苦瓜McAPX2基因及其啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析

高山　許端祥　陳中釤　杜文麗　傅睿清　溫慶放

摘 要 基于苦瓜葉片均一化文庫(kù)克隆得到McAPX2基因的cDNA全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)：KJ722767.1），采用染色體步移法獲得該基因的啟動(dòng)子序列，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在不同器官中的表達(dá)量及低溫脅迫對(duì)McAPX2表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：McAPX2基因全長(zhǎng)1 086 bp，開放閱讀框747 bp，編碼249個(gè)氨基酸；McAPX2屬于過氧化物酶家族ClassⅠ的成員，其脂肪族氨基酸指數(shù)為83.90，是一個(gè)親水性蛋白，可推測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)中；與甜瓜（NP_001284378.1）、黃瓜（ACO90193.1）、南瓜（AHF27424.1）、苦瓜（AGJ72851.1）同源性較高，分別為95%，94%，94%和93%；qRT-PCR結(jié)果顯示，在苦瓜的根、莖、葉、雌花和幼果等組織器官中McAPX2的表達(dá)量存在顯著差異，其中根的表達(dá)量最大，而在葉片中的表達(dá)量最低；在低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，McAPX2表達(dá)量逐漸上調(diào)，處理12 h時(shí)達(dá)到最大，隨后下降，說明該基因的表達(dá)與苦瓜耐低溫脅迫相關(guān)。分離得到McAPX2基因上游調(diào)控序列1 267 bp，其啟動(dòng)子含有與GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物脅迫以及熱激、干旱、低溫、光等非生物脅迫的相關(guān)元件。

關(guān)鍵詞 苦瓜；McAPX2基因；啟動(dòng)子；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S642.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

低溫脅迫打破植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（active oxygen， ROS）產(chǎn)生和消除的平衡機(jī)制，造成活性氧含量大幅增加，引發(fā)氧化脅迫，致使植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻，甚至死亡[1]。H2O2是一種較穩(wěn)定的ROS物質(zhì)，可以輕易地穿過植物細(xì)胞膜，生成最活躍的ROS物質(zhì)——羥自由基（·OH-），進(jìn)而干擾植物細(xì)胞光電子傳遞，影響膜系統(tǒng)穩(wěn)定性，氧化大分子物質(zhì)，造成細(xì)胞程序性死亡[2-4]。因此，及時(shí)清除過多H2O2對(duì)維持植物正常生理功能起重要作用。

抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle， AGC）是高等植物長(zhǎng)期進(jìn)化產(chǎn)生的有效清除活性氧的保護(hù)機(jī)制之一[5]，抗壞血酸過氧化物酶（APX， ascorbate peroxidase）是AGC清除H2O2的關(guān)鍵酶，其以抗壞血酸（AsA）為特殊電子供體（AH2），催化H2O2還原成H2O[6-7]。目前已從多種作物克隆出APX基因，許多研究發(fā)現(xiàn)APX基因參與植物響應(yīng)氧化脅迫應(yīng)答[8-14]。

中國(guó)南方冬春持續(xù)低溫是影響設(shè)施大棚苦瓜（Momordica charantia L.）生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量與品質(zhì)形成的主要限制因子，但有關(guān)苦瓜低溫脅迫分子機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)從前期構(gòu)建的苦瓜葉片均一化cDNA文庫(kù)中獲得一個(gè)EST序列，發(fā)現(xiàn)其與抗壞血酸過氧化酶基因高度同源。本研究以該序列設(shè)計(jì)特定引物，利用RACE技術(shù)克隆出苦瓜APX基因全長(zhǎng)序列，分析其特征特性和在低溫脅迫下時(shí)空表達(dá)模式，分離并分析McAPX基因的啟動(dòng)子，為進(jìn)一步研究苦瓜APX在低溫脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)，以期為苦瓜耐低溫育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為苦瓜強(qiáng)雌系‘24-K（Subgynoecious line，24-K），由福州市蔬菜科學(xué)研究所苦瓜課題組提供，參照高山等[14]方法，采用DSN與SMARTTM技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建苦瓜葉片均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，基因克隆與表達(dá)在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所內(nèi)完成。

