4個白楊新品種和父母本及近緣種的SRAP遺傳分析與指紋圖譜構(gòu)建

樊　蓉，樊軍鋒,李周岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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4個白楊新品種和父母本及近緣種的SRAP遺傳分析與指紋圖譜構(gòu)建

樊蓉，樊軍鋒,李周岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 對外觀相近、較難區(qū)分的4個白楊新品種及其父母本和3個近緣種進行遺傳分析并構(gòu)建指紋圖譜，為這些品種在生產(chǎn)應(yīng)用中的分子鑒定提供技術(shù)依據(jù)?！痉椒ā?采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對03-4-9、03-4-22、03-5-17和03-6-11 4個白楊新品種及I-101楊、截葉毛白楊、84K、毛白楊30號、銀毛楊共9個白楊品種開展遺傳分析及指紋圖譜構(gòu)建?！窘Y(jié)果】 14對多態(tài)性高的SRAP引物對9個白楊品種共擴增出167條條帶，平均每對引物擴增條帶為11.93 條。其中多態(tài)性條帶143條，多態(tài)性比率為85.63%，多態(tài)性高。聚類分析表明，9個白楊品種之間的遺傳相似系數(shù)為0.40～0.76,其中4個白楊新品種與父本截葉毛白楊和毛白楊30號親緣關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)平均值分別為0.65和0.63 ，與母本I-101親緣關(guān)系稍遠，遺傳相似系數(shù)平均值為0.49。利用重復(fù)性好的3對引物(me5/em10、me7/em2 和me7/em3)擴增圖譜構(gòu)建了9個白楊品種的指紋圖譜，每對引物均可將9個白楊品種單獨區(qū)分開?！窘Y(jié)論】 9個白楊品種在SRAP位點有較高的多態(tài)性，SRAP分子標(biāo)記能很好地用于楊樹品種的鑒定及指紋圖譜構(gòu)建。

[關(guān)鍵詞]楊樹；雜種；SRAP；分子標(biāo)記；指紋圖譜

楊樹(Populus)生長快、抗逆性(抗旱、抗寒、抗病蟲等)強，適應(yīng)范圍廣，是我國用材林、防護林及園林綠化的主要造林樹種，經(jīng)濟、生態(tài)、園林價值大[1-3]。

楊樹品種多起源于雜交育種，由于長期雜交，各品種之間遺傳關(guān)系復(fù)雜，不少品種之間親緣關(guān)系較近，形態(tài)特征差異很小，僅通過外觀形態(tài)特征很難區(qū)分，嚴重影響其品種鑒定、知識產(chǎn)權(quán)保護及良種推廣，因此利用分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確鑒定楊樹品種具有重要意義[4-6]。

序列擴增多態(tài)性 (Sequence related amplified polymphism，SRAP)是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記，是由美國加州大學(xué)蔬菜學(xué)作物系的Li和Quiros[7]于2001年提出的一種使用雙引物的分子標(biāo)記技術(shù)，與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，其突破點在于設(shè)計特殊引物對基因的閱讀框區(qū)域(ORFs)進行擴增，多態(tài)性由各物種間差異大的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列產(chǎn)生[8-10]，提高了擴增結(jié)果和表型相關(guān)性，且并不需要預(yù)知被測物種的序列信息，大大降低了引物開發(fā)成本。 SRAP現(xiàn)已在農(nóng)業(yè)作物遺傳多樣性分析、基因定位、比較基因組學(xué)以及雜種優(yōu)勢預(yù)測等方面有不少應(yīng)用[11-13]，但在林木中應(yīng)用較少[6，14]。

