紅曲中洛伐他汀的分離鑒定和穩(wěn)定性評價

緱三虎， 劉　杰， 何　苗， 倪京滿*

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑研究所，甘肅蘭州730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州730000）

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紅曲中洛伐他汀的分離鑒定和穩(wěn)定性評價

緱三虎1， 劉杰2， 何苗1， 倪京滿1*

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑研究所，甘肅蘭州730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州730000）

摘要：目的 建立一種從紅曲中分離洛伐他汀以及穩(wěn)定性評價的方法。方法 乙醇提取干燥紅曲后經(jīng)硅膠分離，得到單體結(jié)晶，薄層色譜和高效液相色譜法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定（洛伐他汀）。然后，在相對濕度75％、溫度60℃和光照4 500 lx的條件下，峰面積歸一化法研究其總含有量變化和2種構(gòu)型（酸型和內(nèi)酯型）轉(zhuǎn)化，差重法計算吸濕率。結(jié)果 紅曲中內(nèi)酯型洛伐他汀易被分離，吸濕性強(qiáng)，高溫或強(qiáng)光照下可使其酸型結(jié)構(gòu)向內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，其中高溫時更為明顯，而強(qiáng)光下紅曲顏色變淺。結(jié)論 高溫對紅曲藥用功能性的影響較大。

關(guān)鍵詞：紅曲；洛伐他?。环蛛x鑒定；穩(wěn)定性

紅曲是由紅曲霉Monascus PurPureus接種于大米發(fā)酵后精制而成，由于所含的monaconlin類物質(zhì)可降低膽固醇，故被用作天然膳食補(bǔ)充劑［1］，其具有強(qiáng)身健體、健脾消食和活血化瘀之功效［2］，可用于治療高脂血癥、冠心病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、癌癥、非酒精性脂肪肝、疲勞癥和中樞神經(jīng)退行性疾病，而且在治療高脂血癥時的耐受性和適用性優(yōu)于他汀類藥物［3］。它可顯著降低血清膽總固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平，同時增加血清高密度脂蛋白膽固醇水平，明顯降低心血管疾病的發(fā)病率［4-6］。另外，紅曲還是一種天然著色劑，含有大量天然色素，其中脂溶性色素的含有量是水溶性的3倍，目前已確定結(jié)構(gòu)者有8種，用于食品和藥品的著色［7-9］。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉不僅可接種于大米，還可接種于其他藥材，擴(kuò)展了其應(yīng)用前景［10］，但由于紅曲副產(chǎn)物毒性大，穩(wěn)定性不理想，故其應(yīng)用受到了限制。桔霉素是其主要副產(chǎn)物之一，有腎毒性，但可通過現(xiàn)代工藝將其含有量控制在限度以內(nèi)，近年來對紅曲色素穩(wěn)定性的研究較多，但鮮有其藥用功能穩(wěn)定性的報道。

紅曲中富含他汀類物質(zhì)，其中含有量最高的是洛伐他汀，在紅曲中以酸型和內(nèi)酯型2種結(jié)構(gòu)存在，是合成許多他汀類藥物的中間體，有著非常高的藥用價值。目前，其工業(yè)生產(chǎn)主要有柱層析法、結(jié)晶法和半合成法，但步驟多，操作復(fù)雜，成本較高［11］。本實驗采用一種簡單易行，分離率高的方法，從紅曲中成功分離得到了純度較高的內(nèi)酯型洛伐他汀，同時還進(jìn)行紅曲的影響因素試驗，研究在激烈的單因素條件下，其洛伐他汀構(gòu)型的轉(zhuǎn)化和總含有量的變化，可為紅曲的藥用功能穩(wěn)定性，以及相關(guān)制劑生產(chǎn)工藝、貯存、包裝和運(yùn)輸條件的選擇提供科學(xué)的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械獨(dú)資工廠）；WD-A藥物穩(wěn)定性檢查儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；KQ5200DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius AG電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 材料 紅曲購自浙江三禾生物工程有限公司（批號2014012301），經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑研究所倪京滿教授鑒定為曲霉科紫色紅曲霉Monascu sPurPureus經(jīng)秈米深層發(fā)酵所得的紅曲米粉末，標(biāo)本保存于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館。內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（批號130320）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。柱層析硅膠（200～300目）和GF254薄層層析硅膠均購自青島海洋化工有限公司。乙腈為色譜純（批號WXBB6406V，美國Sigma-Aldrich公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅曲中洛伐他汀的分離 取干燥的紅曲粉5 g，250 mL乙醇回流提取5 h，提取液濃縮后得到紅色浸膏1.5 g，硅膠拌樣，過柱層析硅膠（200～300目，20 mm× 250 mm），流動相為石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（1∶1），沖柱至第2條黃色帶流出，共得150個流份。薄層色譜分析后，合并第21～51號單一斑點(diǎn)的流份，得到白色結(jié)晶150 mg。具體見表1。

