H-1細小病毒抗體ELISA檢測方法的建立與應用

付 瑞，李曉波，王淑菁，王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，岳秉飛，賀爭鳴（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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H-1細小病毒抗體ELISA檢測方法的建立與應用

付 瑞，李曉波，王淑菁，王 吉，衛(wèi) 禮，鞏 薇，岳秉飛，賀爭鳴
（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 建立H-1細小病毒抗體的ELISA檢測方法，并進行初步應用。方法 采用大鼠神經膠質瘤細胞C6培養(yǎng)大鼠H-1細小病毒，制備包被抗原，采用純化后抗原建立該病毒的ELISA檢測方法；將建立的方法與國外同類試劑盒進行比對，考察該方法的特異性和靈敏度。同時，應用該方法對35份大鼠血清進行檢測。結果所建立的方法可檢測出稀釋1280倍的陽性血清；與犬細小病毒、小鼠微小病毒和豬細小病毒陽性血清均無交叉反應；與大鼠細小KRV病毒有交叉反應；對35份大鼠血清進行檢測，結果均為陰性，與國外同類試劑盒結果一致。結論 所建立的H-1細小病毒ELISA檢測方法具有良好的種屬特異性和靈敏度，可用于大鼠血清中H-1細小病毒抗體檢測。

【關鍵詞】H-1細小病毒；ELISA；抗體檢測

大鼠細小病毒（Rat parvovirus，RPV）是對實驗大鼠危害最為嚴重的病毒之一。成年大鼠感染多無臨床癥狀，免疫抑制等因素可激發(fā)本病。RPV還可污染腫瘤移植物和細胞系，對實驗研究產生嚴重干擾［1］。Toolan［2］從經大鼠傳代的人腫瘤細胞系（HEP-1）分離到第2株大鼠細小病毒，通常稱為H-1細小病毒，又稱Toolan病毒。H-1細小病毒屬于細小病毒科，其天然宿主為大鼠，病毒粒子直徑為20～25 nm，為無囊膜單鏈DNA病毒，其核酸約為5100 nt［3］。

我國實驗動物國家標準（GB 14922. 2－2011）規(guī)定大鼠細小病毒KRV和H-1株為SPF實驗大鼠病毒的必檢項目。本研究采用可傳代的大鼠神經膠質瘤細胞C6培養(yǎng)H-1細小病毒［4］，從而建立了H-1細小病毒抗體的ELISA檢測方法。

1　材料和方法

1.1毒株和細胞

H-1細小病毒購自美國標準培養(yǎng)物保存中心（ATCC，VR-356），大鼠神經膠質瘤細胞C6中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2其它試劑及樣品

商品化H-1 ELISA抗體檢測試劑盒購自美國XpressBio公司；豬細小病毒、小鼠微小病毒和犬細小病毒陰陽對照血清均為科室制備保存；山羊抗大鼠IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗豬IgGHRP和山羊抗犬IgG-HRP均購自KPL公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；35份清潔級與SPF級大鼠血清樣本來自北京地區(qū)實驗動物監(jiān)督檢驗收集樣品。

1.3病毒培養(yǎng)

將C6細胞按照6×104個/ mL的濃度接種于細胞培養(yǎng)瓶，采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)及培養(yǎng)6 h后將H-1病毒液以0. 02 MOI的比例加入培養(yǎng)瓶中。置含有5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，待細胞長滿單層后，棄去瓶中培養(yǎng)液，加入等體積的含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，完全病變的病毒凍存于－70℃保存。

1.4病毒滴定

將C6細胞按照6×104個/ mL的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)6 h后將H-1病毒液以10－1～10－11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有C6細胞的96孔細胞培養(yǎng)板（1～11列），每個稀釋度接種1列（8孔），第12列不加病毒，作為細胞對照。置含有5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中觀察10 d，記錄結果。

1.5抗原的制備及純化

正常抗原：C6細胞按照6×104個/ mL的濃度接種于細胞培養(yǎng)瓶，待長滿單層后，用10%ATV常規(guī)法消化，PBS洗滌，1000 r/ min離心10 min，沉淀溶于適量PBS凍融3次后，超聲破碎，10000 r/ min離心30 min，取上清，測定蛋白含量。分裝后作為正?？乖瓋龃嬗冢?0℃?zhèn)溆谩?/p>