1.2 方法

1.2.1 初花期苦瓜低溫處理 試驗(yàn)于2013年9月中旬進(jìn)行，將供試‘24-K的苦瓜種子用60 ℃溫水處理30 min，常溫浸種12 h后，播種于10 cm×15 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石=7 ∶ 1 ∶ 2（體積比），每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中保按照常規(guī)方法管理。待苦瓜長(zhǎng)至9葉1心，出現(xiàn)雌蕊時(shí)，選擇生長(zhǎng)勢(shì)一致的植株分別移置2臺(tái)智能型人工氣候箱（MGC-350HP-2）進(jìn)行處理。（1）處理組A：溫度8 ℃，濕度為60%，光強(qiáng)為200 μmol/（m2·s），光周期12 h/12 h；（2）處理組B或?qū)φ战M：溫度25 ℃，其它條件相同。在0～24 h內(nèi)分別于0、1、3、6、12、

24 h定時(shí)取各處理單株第5片功能葉，經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱備用，進(jìn)行基因表達(dá)分析。每個(gè)處理隨機(jī)取6株，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 苦瓜基因組DNA和總RNA提取純化 采用改良CTAB法提取苦瓜強(qiáng)雌系24-K的基因組DNA[15]；采用改良Trizol RNA提取試劑盒（Invitrogen）方法，分別提取苦瓜強(qiáng)雌系24-K開花初期（9葉1心）根、莖、葉、雌花和授粉5 d幼果的總RNA，用于McAPX2在苦瓜不同部位的表達(dá)分析。采用上述方法分別提取經(jīng)不同時(shí)間低溫處理和對(duì)照處理的苦瓜葉片總RNA，用于McAPX2表達(dá)模式分析。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA、總RNA 完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA、總RNA的濃度和純度。

1.2.3 McAPX2基因的克隆 在已構(gòu)建苦瓜葉片均一化cDNA文庫(kù)基礎(chǔ)上，測(cè)序后去除引物和載體片段，在Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，獲得一個(gè)與多種植物APX基因有很高同源性的EST序列，該基因cDNA全長(zhǎng)1 086 bp。利用軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)ORF上下游引物McAPX-ORF-F/R（見表1），以稀釋100倍文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收的目的條帶，克隆到TaKaRa的pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選出陽(yáng)性克隆，委托上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序，進(jìn)行新基因驗(yàn)證。

1.2.4 McAPX2啟動(dòng)子的分離 根據(jù)苦瓜McAPX2的全長(zhǎng)cDNA序列，從起始密碼子下游200 bp內(nèi)設(shè)計(jì)巢式引物A2GSP-1，A2GSP-2和A2GSP-3。參照劉志欽等[16]方法和Genome Walking kit試劑盒說明書，以純化的苦瓜‘24-K基因組DNA為模板，進(jìn)行3輪巢式PCR，分離克隆McAPX2上游調(diào)控區(qū)域的啟動(dòng)子序列。PCR產(chǎn)物純化回收并克隆至pMD18-T載體上，委托上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.5 McAPX2生物信息學(xué)分析 由在線軟件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）尋找McAPX2最大開放閱讀框，使用Blastn（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性分析；采用Maga5.01軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用在線軟件Blastp、SOSUI、Signal3.0、TMHMM、TargetP1.1、SOPMA等（http：//www.expasy.org/tools）分析McAPX2編碼的氨基酸序列、蛋白結(jié)構(gòu)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)等。利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)其順式作用元件。

1.2.6 熒光定量PCR分析 以稀釋10倍的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，根據(jù)McAPX2基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物McAPX2-RT-F/R，以苦瓜環(huán)素基因（GenBank：HQ171897）作為內(nèi)參基因[15]，以McCYP-RT-F/R為熒光定量引物（表1），RT-qPCR分析在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。20 μL PCR擴(kuò)增體系為：10 μL 2×Real Master Mix混合液、5～10 ng cDNA、上下游引物各0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，40次循環(huán)，清水模板為陰性對(duì)照。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。原始數(shù)據(jù)用Excel2007軟件處理，用SPSS10.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 McAPX2基因全長(zhǎng)的克隆