03-4-9、03-4-22、03-5-17、03-6-11系西北農(nóng)林科技大學(xué)新選育出來的4個白楊新品種，其母本I-101楊，是從意大利引進的銀白楊，父本截葉毛白楊，為毛白楊變種[1]。這6個品種與84K、毛白楊30號和銀毛楊3個近緣品種的外觀形態(tài)特征，特別是苗期形態(tài)特征非常接近，較難區(qū)別，在生產(chǎn)中易造成混亂。本試驗利用SRAP分子標(biāo)記對4個楊樹新品種、其父母本及3個近緣種開展遺傳分析，構(gòu)建品種指紋圖譜，以期為楊樹新品種的分子鑒定、生產(chǎn)推廣提供技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

2014年5月在西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河試驗站采集9個供試白楊品種(表1)苗木的幼嫩葉片，錫紙包裹，分別編號后，置于液氮罐中帶回。

表 1　供試白楊品種及其遺傳背景

1.2DNA提取

用TIANGEN植物基因組提取試劑盒提取楊樹葉片基因組DNA，8 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀測電泳條帶(制膠時加入1～2 μL EB衍生物Golden view，以便在紫外燈下快速準(zhǔn)確地觀察條帶)。最后，比照亮度和DNA質(zhì)量濃度對照表，將DNA質(zhì)量濃度調(diào)至30 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.3SRAP反應(yīng)

1.3.1引物的篩選與合成引物序列選用Li等[7]于2001年發(fā)表的引物序列，其中9條正向引物和10條反向引物的序列信息見表2。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2PCR擴增體系及程序參照陳罡等[9]優(yōu)化后的楊樹SRAP反應(yīng)體系，PCR的擴增反應(yīng)體系為：總體積20 μL，其中2×TapMasterMix(康為世紀)10 μL，10 μmol/L正向、反向引物各1 μL，模板1 μL(50 ng)，RNase-Free Water 7 μL。

PCR擴增采用復(fù)性變溫法，程序如下(兩步反應(yīng))：(1)94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；(2)94 ℃變性1 min，54 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。

1.3.3PCR擴增產(chǎn)物的檢測用 8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測條帶(1×TBE),上樣5 μL，穩(wěn)壓260 V。電泳130 min后，用譚碧玥等[10]的改良銀染法染色，并拍照分析。

表 2　鑒別白楊及其近緣種的SRAP引物

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

采用分子標(biāo)記條帶統(tǒng)計分析常用的NTSYSpc version2.10聚類分析軟件處理數(shù)據(jù)。首先人工統(tǒng)計膠上條帶的有無和遷移距離，建立(0，1)數(shù)據(jù)陣(將膠上同一遷移位置處有帶記為1，無帶記為0)。然后將數(shù)據(jù)陣建立Excel數(shù)據(jù)表格，導(dǎo)入該軟件，利用公式GS=m/(m+n)和GD=1-GS(m為基因型間共有帶數(shù)目，n為差異帶數(shù)目)計算遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)，最后采用UPGMA數(shù)據(jù)聚類算法進行品種聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1SRAP引物對9個白楊品種的擴增結(jié)果及多態(tài)性分析

9個正向引物和10個反向引物共可組成90對引物組合，經(jīng)預(yù)試驗，最終從90對引物中篩選出14對多態(tài)性高的引物對9個試供白楊品種進行正式擴增，擴增結(jié)果見表3。

表 3　14對SRAP引物對9個白楊品種的擴增結(jié)果

從表3可知,14對引物共擴增出167條條帶(只計清晰條帶)，平均每對引物11.93 條，多態(tài)性條帶143條，多態(tài)性比率為85.63%，多態(tài)性高；14對引物中，me5/em7擴增的條帶數(shù)最多，為26條，me8/em4擴增的條帶數(shù)最少，僅有2條。me5/em10、 me7/em2 和me7/em3 3對引物擴增結(jié)果見圖1。

圖 1　me5/em10、me7/em2 和me7/em3 3對引物對9個白楊品種的擴增圖譜

2.29個白楊品種間的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

統(tǒng)計各引物在9個白楊品種上的SRAP擴增條帶，建立(0,1)矩陣，利用NTSYSpc version2.10聚類分析軟件計算各品種間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果見表4。 從表4可知，9個白楊品種間的遺傳相似系數(shù)變化于0.40～0.76。03-6-11與03-5-17，03-4-9與03-5-17來自相同的雜交組合，遺傳背景相同，遺傳相似系數(shù)最大，均為0.76；03-6-11和84K遺傳相似程度相對最小，遺傳相似系數(shù)為0.40。其余各品種遺傳相似系數(shù)介于以上兩類之間。