特異抗原：收獲H-1病毒，于4℃，10000 r/ min離心1 h，取上清于4℃，40000 r/ min離心3 h，收集沉淀于適量PBS中。超聲破碎后，再經20%蔗糖離心，采用紫外分光光度法測定抗原蛋白含量。分裝后作為正?？乖瓋龃嬗冢?0℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6毒種的PCR鑒定

常規(guī)方法提取病毒DNA，進行PCR擴增，瓊脂糖電泳后應能觀察到183 bp的可見目的條帶。PCR產物送測序，測序結果與NCBI核酸數據庫比對。

1.7判斷標準的確定

依據實驗動物國家標準選擇OD490來讀取吸光度。在陰、陽對照血清成立的情況下，待檢血清特異抗原孔A值≥0. 2、待檢血清特異抗原孔A值/陰性對照特異抗原孔A值（P/ N值）≥2. 1，判為陽性。

1.8正?？乖c特異抗原、酶結合物最佳工作濃度的確定

將陽性血清、陰性血清、包被抗原、HRP標記的山羊抗大鼠IgG進行系列倍比稀釋，根據方陣滴定法確定試驗的最適工作條件。

1.9精密性測定

取陰性血清與陽性血清各一份，1∶40稀釋后，各用一塊純化后H-1細小病毒包被的96孔板測定。得到的結果分別計算平均值及標準差，計算板內變異系數（CV）。

1.10特異性測定

用已建立的ELISA法和XpressBio公司檢測試劑盒分別檢測大鼠細小KRV病毒、小鼠微小病毒（MVM）、犬細小病毒（CPV）和豬細小病毒（PPV）陰、陽性血清，同時設H-1病毒標準陰、陽性血清對照。

1.11重復性測定

取純化后H-1抗原包被的96孔板，分別對20份血清（其中陰性血清15份，陽性血清5份）重復測定三次，計算結果的符合率。

1.12穩(wěn)定性測定

用純化后H-1抗原包被96孔ELISA板11塊，其中一塊保存于4℃，其余10塊置于37℃，分別于第1－10天每天取出一塊放4℃保存，同時檢測同一批15份陰性血清和5份陽性血清。

1.13敏感性測定

將H－1陽性對照血清1∶40至1∶2560系列稀釋后，用所建立的ELISA方法檢測，以確定所建立方法的敏感性。

1.14與商品化試劑盒的比較

用購自XpressBio公司的Toolan’s H-1 Virus Rat檢測試劑盒與本研究所建立的ELISA方法同時檢測20份大鼠血清（其中15份陰性血清，5份陽性血清），對所建立的ELISA檢測方法進行驗證。

1.15H-1ELISA抗體檢測方法的應用

用所建立的方法檢測來自北京地區(qū)實驗動物監(jiān)督檢驗的35份大鼠血清。

2　結果

2.1病毒培養(yǎng)結果

病毒經C6細胞培養(yǎng)72 h后完全病變，正常細胞對照與病變細胞結果見圖1與圖2。

圖1　正常C6細胞培養(yǎng)72 h后Fig. 1 C6 cell was cultured 72 h

圖2　H-1培養(yǎng)72 h后Fig. 2 H-1 virus was cultured 72 h

2.2病毒滴定結果

采用C6細胞96孔細胞病變法對H-1細小病毒進行滴定，重復測定二次滴定結果按照Karber法計算。（Karber法是計算病毒感染力的一種方法，其公式為：LgTCID50= L-d（S-0. 5）其中：L =最高稀釋度的對數；d =稀釋對數之間的差；s =陽性孔比率總和），H-1細小病毒滴度為6. 5 LgTCID50/0. 1 mL。

2.3抗原的制備和純化

分別制備和純化C6細胞和H-1細小病毒作為正?？乖吞禺惪乖?，采用分光光度法測定正?？乖吞禺惪乖臐舛龋渲蠧6細胞正?？乖瓭舛葹?. 509 mg/ mL；H-1細小病毒特異抗原濃度為6. 597 mg/ mL。

2.4毒種的PCR鑒定

用建立的PCR方法分別擴增H-1、KRV、小鼠微小病毒（MVM）、豬細小病毒（PPV），結果顯示，在以H-1為模板時出現183 bp的單一目的條帶，以KRV、小鼠微小病毒（MVM）、豬細小病毒（PPV）為模板時無目的條帶出現（圖3）。