從苦瓜葉片均一化文庫(kù)中克隆得到1個(gè)APX相關(guān)的EST片段，去除引物和載體片段，經(jīng)blastn比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與黃瓜L-ascorbate peroxidase（NM_001280706.1）的cDNA序列相似性為67.5%，經(jīng)測(cè)序及序列分析，得到APX基因cDNA全長(zhǎng)序列（圖1、2），該序列全長(zhǎng)為1 086 bp，包括89 bp的5′-UTR，250 bp的3′-UTR。起始密碼子ATG附近有Kozak保守序列“A/GCCATGG”，cDNA末端含有PolyA序列，在PolyA之前20 bp含保守加尾信號(hào)“TGTAA”序列，這些均符合能有效翻譯基因的全長(zhǎng)cDNA特征，命名為McAPX2，GenBank登錄號(hào)為KJ722767.1。

2.2 McAPX2基因推導(dǎo)氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)ORF Finder分析，McAPX2的開放閱讀框?yàn)?47 bp，編碼249個(gè)氨基酸。ProtParam軟件分析表明，McAPX2蛋白分子式為C1 236H1 912N326O365S5，相對(duì)分子量27.34 ku，理論等電點(diǎn)pI為5.43；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）為36個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）為28個(gè)；脂肪系數(shù)為83.90，平均熟疏水性為-0.280；不穩(wěn)定指數(shù)為34.80，屬于穩(wěn)定蛋白。經(jīng)ProtScale軟件推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

采用TargetP1.1對(duì)McAPX2蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示定位在線粒體內(nèi)（mTP值為0.131）或分泌到胞外（SP值為0.047）的可能性較小，極有可能在其它部位（other值為0.906）。經(jīng)SignalP 4.1 Server軟件分析，McAPX2蛋白不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白。經(jīng)TMpred程序分析，McAPX2蛋白不含跨膜區(qū)域。結(jié)果推測(cè)McAPX2蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。

經(jīng)SOPMA預(yù)測(cè)McAPX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，McAPX蛋白包含有104處α-螺旋（Alpha helix），占41.77%；22處β-轉(zhuǎn)角（beta-turn），占8.84%；25處延伸鏈（Extended strand），占10.04%；98處無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil），占39.36%。

通過NCBI的CDS軟件分析，McAPX2蛋白屬于植物來(lái)源的過氧化物酶超家族，該蛋白含有1個(gè)過氧化物酶活性位點(diǎn)或底物結(jié)合位點(diǎn)（33-44： APLMLRLAWHSA）區(qū)域，1個(gè)亞鐵血紅素配基結(jié)合區(qū)域或血紅素結(jié)合位點(diǎn)（155-165：DIVALSGAHTL），發(fā)現(xiàn)7個(gè)與形成二聚體靜電作用相關(guān)的保守氨基酸。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸同源比對(duì)（圖3），發(fā)現(xiàn)APX蛋白序列C-端高度保守，N-端相對(duì)不保守，與同屬的甜瓜（Cucumis melo NP_001284378.1）、黃瓜（Cucumis sativus ACO90193.1）、南瓜（Cucurbia moschata AHF27424.1）、苦瓜（Momordica charantia AGJ72851.1）同源性分別為95%，94%，94%，93%，說明葫蘆科APX氨基酸序列具有較高的保守性。

利用MEGA5.0軟件，將McAPX2蛋白與其他27種植物的APX蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（圖4），參與構(gòu)建進(jìn)化樹的27個(gè)APX蛋白已被證明或預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)果顯示，苦瓜McAPX蛋白與葫蘆科植物甜瓜（NP_001284378.1）、黃瓜（ACO90193.1）的APX蛋白親緣關(guān)系最近，與茄科的番茄（NP_001234782.1）、煙草（AAA86689.1）和辣椒（CAA57140.1）的APX具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系，與豆科的大豆（NP_001237785.1）、苜蓿（AES88707.1）、豇豆（AAB03844.1）等的APX蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，而與無(wú)患子科植物柚（ACM17463.1）和龍眼（ABS50864.1）的APX親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。結(jié)果表明，苦瓜McAPX2基因與其它植物的APX具有較高的保守性，這些APX蛋白功能在進(jìn)行化上保守，推測(cè)McAPX2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 McAPX2在苦瓜不同器官表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)McAPX2在苦瓜開花初期不同組織器官的表達(dá)情況，以葉片中相對(duì)表達(dá)量為1。從圖5可見，McAPX2在根、莖、葉、雌花和授粉5 d幼果等器官中的表達(dá)量存在極顯著的差異。在根、莖、幼果中大量表達(dá)，其中根的表達(dá)量最大，而在葉片中的表達(dá)量最低。