表1　不同批次紅曲中洛伐他汀的分離情況（n=5）

2.2 洛伐他汀的鑒定

2.2.1 薄層色譜鑒定將內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品、紅曲中分離的白色結(jié)晶、酸型洛伐他汀、紅曲乙醇（25℃）以及熱乙醇（60℃）提取物點(diǎn)樣于硅膠薄層板上，展開劑為石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（1∶4），紫外燈下測得內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品和分離品的Rf值都為0.69，而酸型洛伐他汀為0.48，5％硫酸乙醇顯色后都為紅褐色，紅曲經(jīng)加熱提取后未見酸型洛伐他汀，見圖1。

A.254 nm波長 B.噴灑5％硫酸乙醇1.內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品 2.分離品 3.酸型洛伐他汀4.室溫提取的紅曲 5.加熱提取的紅曲圖1　兩種洛伐他汀和紅曲樣品的TLC圖

2.2.2 HPLC色譜條件［12］Lichrospher C18色譜柱（7 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫25℃；檢測波長237.8 nm；流動相為乙腈∶磷酸水（1 g/L）（65∶35）；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.3 內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 乙腈配制，質(zhì)量濃度為0.34 mg/mL。

2.2.4 酸型洛伐他汀對照品溶液的制備及配制 取內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品3.4 mg，加入10 mL 0.2 mol/L NaOH溶液（70％乙醇配制），50℃水浴下反應(yīng)1 h，峰面積歸一化法測定，結(jié)果見圖2。由圖可知，內(nèi)酯型洛伐他汀已全轉(zhuǎn)化為酸型結(jié)構(gòu)，純度大于98.8％，轉(zhuǎn)化率大于98.8％。

1.酸型洛伐他汀 2.內(nèi)酯型洛伐他汀圖2　酸型和內(nèi)酯型洛伐他汀的HPLC色譜圖

2.2.5 所分離的洛伐他汀溶液的配制 乙腈配制，質(zhì)量濃度為1.53 mg/mL。

2.2.6 紅曲提取液的配制 取紅曲10 mg，甲醇溶解，50℃下超聲提取1 h（120 W、24 Hz），置于10 mL量瓶中定容。

2.2.7 精密度實驗 同1天取0.017、0.085、0.17 mg/mL內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.2.2”項色譜條件下連續(xù)測定6次，測得RSD為1.39％，即日內(nèi)精密度；連續(xù)6天，取0.017、0.085、0.17 mg/mL內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進(jìn)行測定，測得RSD為1.62％，即日間精密度。由此表明，儀器精密度良好。

以內(nèi)酯型和酸型洛伐他汀為對照，對所分離的洛伐他汀進(jìn)行鑒別，并且在紅曲的HPLC色譜圖上定位出2種異構(gòu)體的出峰位置。見圖3。

圖3　內(nèi)酯型和紅曲中所分離洛伐他汀的HPLC色譜圖

2.3 紅曲中洛伐他汀的穩(wěn)定性研究

2.3.1 高濕實驗 稱取紅曲500 mg（90～100目），置于培養(yǎng)皿中，攤開成3 mm左右的薄層，放入相對濕度為92％的密閉干燥器中，1 d后取樣，測得吸濕率為9.2％，大于5％。因此，再取紅曲500 mg，置于培養(yǎng)皿中，攤開成1 mm左右的薄層，放入相對濕度為75％的密閉干燥器中，溫度為25℃，置于暗處，于第0、1、3、5、10天取樣，每次取樣10 mg，測定吸濕率，在“2.2.2”項色譜條件下比較紅曲中2種構(gòu)型洛伐他汀的轉(zhuǎn)化情況，以評價其藥用功能性變化，結(jié)果見圖4。由圖可知，紅曲在第3天時的吸濕率達(dá)到最高，但到第10天時小于5％，并且最大吸濕率接近30％，表明紅曲易引濕，在貯藏時要放在干燥處，并采取防潮措施。而且，高濕條件下2種構(gòu)型洛伐他汀的含有量及其總和幾乎沒有變化，構(gòu)型轉(zhuǎn)化也不明顯，見圖5、表2、圖6。