圖3　H-1細小病毒株PCR特異性結果Note：M：100 bp marker；1：H-1；2：KRV；3：MVM；4：PPV.Fig. 3 Specificity of H-1 Virus PCR

以H-1 DNA為模板，能擴增到183 bp的可見目的條帶，PCR產物送生工測序，測序結果與NCBI核酸數據庫比對，與H-1細小病毒同源性達到97%。

2.5最佳工作條件確定

采用棋盤滴定法確定H-1細小病毒ELISA方法中正常抗原、特異抗原及HRP標記山羊抗大鼠IgG最佳工作濃度，其中正常抗原工作濃度為0. 2 μg/ mL，特異抗原工作濃度為5 μg/ mL，HRP標記山羊抗大鼠IgG工作稀釋度為1∶10000。

2.6精密性測定

取陰性血清與陽性血清各一份，1∶40稀釋后，各用一塊純化后H-1細小病毒包被的96孔板測定。得到的結果分別計算平均值及標準差，計算板內變異系數（CV），經計算，陰性血清與陽性血清CV值均小于15%（表1）。

表1　H-1細小病毒ELISA方法精密性檢測Tab. 1 The precision of ELISA method for H-1 parvovirus

2.7特異性測定

用已建立的ELISA法和XpressBio公司的H-1檢測試劑盒分別檢測大鼠細小KRV病毒、小鼠微小病毒（MVM）、犬細小病毒（CPV）和豬細小病毒（PPV）陰、陽性血清，同時設H-1病毒標準陰、陽性血清對照。結果顯示H-1細小病毒和KRV病毒陽性血清檢測為陽性，其余病毒陰性及陽性血清檢測均為陰性，所建立的H-1細小病毒ELISA方法有良好的種屬特異性（表2）。

表2　H-1細小病毒ELISA方法特異性試驗結果Tab. 2 The specificity of ELISA method for H-1 parvovirus

2.8檢測方法重復性測定

將15份陰性血清和5份陽性血清1：40稀釋后，重復測定三次，經計算分析三次測定的總符合率為100%。三次測定陰性血清與陽性血清各自的符合率見表3.

表3　H-1細小病毒ELISA方法重復性檢測Tab. 3 Repeatability of ELISA method for H-1 parvovirus

2.9檢測方法穩(wěn)定性測定

37℃放置0～10 d的H-1細小病毒包被11塊抗原包被板，同時檢測陽性血清5份，陰性血清15份。比較檢測結果的P/ N值（表4）。其中陰性血清P/ N值均小于2. 1，陽性血清P/ N值均大于2. 1，符合判斷標準。

2.10檢測方法敏感性測定

用所建立的ELISA方法檢測經倍比稀釋的陽性血清，以確定該方法的敏感性（表5）。經檢測，陽性血清進行1280倍稀釋后P/ N值仍大于2. 1，該方法敏感性為1∶1280。

2.11與商品化試劑盒的比較

用所建立的H-1細小病毒ELISA檢測方法與XpressBio公司的H-1 ELISA檢測試劑盒同時對15份陰性血清和5份陽性血清進行檢測，檢測結果顯示所建立的方法與商品化試劑盒的符合率為100%（表6）。

2.12H-1細小病毒ELISA檢測方法的初步應用

采用建立的H-1細小病毒ELISA檢測方法檢測XpressBio公司H-1試劑盒檢測為陰性的大鼠血清35份，經檢測均為陰性。

表4　H-1細小病毒ELISA方法穩(wěn)定性檢測Tab. 4 Stability of ELISA method for H-1 parvovirus

表5　H-1細小病毒ELISA方法敏感性測定Tab. 5 Sensitivity of ELISA method for H-1 parvovirus

表6　兩種ELISA檢測試劑結果比較Tab. 6 Comparison of two kinds of ELISA methods

3　討論

GB / T 14926. 31－2001中建議采用大鼠胚胎原代細胞（primary rat embryo cells，RE）培養(yǎng)H-1病毒。用RE細胞培養(yǎng)H-1病毒，費時、費力、易污染，并需要使用大量懷孕大鼠，在給H-1病毒的培養(yǎng)帶來了諸多困難的同時也不符合動物福利的原則。劉先菊等［4］報導可通過大鼠神經膠質瘤細胞C6可傳代培養(yǎng)H-1細小病毒，為該病毒的大規(guī)模培養(yǎng)與制備提供了基礎。