2.4 低溫脅迫下McAPX2的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)在低溫脅迫下苦瓜初花期葉片中McAPX2表達(dá)情況，以對(duì)照處理McAPX2相對(duì)表達(dá)量為1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫處理1 h時(shí)，苦瓜葉片McAPX2表達(dá)量與對(duì)照處理McAPX2表達(dá)量無(wú)顯著差異；低溫處理3 h時(shí)McAPX2表達(dá)量有顯著的上調(diào)趨勢(shì)；低溫處理6 h時(shí)，McAPX2表達(dá)量是對(duì)照處理的16倍；低溫處理12 h時(shí)McAPX2表達(dá)量達(dá)到最大，是對(duì)照處理表達(dá)量的23倍；低溫處理24 h時(shí)，McAPX2表達(dá)量降低，仍比對(duì)照處理的表達(dá)量高17倍（圖6）。

2.5 McAPX2啟動(dòng)子分離與序列分析

將啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)酶切鑒定、測(cè)序，獲得序列片段長(zhǎng)為1 276 bp（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所獲得的序列3′端116 bp序列與McAPX2 cDNA的5′端序列比對(duì)一致，表明所得序列為McAPX2基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域。

使用在線neural network promoter prediction軟件預(yù)測(cè)出轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為T，位于起始密碼子上游214 bp處；采用在線軟件PlantCare分析，在轉(zhuǎn)錄起始位置上游30 bp位置預(yù)測(cè)到1個(gè)TATA-BOX，在上游68 bp位置預(yù)測(cè)到1個(gè)CAAT-BOX。發(fā)現(xiàn)該段序列上含有植物激素響應(yīng)元件，如赤霉素響應(yīng)元件GARE1OSREP1、赤霉素反應(yīng)瞬時(shí)作用元件PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、乙烯響應(yīng)元件ERELEE4和細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件ARR1AT；器官特異表達(dá)元件，如根器官特異表達(dá)元件ROOTMOTIFTAPOX1、花粉特異表達(dá)元件POLLEN1LELAT52；病原菌響應(yīng)元件，如ASF1MOTIFCAMV、ELRECOREPCRP1、WBOXATNPR1；防御與脅迫響應(yīng)元件，如DOFCOREZM、WBBOXPCWRKY1；光調(diào)控元件BOX4；逆境響應(yīng)元件，如干旱誘導(dǎo)元件，如MYB1AT、MYB2CONSENSUSAT、MYBCORE，干旱和黑暗響應(yīng)元件ACGTATERD1，熱激鹽誘導(dǎo)表達(dá)GT1GMSCAM4，低溫誘導(dǎo)響應(yīng)元件LTRE1HVBLT49（圖8）。