注：凈吸濕率為前一次到本次取樣時紅曲的吸濕率，累計吸濕率為第0天到本次取樣時紅曲的總吸濕率圖4　高濕條件（75％）下紅曲的吸濕率

1.酸型洛伐他汀 2.內(nèi)酯型洛伐他汀圖5　2種構(gòu)型洛伐他汀的出峰圖

表2　2種構(gòu)型洛伐他汀含有量的變化（±s）

表2　2種構(gòu)型洛伐他汀含有量的變化（±s）

天數(shù)/d　　高濕（75％）強(qiáng)光（4 500 lx）酸型/％　　內(nèi)酯型/％　　酸型/％　　內(nèi)酯型/％　　酸型/％　　內(nèi)酯型/高溫（60℃）％ 0　28.46±1.03　39.46±0.38　28.46±1.03　39.46±0.38　28.46±1.03　39.46±0.38 1　26.63±0.52　39.06±0.69　22.04±0.21　45.06±0.08　26.20±0.58　40.59±0.49 3　26.93±0.95　40.26±1.63　18.59±0.40　49.70±0.70　26.21±0.04　41.61±0.37 5　26.67±1.01　39.70±1.85　16.17±0.14　49.76±1.31　24.62±0.41　40.58±0.29 10　26.71±0.52　39.98±0.63　14.35±0.80　51.74±1.05　22.80±0.17　39.63±0.32

注：峰面積比值=單個峰面積/總峰面積×100％，峰面積比值之比=酸型峰面積比值/內(nèi)酯型峰面積比值。與第0天比較，*p< 0.05，**p<0.01圖6　2種構(gòu)型洛伐他汀峰面積比值之比與總和（n=3）

2.3.2 高溫實驗 稱取紅曲500 mg（90～100目），置于培養(yǎng)皿中，攤開成3 mm左右的薄層，放入藥物穩(wěn)定性檢查儀的暗處，溫度設(shè)置為60℃，相對濕度實測值為20％，于第0、1、3、5、10天取樣，每次取樣10 mg，在“2.2.2”項色譜條件下比較紅曲中2種構(gòu)型洛伐他汀的轉(zhuǎn)化情況，以評價其藥用功能性變化，結(jié)果見圖5、表2、圖6。第0～10天，紅曲中酸型洛伐他汀的色譜峰逐漸降低，而內(nèi)酯型逐漸升高，第0天時酸型峰面積是內(nèi)酯型的72.1％，而第10天時是27.8％，表明高溫對洛伐他汀構(gòu)型轉(zhuǎn)化的影響較大，故紅曲放置于高溫環(huán)境時，可影響其藥用功能。

2.3.3 強(qiáng)光實驗 稱取紅曲500 mg（90～100目），置于培養(yǎng)皿中，攤開成3 mm左右的薄層，放入藥物穩(wěn)定性檢查儀光照強(qiáng)度為4 500 lx的位置，溫度為25℃，相對濕度實測值為20％，于第0、1、3、5、10天取樣，每次取樣10 mg，在“2.2.2”項色譜條件下比較紅曲中2種構(gòu)型洛伐他汀的轉(zhuǎn)化情況，以評價其藥用功能性變化，結(jié)果見圖5、表2、圖6。強(qiáng)光條件下，紅曲中洛伐他汀構(gòu)型也發(fā)生了一定轉(zhuǎn)化，可能是由于強(qiáng)光為酸型轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯型提供了能量，從第5天開始，兩者轉(zhuǎn)化差異顯著高于第0天（p< 0.05），但其總含有量有略微下降的趨勢，而且強(qiáng)光對紅曲的色素也有影響。因此，在使用和貯存時，強(qiáng)光也是一個不可忽略的影響因素。