表 4　9個白楊品種間的遺傳相似系數(shù)

用9個白楊品種間的遺傳相似系數(shù)，繪制出9個品種的樹狀聚類圖，結(jié)果見圖2。

圖 2　9個白楊品種的聚類分析結(jié)果

由圖2可知，9個白楊品種在遺傳相似系數(shù)0.49 水平以下分為2個類群。在類群Ⅰ中，03-5-17、03-4-9、03-6-11、截葉毛白楊、03-4-22在遺傳相似系數(shù)為0.65水平上先聚在一起，再在遺傳相似系數(shù)為0.63時與毛白楊30號聚為一類，說明4個白楊雜交新品種之間及其與父本截葉毛白楊和毛白楊30號之間的遺傳相似程度最高。在類群Ⅱ中，4個白楊新品種的母本I-101與84K先在遺傳相似系數(shù)為0.64時聚為一類，然后在遺傳相似系數(shù)為0.58時與銀毛楊聚為一類，說明此3個品種間有較高的遺傳相似度，且與銀毛楊相比，I-101與84K遺傳相似程度較高。所有9個白楊品種最終在遺傳相似系數(shù)大約為0.49水平上聚為一類，說明這9個品種之間總體上仍有較高的遺傳相似性。

2.39個白楊品種的分子指紋圖譜

參照14對SRAP引物的擴增結(jié)果，最終選取me5/em10、me7/em2 和me7/em3 3對擴增條帶清晰、重復(fù)性好的引物擴增結(jié)果，構(gòu)建9個白楊品種的指紋圖譜(表5)，發(fā)現(xiàn)每個引物均可將9個品種單獨區(qū)分開。

表 5　基于me5/em10、me7/em2 和me7/em3引物對擴增結(jié)果構(gòu)建的9個白楊品種的指紋圖譜

注：1.03-5-17；2.I-101；3.毛白楊30號；4.84K；5.03-4-22；6.03-4-9；7.銀毛楊；8.03-6-11；9.截葉毛白楊。

Note：1.03-5-17；2.I-101；3.P.tomentosaNo.30；4.84K；5.03-4-22；6.03-4-9；7.P.alba(China)×P.tomentosa；8.03-6-11；9.P.tomentosavar.truncata.

3結(jié)論與討論

用從90對SRAP引物組合中選出的14對多態(tài)性引物，對9個白楊品種的DNA進行PCR擴增，共擴增出167條清晰條帶，平均每對引物擴增條帶為 11.93 條，其中多態(tài)性條帶143條，多態(tài)性比率為85.63%，多態(tài)性高。

各楊樹品種之間的遺傳相似系數(shù)為0.40～0.76，即品種間遺傳相似程度變幅較大，各品種之間親緣關(guān)系遠近有一定差異，但4個新品種之間遺傳相似系數(shù)較大(0.67～0.76)，親緣關(guān)系較近。

選取擴增效果較好、條帶清晰、重復(fù)性較高的3對引物的擴增圖譜，構(gòu)建了4個白楊新品種、父母本及3個近緣種的分子指紋圖譜，為新品種的分子鑒定、知識產(chǎn)權(quán)保護、生產(chǎn)推廣提供了技術(shù)依據(jù)。

聚類分析中，4個白楊新品種在遺傳相似系數(shù)較高水平上與父本截葉毛白楊[2]較早聚為一類(類群Ⅰ)，而后與母本I-101在遺傳相似系數(shù)較低水平上聚為同類，可能是由于這4個新品種在人工選育時更多地選擇了父本的優(yōu)良性狀而較少選擇母本性狀造成。經(jīng)大田觀察，這4個新品種在葉、芽、物候等多個性狀上與父本截葉毛白楊非常接近，這一事實也很好地解釋了上述推測。