3 討論

本試驗(yàn)從苦瓜葉片均一化文庫(kù)中克隆出1 086 bp的McAPX2全長(zhǎng)cDNA序列，該基因編碼含有249個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框。保守區(qū)分析發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白屬于植物POD超家族，具有過氧化物酶活性位點(diǎn)和亞鐵血紅素配基結(jié)合區(qū)等與其他物種APX相同的保守域。在高等植物中APX是編碼多基因家族，APX蛋白根據(jù)不同細(xì)胞定位可劃分4種同工酶：葉綠體基質(zhì)（sAPX）及類囊體膜APX（tAPX），線粒體膜APX（mitAPX）、過氧化物酶體（pAPX）和胞質(zhì)APX（cAPX）[17]。4種APX同工酶的分子量、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)和序列存在差異。McAPX2蛋白分子量為27.43 ku，與擬南芥胞質(zhì)型AtAPX1/2分子量27.5 ku相當(dāng)。該蛋白含有7個(gè)參與二聚體界面靜電作用的保守帶電殘基，說明McAPX2可能和擬南芥胞質(zhì)型AtAPX1/2一樣以二聚體結(jié)構(gòu)存在[18]。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白序列的N-端不含信號(hào)肽，表明該蛋白不定位葉綠體或線粒體上，C-端不含跨膜區(qū)域，表明不定位在過氧化物酶體上，推測(cè)可能定位在細(xì)胞質(zhì)。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與同科植物甜瓜（95%），黃瓜（94%）和南瓜（94%）的cAPX有很高的同源性；系統(tǒng)聚類樹分析顯示，McAPX2與其它27種植物的cAPX具有較高的同源性，說明該基因家族在進(jìn)化上十分保守。由此可以推斷獲得的苦瓜McAPX2基因?qū)儆贏PX基因家族的cAPX基因亞族[7]。

目前許多高等植物中不同類型的APX基因被克隆出來(lái)，有研究表明，APX基因的表達(dá)受各種環(huán)境脅迫因子的誘導(dǎo)。APXs，尤其是cAPX更有助于使植物免受氧化應(yīng)激作用[17]。Park等[19]研究發(fā)現(xiàn)，甘薯受傷害脅迫誘導(dǎo)后APX表達(dá)量明顯上調(diào)；Koussevitzky等[20]發(fā)現(xiàn)干旱和熱激脅迫后擬南芥APX1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到最高；王超等[21]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理誘導(dǎo)白樺APX基因顯著表達(dá)；Lu等[22]發(fā)現(xiàn)2種水稻cAPXs（OsAPXa和OsAPXb）基因均可以且在不同程度上提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，其中OsAPXb基因?qū)}脅迫更敏感。曾秀存等[23]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫誘導(dǎo)白菜型冬油菜cAPX基因上調(diào)表達(dá)，超強(qiáng)抗寒性品種‘隴油7號(hào)APX基因表達(dá)量高于抗寒性弱的品種‘天油4號(hào)；本研究表明低溫脅迫下苦瓜McAPX表達(dá)量上調(diào)，與曾秀存等[23]研究結(jié)果相一致；另外，低溫脅迫誘導(dǎo)植株體內(nèi)的APX活性上調(diào)在水稻[24]，咖啡[25]，山楂[26]和辣椒[27]中也得到了證實(shí)。然而，有研究表明，低溫脅迫可誘導(dǎo)cAPX下調(diào)表達(dá)，Morita等[28]發(fā)現(xiàn)低溫處理水稻胞質(zhì)型OsAPX2的表達(dá)量下調(diào)；Funatsuki等[29]發(fā)現(xiàn)大豆cAPX1缺失突變株比野生型更為耐寒。cAPX基因的表達(dá)差異可能與試驗(yàn)材料對(duì)低溫的敏感程度、試驗(yàn)條件和脅迫強(qiáng)度等相關(guān)。對(duì)于低溫敏感性植物而言，低溫脅迫下植物主要遭受氧化脅迫，植株體內(nèi)APX活性上調(diào)，清除過量的H2O2，以利于植物在更低溫度或長(zhǎng)時(shí)間低溫下生存。對(duì)于特定處理?xiàng)l件下，低溫脅迫可誘導(dǎo)cAPX下調(diào)表達(dá)積累H2O2，H2O2作為低溫脅迫信號(hào)因子觸發(fā)誘導(dǎo)下游防御基因的表達(dá)，表現(xiàn)出耐寒性[30]。

