　立普妥對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC中eNOS表達(dá)量的影響Note：Compared with normal group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01.Fig. 5 Effect of lipitor on the expression of eNOS in HVEC induced by high glucose

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、凋亡、NO分泌等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。HUVEC的凋亡與PI3K/ AKT信號(hào)通路密切相關(guān)［18］。高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡是通過(guò)PI3K/ AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的［19－20］。因此激活PI3K/ AKT信號(hào)通路一定程度上可維持HUVEC細(xì)胞活性。并且已報(bào)道立普妥可以通過(guò)激活PI3K/ AKT通路來(lái)抑制谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元損傷［21］。立普妥可通過(guò)激活PI3K/ AKT信號(hào)通路來(lái)GK大鼠心肌缺血再灌注損傷［22］。立普妥可通過(guò)激活PI3K/ AKT/ GSK3β信號(hào)通路來(lái)減輕缺血復(fù)合冷應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷［23］。立普妥可以通過(guò)激活PI3K/ AKT/ mTOR通路來(lái)刺激大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)［24］。與上述報(bào)告類似，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)使PI3K表達(dá)量及AKT磷酸化水平顯著降低，給予一定劑量立普妥能使PI3K表達(dá)量及AKT磷酸化水平顯著提高，說(shuō)明立普妥可通過(guò)激活PI3K/ AKT信號(hào)通路來(lái)維持內(nèi)皮細(xì)胞存活。

糖尿病造成PI3K/ AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)的失活，eNOS是調(diào)控內(nèi)皮源性一氧化氮產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，亦受PI3K/ AKT信號(hào)通路調(diào)控。高胰島素可通過(guò)PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路損傷HUVEC，產(chǎn)生胰島素抵抗等代謝綜合征及2型糖尿病［25］。胰高血糖素樣肽-1能減輕高糖引起的HUVEC凋亡，與激活PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路有關(guān)［26］。骨鈣蛋白可通過(guò)激活PI3K/ AKT/ eNOS通路減輕高脂飲食誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張損傷［27］。羅格列酮［28］，α-亞麻酸［29］可通過(guò)PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。從而進(jìn)一步說(shuō)明，立普妥也是通過(guò)PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路減輕高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。

綜上所述，立普妥可抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞活力改善細(xì)胞形態(tài)，與激活PI3K/ AKT/ eNOS信號(hào)通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Sardar P，Udell JA，Chatterjee S，et al. Effect of intensive versus standard blood glucose control in patients with type 2 diabetes mellitus in different regions of the world：systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials［J］. J Am Heart Assoc，2015，4（5）.

［2］ Stubbs B，Vancampfort D，De Hert M，et al. The prevalence and predictors of type two diabetes mellitus in people with schizophrenia：a systematic review and comparative meta-analysis ［J］. Acta Psychiatr Scand，2015.

［3］ 李運(yùn)成.阿托伐他汀對(duì)2型糖尿病合并急性腦梗死患者血清內(nèi)脂素的干預(yù)作用［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2014，9（31）：131 －132.

［4］ 郭雅卿，趙丹寧，鞏建萍，等.不同劑量阿托伐他汀對(duì)老年2型糖尿病患者維生素D和骨密度的影響［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14（7A）：2169－2171.

［5］ 張建寧.超聲觀察立普妥逆轉(zhuǎn)2型糖尿病患者動(dòng)脈硬化斑塊的療效評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2012，20（10）：148－149.

［6］ 劉驍.不同劑量阿托伐他汀對(duì)老年ACS患者血漿hs-CRP及NT-proBNP表達(dá)的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（12）：1532 －1533.

［7］ 李錄，邱榮榮，賈紹斌，等.阿托伐他汀調(diào)節(jié)Bcl-2/ Bax蛋白表達(dá)抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（30）：24－27.

［8］ 張秀梅，于曉玲，申玉超，等.阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接的影響［J］.中國(guó)藥房，2013，24 （5）：412－415.

［9］ 牛榮華，毛德軍，臧運(yùn)華，等.阿托伐他汀下調(diào)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CD40配體的表達(dá)［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)，2014，34（3）：237－241.

［10］ 謝彬，呂湛，茍連平，等.阿托伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/ Bax蛋白表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，18（12）：943－947.

［11］ Song H，Wu F，Zhang Y，et al. Irisin promotes human umbilical vein endothelial cell proliferation through the ERK signaling pathway and partly suppresses high glucose-induced apoptosis ［J］. PLoS One，2014，9（10）：e110273.

［12］ Hou Q，Lei M，Hu K，et al. The effects of high glucose levels on reactive oxygen species-induced apoptosis and involved signaling in human vascular endothelial cells［J］. Cardiovasc Toxicol，2015，15（2）：140－146.

［13］ 李敏，孫玲，李紅玲，等.阿托伐他汀減輕氧化型低密度脂蛋白導(dǎo)致的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（5）：679－683.

［14］ 吳仕平，陳明.替米沙坦聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)糖尿病大鼠內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、功能的影響［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，18（7）：542－546.

［15］ 高艷芳，湯嘉寧.阿托伐他汀與氨氯地平對(duì)ox-LDL損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1和eNOS表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥物與臨床，2012，12（7）：884－886.