母本I-101(銀白楊)與84K(銀白楊×腺毛楊)首先聚為一類，隨后與銀毛楊(銀白楊(中國)×毛白楊)聚為同類(類群Ⅱ)，主要是由于這3個品種均含有銀白楊遺傳成分。

銀毛楊為銀白楊(中國)×毛白楊雜交組合中選育出的一個白楊雜種[1]，與4個白楊新品種(均來源于銀白楊(意大利)×毛白楊雜交組合，但雜交所用銀白楊產(chǎn)地為意大利，毛白楊為截葉毛白楊)遺傳背景最為接近，理論而言應(yīng)與4個新品種最先聚在一起。但本試驗中銀毛楊在較低相似系數(shù)(0.49)水平上才與4個新品種聚成同類，與理論推測有一定差距。其原因可能是由于母本意大利銀白楊與中國銀白楊、父本毛白楊與截葉毛白楊(毛白楊系雜種起源，種內(nèi)不同類型及單株之間遺傳變異很大)之間基因差異較大造成的。

SRAP是一種相對理想的構(gòu)建指紋圖譜的新型分子標(biāo)記，在農(nóng)作物中已有較多應(yīng)用[11-13]。本試驗首次采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對4個白楊新品種與其父母本及3個近緣種進行了SRAP遺傳分析與指紋圖譜構(gòu)建，結(jié)果證明SRAP同樣適用于楊樹的遺傳分析與指紋圖譜構(gòu)建，擴增條帶清晰、多態(tài)性高，效果好。

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SRAP markers based identification and fingerprinting of 4 new hybrids,male and female parents and 3 related varities ofPopulusL.Sect.LeuceDuby

FAN Rong,FAN Jun-feng,LI Zhou-qi

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 Genetic relationship and DNA-fingerprinting of 9 Populus L.in Sect.Leuce Duby verities (4 new hybrids,male and female parents,and 3 related verities) that were difficult to be distinguished by appearance were investigated using molecular markers technique to improve molecular identification during production.【Method】 SRAP molecular markers were used to conduct genetic analysis and build fingerprints for 03-4-9,03-4-22,03-5-17,03-6-11,P.alba (Italy),P.tomentosa var.truncata,P.alba×P.glandoulsa,P.tomentosa No.30,and P.alba(China)×P.tomentosa.【Result】 A total of 167 bands were amplified with 14 pairs of primers,with the mean of 11.93 per primer.There were 143 polymorphic bands with a ratio of 85.63%.Cluster analysis showed that the genetic similarity coefficients among the 9 varieties were 0.40-0.76,and 4 new hybrids had close genetic relationship with P.tomentosa var.truncata(male parent) and P.tomentosa No.30 with the mean coefficients of 0.65 and 0.63,respectively.The genetic relationship between 4 new hybrids and P.alba (Italy,female parent) was less close with the mean coefficient of 0.49.The fingerprints of 9 varieties were established by amplification map of 3 repeatable primers (me5/em10,me7/em2,and me7/em3),and the 9 varieties could be identified separately. 【Conclusion】 The 9 poplar varieties had high polymorphism in SRAP sites,and SRAP molecular markers technique could be used for identification and fingerprint establishment of Poplar varieties.

Key words:Populus L.;hybrids;SRAP;molecular markers;fingerprinting

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.011

[收稿日期]2014-07-10

[基金項目]國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD01B0302)

[作者簡介]樊蓉(1988-)，女，陜西楊凌人，碩士，主要從事林木遺傳育種、林業(yè)生物技術(shù)研究。E-mail:64112914@qq.com[通信作者]樊軍鋒(1962-)，男，陜西扶風(fēng)人，博士，教授，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail:fanjf28@163.com

[中圖分類號]S792.11

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0081-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.022.html