啟動(dòng)子作為一種順式作用元件，是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要因素之一。本研究通過染色體步移法從苦瓜果實(shí)中分離得到McAPX2基因上游1 276 bp的啟動(dòng)子序列。通過在線軟件PLACE和PlantCare分析，該序列具有啟動(dòng)子的普遍特征，在轉(zhuǎn)錄起始位置有基因轉(zhuǎn)錄必須的與RNA聚合酶結(jié)合或互作的保守元件TATA-BOX和CAAT-BOX，含有與GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物脅迫以及熱激、干旱、低溫、光等非生物脅迫的相關(guān)元件，這些元件的發(fā)現(xiàn)說明McAPX2基因可能在轉(zhuǎn)錄水平上受到激素、生物脅迫和非生物脅迫等多種因素的調(diào)節(jié)。該序列上的低溫誘導(dǎo)響應(yīng)順式元件LTRE1HVBLT49[31-34]可能與低溫脅迫下APX基因的差異表達(dá)有著重要關(guān)系；3個(gè)增強(qiáng)子元件CAATBOX、EECCRCAH1、GATABOX可能與增強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游McAPX2基因的表達(dá)相關(guān)。同時(shí)該序列中發(fā)現(xiàn)了器官特異表達(dá)元件，說明McAPX2在植物體內(nèi)的表達(dá)可能具有器官特異性。McAPX2啟動(dòng)子各元件的具體功能還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 王國(guó)驕， 王嘉宇， 馬殿榮， 等. 不同耐冷性雜草稻和栽培稻抗氧化系統(tǒng)對(duì)冷水脅迫的響應(yīng)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015（8）： 1 660-1 668.

[2] Apel K， Hirt H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction.[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55（1）： 728-749.

[3] 王春麗， 梁宗鎖. 外源刺激對(duì)植物次生代謝的調(diào)節(jié)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2009， 29（5）： 1 055-1 065.

[4] Sharma P， Jha A B， Dubey R S， et al. Reactive Oxygen Species， Oxidative Damage， and Antioxidative Defense Mechanism in Plants under Stressful Conditions[J]. Journal of Botany， 2012：1-26. doi： 10.1155/2012/217037.

[5] 羅 婭， 湯浩茹， 張 勇. 低溫脅迫對(duì)草莓葉片SOD和AsA-GSH循環(huán)酶系統(tǒng)的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2007， 34（6）： 1 405-1 410.

[6] Pal R S， Bisht M. Antioxidative metabolites and enzymes： an overview[M]// Newer Approaches to Biotechnology， 2013： 595-601.

[7] 李澤琴， 李靜曉， 張根發(fā). 植物抗壞血酸過氧化物酶的表達(dá)調(diào)控以及對(duì)非生物脅迫的耐受作用[J]. 遺傳， 2013， 35（1）： 45-54.

[8] Karpinski S， Reynolds H， Karpinska B， et al. Systemic signaling and acclimation in response to excess excitation energy in Arabidopsis.[J]. Science， 1999， 284（5414）： 654-657.

[9] Yabuta Y， Motoki T， Yoshimura K， et al. Thylakoid membrane-bound ascorbate peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress[J]. Plant Journal， 2003， 32（6）： 915-25.

[10] Murgia I， Tarantino D， Vannini C， et al. Arabidopsis thaliana， plants overexpressing thylakoidal ascorbate peroxidase show increased resistance to Paraquat-induced photooxidative stress and to nitric oxide-induced cell death[J]. Plant Journal， 2004， 38（6）： 940-953.

[11] Davletova S， Rizhsky L， Liang H， et al. Cytosolic ascorbate peroxidase 1 is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2005， 17（1）： 268-281.

[12] Kangasjarvi S， Lepisto A， Hannikainen K， et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses[J]. Biochemical Journal， 2008， 412（2）： 275-285.

[13] Wu G， Wang G， Ji J， et al. Cloning of a cytosolic ascorbate peroxidase gene from Lycium chinense， Mill. and enhanced salt tolerance by overexpressing in tobacco[J]. Gene， 2014， 543（1）： 85-92.

[14] 高 山， 陳桂信， 許端祥， 等. 成熟軟化期苦瓜果實(shí)均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與EST分析[J].分子植物育種， 2013（2）： 211-216.

[15] 高 山， 陳桂信， 許端祥， 等. 苦瓜果實(shí)β-半乳糖苷酶基因的克隆、 表達(dá)及亞細(xì)胞定位[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2013， 14（6）： 1 124-1 129.