［16］ 李艷偉，于曉玲，申玉超.阿托伐他汀對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路及相關(guān)因子表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥房，2014，25（17）：1574－1577.

［17］ Wassmann S，Laufs U，Baumer AT，et al. HMG-CoA reductase inhibitors improve endothelial dysfunction in normocholesterolemic hypertension via reduced production of reactive oxygen species［J］. Hypertension，2001，37（6）：1450 －1457.

［18］ Li P，Guo X，Lei P，et al. PI3K/ Akt/ uncoupling protein 2 signaling pathway may be involved in cell senescence and apoptosis induced by angiotensin II in human vascular endothelial cells［J］. Mol Biol Rep，2014，41（10）：6931－6937.

［19］ Chen HF，Liu SJ，Chen G. Heat shock protein 27 phosphorylation in the proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by high glucose through the phosphoinositide 3kinase/ Akt and extracellular signalregulated kinase 1/2 pathways［J］. Mol Med Rep，2015， 11（2）：1504－1508.

［20］ Sheu ML，Ho FM，Yang RS，et al. High glucose induces human endothelial cell apoptosis through a phosphoinositide 3-kinaseregulated cyclooxygenase-2 pathway［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25（3）：539－545.

［21］ 丁奇，董燕，金英，等.阿托伐他汀對(duì)谷氨酸引起大鼠神經(jīng)元損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26 （12）：1635－1640.

［22］ 程振東，吳靈振，郭進(jìn)建，等.阿托伐他汀后處理對(duì)GK大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（8）：709－713.

［23］ 黃茶花，謝遙，黃曉，等.阿托伐他汀減輕缺血復(fù)合冷應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011（11）：1200 －1204.

［24］ 屈文慧，郁盛雪，隋海娟，等.阿托伐他汀通過(guò)激活PI3K/ Akt/ mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（2）：150－155.

［25］ Madonna R，De Caterina R. Prolonged exposure to high insulin impairs the endothelial PI3-kinase/ Akt/ nitric oxide signalling ［J］. Thromb Haemost，2009，101（2）：345－350.

［26］ Yuan X，Chen K，He H，et al.［Effect of GLP-1 on high glucose-induced human umbilical vein endothelial cell apoptosis and mechanism］［J］. Zhongnan Daxue Xuebao Yixue Ban，2013，38（10）：1029－1034.

［27］ Dou J，Li H，Ma X，et al. Osteocalcin attenuates high fat dietinduced impairment of endothelium-dependent relaxation through Akt/ eNOS-dependent pathway［J］. Cardiovasc Diabetol，2014，13：74.

［28］ Wu J，Lei MX，Xie XY，et al. Rosiglitazone inhibits high glucose-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells through the PI3K/ Akt/ eNOS pathway［J］. Can J Physiol Pharmacol，2009，87（7）：549－555.

［29］ Zhang W，Wang R，Han SF，et al. Alpha-linolenic acid attenuates high glucose-induced apoptosis in cultured human umbilical vein endothelial cells via PI3K/ Akt/ eNOS pathway ［J］. Nutrition，2007，23（10）：762－770.

〔修回日期〕2016－01－10

Effect of lipitor on high glucose-induced HUVEC apoptosis and PI3K/ AKT/ eNOS signal pathway

LIU Zhi-hui
（Department Cardiovascular of the First People’s Hospital，Jingdezhen，Jiangxi Jingdezhen 333000，China）

【Abstract】Objectives To explore effect of lipitor on apoptosis and phosphatidyl inositol-3-kinase（PI3K）/ protein kinase B（AKT）/ endothelial nitric oxide synthase（eNOS）signal pathway in high glucose-induced human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）. Methods The cases were randomly divided into normal control group，model control group（33. 3 mol/ L glucose），lipitor low，medium，high-dose group（0. 1，1，10 μmol/ L lipitor）. The viability of HUVEC was detected by MTT assay. The morphology of HUVEC was photographed by inverted microscope. The apoptosis of HUVEC was examed by Annexin V-FITC/ PI flow dual-staining method. The concertration of NO in HUVEC supernatant was exmaed by Gries method. The activation of PI3K/ AKT and expression of eNOS was assayed by western blot. Results HUVEC was shrinkage，rounded and brighten，the viability of HUVEC decreased，early and late apoptosis rate of HUVEC increased significantly，the level of NO，eNOS，PI3K and AKT phosphorylation also reduced in model control group（P＜0. 01）. 1，10 μmol/ L lipitor improved HUVEC morphology，increased HUVEC’viability and expression of PI3K（P＜0. 05）. 0. 1，1，10 μmol/ L lipitor suppressed HUVEC’apoptosis，increased the concentration of NO，expression of eNOS and phosphorylation of AKT（P＜0. 05）. Conclusion These results suggested lipitor exert anti-apoptosis in high glucose -induced HUVEC，which might be related to PI3K/ AKT/ eNOS signal pathway.

【Key words】Lipitor；HUVEC；Apoptosis；PI3K/ AKT/ eNOS signal pathway

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0058-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 012