3 討論

3.1 紅曲中洛伐他汀的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 圖1顯示，內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品和紅曲分離品的薄層色譜特征相似，通過與酸型洛伐他汀比較后，確定分離品為內(nèi)酯型洛伐他汀。在“2.2.2”項色譜條件下，酸型洛伐他汀的保留時間為8.575 min，而內(nèi)酯型為14.004 min。內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品和紅曲中所分離洛伐他汀的保留時間一致，純度都大于98％，10 g紅曲可分離出30 mg左右洛伐他汀，HPLC法測得其實際含有量為30.658 mg/g，提取率大于等于97.9％。而且，分離得到的單體均為內(nèi)酯型洛伐他汀，在紅曲中的含有量較高，可能是在提取過程中乙醇回流溫度在75℃以下，紅曲中大量酸型洛伐他汀轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯型，而后者極性更小，易于洗脫分離，故得到全是羽狀結(jié)晶的該類成分。該方法簡單易行，經(jīng)反復(fù)驗證（表1），其重復(fù)性良好。

3.2 紅曲中洛伐他汀的穩(wěn)定性影響因素 圖4顯示，紅曲在相對濕度為75％的環(huán)境中極易吸濕，在第1天時吸濕率高達(dá)6.61％，而在第10天時累計吸濕率達(dá)24.43％，說明其吸濕性非常強(qiáng)，故其應(yīng)密封保存于玻璃或金屬容器中，而且制備劑型時應(yīng)加入防潮劑（甘露醇、糊精、淀粉、乳糖等）或制成顆粒藥物。結(jié)合圖5和圖6可知，紅曲在高濕、高溫、強(qiáng)光條件下，2種構(gòu)型洛伐他汀峰面積比值總和在62.42％～67.92％之間，隨取樣天數(shù)增加而有所降低，但程度不明顯，說明在影響因素激烈的條件下，紅曲藥用功能性物質(zhì)洛伐他汀的總含有量基本不變，僅有少量的損失。

圖5顯示，在第5天取樣測定時，2種構(gòu)型洛伐他汀的HPLC色譜圖都向右發(fā)生了漂移，漂移時間約為1 min，可能是由于流動相中磷酸溶液的質(zhì)量濃度大于1 g/L，或HPLC色譜儀在分配流動相比例時有機(jī)相比例減小，流動相極性增大，導(dǎo)致色譜峰右移。結(jié)合圖5和表2可知，在高溫和強(qiáng)光條件下，隨著取樣天數(shù)延后，酸型洛伐他汀的峰面積（或峰高）逐漸下降，而內(nèi)酯型逐漸上升；圖6顯示，2種構(gòu)型洛伐他汀的峰面積比值之比在高溫和強(qiáng)光條件下，隨著取樣天數(shù)增加而減小，但總含有量基本不變，推測兩者可能發(fā)生了構(gòu)型轉(zhuǎn)化，酸型洛伐他汀轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯型，并且高溫條件下更為明顯，這與文獻(xiàn)［13-14］一致。然而，強(qiáng)光條件下構(gòu)型轉(zhuǎn)化不明顯，而且紅曲色素的顏色隨著取樣天數(shù)增加而變淺，說明強(qiáng)光只對紅曲色素產(chǎn)生較大影響，但對其藥用功能性無顯著作用。由于酸型洛伐他汀的生理活性在體內(nèi)強(qiáng)于內(nèi)酯型［15］，故在高溫或強(qiáng)光條件下，貯存過的紅曲要考慮其藥用安全性問題，同時作為著色劑還要考慮色素的光敏性和穩(wěn)定性。

綜上所述，制劑在生產(chǎn)過程中應(yīng)避免高溫對活性成分的影響、引濕性和強(qiáng)光下色素分解等問題。

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*通信作者：倪京滿（1965—），女，博士，教授，研究方向為藥物新劑型與新技術(shù)。Tel：（0931）8915683，E-mail：nijm@lzu.edu.cn

作者簡介：緱三虎（1990—），男，碩士生，研究方向為藥物新劑型與新技術(shù)。E-mail：goush13@lzu.edu.cn

收稿日期：2015-07-13

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.050

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1184-04