本研究首次建立了通過傳代細胞培養(yǎng)H-1細小病毒的ELISA檢測方法。采用大鼠腦膠質瘤細胞C6對H-1細小病毒進行培養(yǎng)，得到病毒滴度為為6. 5LgTCID50/0. 1 mL的病毒。該病毒經PCR方法驗證為H-1細小病毒，與NCBI的序列進行比對，符合率為97%。通過對獲得的病毒進行超速離心和蔗糖梯度密度離心進行純化，得到純化的H-1細小病毒抗原，抗原濃度為6. 597 mg/ mL。用該抗原作為包被抗原，建立H-1細小病毒的全病毒ELISA抗體檢測方法。通過對方法的敏感性、穩(wěn)定性、重復性、特異性和精確性進行驗證，確定該方法可檢測出大于1：1280稀釋的陽性血清，37℃放置10 d不影響其檢測效果。所建立的檢測方法與XpressBio公司的H-1檢測試劑盒均與犬細小病毒、豬細小病毒和小鼠細小病毒陽性血清間無交叉反應，但兩種方法均與大鼠細小病毒KRV有交叉反應，經NCBI比對，H-1細小病毒與大鼠細小病毒KRV的序列同源性達到90%，其中兩種病毒非結構蛋白NS-1同源性為99%，非結構蛋白NS-2同源性為98%，結構蛋白VP-1同源性為81%，結構蛋白VP-2同源性為78%，通過序列比對說明H-1細小病毒和KRV細小病毒之間具有交叉抗原，需要針對兩種病毒結構蛋白的差異分別建立檢測方法來進行區(qū)分，有待進一步研究。

本方法的建立，可有效補充國家標準中H-1細小病毒檢測方法，并可代替國外同類試劑盒對大鼠血清中H-1細小病毒抗體進行檢測。

參考文獻：

［1］ 田克恭.實驗動物病毒性疾?。跰］.北京：農業(yè)出版社. 1992：126－132.

［2］ 田克恭，賀爭鳴，劉群，等.實驗動物疫病學［M］.北京：中國農業(yè)出版社. 2014：205.

［3］ Karsten Geletneky，Andreas D. Hartkopf，Robert Krempien，et al. Therapeutic implications of the enhanced short and longtermcytotoxicity of radiation treatment followed by oncolytic parvovirusH－1 infection in high-grade glioma cells［J］. Bioengineered Bugs，2010，1：429－433.

［4］ 劉先菊，佟巍，張麗芳，等.大鼠細小病毒H－1株培養(yǎng)方法的建立［J］.中國實驗動物學報，2011，19：495－498.

〔修回日期〕2015－11－08

Establishment and application of ELISA method for H-1 parvovirus

FU Rui，LI Xiao-bo，WANG Shu-jing，WANG Ji，WEI Li，GONG Wei，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To establish ELISA method for H-1 parvovirus，and to apply it in detection. Method Cultured the H-1 parvovirus in rat glioma cell line C6，prepared the viral antigen for coating. Used the purified viral antigen to establish the ELISA method，and compared the ELISA method with the ELISA kit from XpressBio company. Then applied the ELISA method in detection of 35 rat serums. Results The positive serum which be diluted to 1280 can be detected by the ELISA method，there have not cross reaction with positive serum of CPV，MVM and PPV，but there has cross reaction with KRV. 35 pieces of rat serums were detected by the ELISA method，they were all negative，the results were consistent with the kit from XpressBio company. Conclusions The sensitivity and species specificity of the ELISA method for H-1 parvovirus were suitable，the method can be used in detection of H-1 parvovirus in rat serum.

【Key words】H-1 parvovirus；ELISA；Detection of antibody

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0075-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 015

［基金項目］國家科技支撐計劃“實驗用動物病原分子生物學快速檢測新技術研究與應用”（2015BAI07B02）。

［作者簡介］付瑞（1978－），男，副研究員，研究方向：實驗動物病毒學，Email：furui78@126. com。

［通訊作者］賀爭鳴（1957－），男，研究員，研究方向：實驗動物微生物學，Email：zhengminghe57@163. com。