[16] 劉志欽， 楊 晟， 蔡金森， 等. 辣椒CaWRKY5啟動(dòng)子的分離及其調(diào)控元件分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2013（3）： 389-394.

[17] Shigeoka S， Ishikawa T， Tamoi M， et al. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[18] Dabrowska G， Katai A， Goc A H M， et al. Characteristics of the plant ascorbate peroxidase family[J]. Acta Biologica Cracoviensia， 2007， 49（1）： 7-17.

[19] Park S Y， Ryu S H， Jang I C， et al. Molecular cloning of a cytosolic ascorbate peroxidase cDNA from cell cultures of sweet potato and its expression in response to stress[J]. Molecular Genetics & Genomics， 2004， 271（3）： 339-346.

[20] Koussevitzky S， Suzuki N， Huntington S， et al. Ascorbate peroxidase 1 plays a key role in the response of Arabidopsis thaliana to stress combination[J]. Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（49）： 34 197-34 203.

[21] 王 超， 楊傳平， 王玉成. 白樺抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因克隆及表達(dá)分析[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 37（3）： 79-81.

[22] Lu Z Q， Liu D L， Liu S K. Two rice cytosolic ascorbate peroxidases differentially improve salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2007， 26（10）： 1 909-1 917.

[23] 曾秀存， 孫萬(wàn)倉(cāng)， 方 彥， 等. 白菜型冬油菜抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因的克隆、 表達(dá)及其活性分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2013， 39（8）： 1 400-1 408.

[24] Oidaira H， Sano S， Koshiba T， et al. Enhancement of antioxidative enzyme activities in chilled rice seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 2000， 156（5-6）： 811-813.

[25] Fortunato A S， Lidon F C， Batista-Santos P， et al. Biochemical and molecular characterization of the antioxidative system of Coffea sp. under cold conditions in genotypes with contrasting tolerance[J]. Journal of Plant Physiology， 2009， 167（5）： 333-342.

[26] Eltelib H A， Badejo A A， Fujikawa Y， et al. Gene expression of monodehydroascorbate reductase and dehydroascorbate reductase during fruit ripening and in response to environmental stresses in acerola（Malpighia glabra）.[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（168）： 619-627.

[27] Airaki M， Leterrier M， Rosa M， et al. Metabolism of reactive oxygen species and reactive nitrogen species in pepper（Capsicum annuum， L.）plants under low temperature stress[J]. Plant Cell & Environment， 2012， 35（2）： 281-295.

[28] Morita S， Nakatani S， Koshiba T， et al. Differential expressions of two cytosolic ascorbate peroxidase and two superoxide dismutase genes in response to abiotic stress in rice[J]. Rice Science， 2011， 18（3）： 157-166.

[29] Funatsuki H， Kurosaki H， Murakami T， et al. Deficiency of a cytosolic ascorbate peroxidase associated with chilling tolerance in soybean[J]. Theoretical & Applied Genetics， 2003， 106（3）： 494-502.

[30] Prasad T K， Anderson M D， Martin B A， et al. Evidence for Chilling-Induced Oxidative Stress in Maize Seedlings and a Regulatory Role for Hydrogen Peroxide.[J]. Plant Cell， 1994， 6（1）： 65-74.

[31] 陰 霞， 陳 雯， 王 磊， 等. 激素和非生物脅迫對(duì)月季RhPIP1；1啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用[J].園藝學(xué)報(bào)， 2014， 41（1）： 107-117.

[32] 徐孟亮， 李落葉， 陳榮軍， 等. 一個(gè)新的水稻低溫應(yīng)答類糖基轉(zhuǎn)移酶基因（OsCrGtl）的表達(dá)分析與克隆[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2010， 18（4）： 663-669.

[33] 張愛華. 西瓜玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因及啟動(dòng)子的克隆與分析[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[34] Md Abdul Kayum， Jong-In Park， Nasar Uddin Ahmed， et al. Alfin-like transcription factor family： characterization and expression profiling against stresses in Brassica oleracea[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2016， 38（5）： 1-14.