紫花地丁止癢復(fù)方提取工藝的優(yōu)化

曾海榮， 趙　振， 梁美云， 姚雅綺， 王　冰， 張偉榮

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

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紫花地丁止癢復(fù)方提取工藝的優(yōu)化

曾海榮， 趙振， 梁美云， 姚雅綺， 王冰*， 張偉榮*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

摘要：目的 優(yōu)化紫花地丁止癢復(fù)方的提取工藝。方法 采用L9（34）正交試驗(yàn)，考察浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間3個(gè)因素對提取工藝的影響，HPLC法測定秦皮乙素含有量，以秦皮乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。結(jié)果 最優(yōu)工藝為浸泡30 min，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，秦皮乙素含有量為5.90 mg/g，轉(zhuǎn)移率為58.60％。結(jié)論 該提取工藝合理，操作簡單，樣品質(zhì)量穩(wěn)定，對紫花地丁止癢復(fù)方質(zhì)量控制具有參考意義。

關(guān)鍵詞：紫花地丁止癢復(fù)方；提取工藝；秦皮乙素；正交試驗(yàn)；HPLC法

紫花地丁止癢復(fù)方由紫花地丁、苦參、白鮮皮3味中藥組成，是本校經(jīng)多年使用證明療效確切的臨床驗(yàn)方，該組方簡單，療效顯著，主要用于濕疹、蕁麻疹和皮膚瘙癢癥等臨床皮膚病的治療。方中紫花地丁性味苦寒，歸心、肝經(jīng)，功效清熱解毒，消癰散癤，為君藥，其主要含有香豆素類成分［1］，而秦皮乙素為其有效成分和特征成分［2］，具有抗炎［3］、抗氧化［4］、抗菌、抗病毒等藥理作用［5］；臣以苦參，因其性味苦寒，善祛風(fēng)、殺蟲止癢，為諸多皮膚病所常用；白鮮皮性味苦寒，善清熱燥濕、解毒、祛風(fēng)止癢，為治療皮膚濕疹、濕瘡、疥癬等疾病的常用藥。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［6-10］，采用正交試驗(yàn)方法，考察浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間對復(fù)方中秦皮乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率的影響，優(yōu)選最佳提取工藝，為紫花地丁止癢復(fù)方的提取、質(zhì)量控制及開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，配有四元恒流泵、在線脫氣機(jī)、VWD檢測器（美國Agilent公司）；AT201型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；TC-6K型電子天平（美國雙杰兄弟有限公司）；Milli-Q型純水器（美國Millipore公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；調(diào)溫電熱器（通州市申通電熱器廠）；Rotavapor旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑 紫花地丁（批號(hào)141118-201411）、苦參（批號(hào)141006-201410）、白鮮皮（批號(hào)140821-201408）藥材購自上海康橋中藥飲片有限公司；秦皮乙素（批號(hào)GR-133-140408）對照品購自上海伊洪生物化學(xué)有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純（沃凱公司）；磷酸為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法分析提取物中的秦皮乙素

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 對照品溶液 精密稱取秦皮乙素對照品4.54 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，配成454 μg/mL貯備液。然后，將其依次稀釋成227.0、113.5、56.75、28.36、14.19、7.090、3.550 μg/mL系列對照品溶液。

2.1.1.2 供試品溶液 精密稱取干燥提取物粉末0.02 g，加甲醇溶解，稱定質(zhì)量，超聲溶解15 min，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 測定波長的選擇 將秦皮乙素貯備液稀釋5倍，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描（200～600 nm），最終選擇最大吸收波長為348 nm。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 色譜條件［11-16］Ultimate XB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相乙腈-0.1％磷酸水（18∶82），等度洗脫；檢測波長348 nm；體積流量1 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1。

1.秦皮乙素圖1　HPLC色譜圖

2.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“2.1.1.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1.3.1”項(xiàng)色譜條件下測定。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得到線性方程Y=44.287X+61.492，r=0.999 9，表明秦皮乙素在3.55～227 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.3 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn) 在“2.1.3.1”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取“2.1.1.1”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得峰面積RSD為0.76％，表明儀器精密度良好。然后，分別于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取“2.1.1.2”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，測得峰面積RSD為0.97％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一提取物適量，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，在“2.1.3.1”項(xiàng)色譜條件下測定。結(jié)果，秦皮乙素含有量為5.55 mg/g，RSD為0.18％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取秦皮乙素含有量已知（5.55 mg/g）的提取物粉末9份，精密加入對照品溶液（0.454 mg/mL）適量，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3.1”項(xiàng)色譜條件下測定，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn) 按照處方，分別稱取紫花地丁30 g、白鮮皮15 g、苦參15 g，加適量水浸泡一段時(shí)間，煎煮提取，濃縮，冷凍干燥，即得提取物。

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平安排 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)單因素考察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)提取2次的效果較佳，故采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表對復(fù)方提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以浸泡時(shí)間（A）、加水量（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，結(jié)果見表2。

表2　因素水平

2.2.2 提取方法與結(jié)果分析 按處方稱取紫花地丁、苦參、白鮮皮藥材適量，根據(jù)正交設(shè)計(jì)條件提取2次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3.1”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算秦皮乙素轉(zhuǎn)移率和干膏得率［17］，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

直觀分析顯示，3個(gè)因素的影響程度依次為B>A>C，最佳工藝條件為A2B2C1。由于因素C的離差平方和小于誤差項(xiàng)因素D，故將其并入誤差項(xiàng)計(jì)算。方差分析表明，加水量（B）影響最顯著（p<0.05），選擇B2，而浸泡時(shí)間（A）和提取時(shí)間（C）均無顯著性影響（p>0.05），故可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況作適當(dāng)調(diào)整。最終，優(yōu)選的工藝條件為浸泡30 min，加10倍量水，提取2次，每次1 h。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取紫花地丁30 g、白鮮皮15 g、苦參15 g，共3份，按最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在“2.1.3.1”項(xiàng)色譜條件下測定。結(jié)果，秦皮乙素含有量為5.90 mg/g，RSD為1.35％，轉(zhuǎn)移率為58.60％，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表3　L9（34）正交設(shè)計(jì)結(jié)果

3 討論

單因素試驗(yàn)表明，2次提取比1次提取可轉(zhuǎn)移出更多的秦皮乙素，故從實(shí)驗(yàn)需要及節(jié)約能源角度考慮，選擇2次提??；正交試驗(yàn)顯示，加水量為影響最顯著的因素。紫花地丁為葉類藥材，易吸收水分，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，第一次加8倍量水時(shí)，紫花地丁容易黏壁，不利于提取；加10倍量水時(shí)，提取效果較好，與正交試驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果一致。

現(xiàn)代藥理研究表明，紫花地丁的主要有效成分為黃酮類和香豆素類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用［18-20］，而香豆素類成分秦皮乙素是其有效成分和特征成分之一。由于該成分轉(zhuǎn)移率和干膏得率是評價(jià)水提工藝的關(guān)鍵指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)以兩者綜合評分來優(yōu)選復(fù)方水提工藝，表明其合理可行，可為紫花地丁止癢復(fù)方的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供參考。

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*通信作者：王 冰（1974—），女，博士，副教授，從事中藥納米制劑研究。E-mail：annabel_ cn@163.com張偉榮（1953—），男，碩士，教授，從事中醫(yī)臨床與教學(xué)研究。E-mail：zwr885@126.com

作者簡介：曾海榮（1990—），男，碩士生，從事心血管藥理與炎癥醫(yī)學(xué)研究。E-mail：hr2323631@126.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81303233）

收稿日期：2015-08-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.047

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1174-03