益肺宣肺降濁方對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬病理和神經(jīng)元凋亡的影響

王清碧　廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院　530011南寧市華東路10號(hào)吳　林　廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院　530023趙清山　馬鞍山市中醫(yī)院　243021李天威　李海沅　廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院　530023蔡鑫昆　鹽城市中醫(yī)院　224001畢信亞　防城港市中醫(yī)院　538021唐　農(nóng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院　530023

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益肺宣肺降濁方對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬病理和神經(jīng)元凋亡的影響

王清碧廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院530011南寧市華東路10號(hào)
吳林廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023
趙清山馬鞍山市中醫(yī)院243021
李天威李海沅廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023
蔡鑫昆鹽城市中醫(yī)院224001
畢信亞防城港市中醫(yī)院538021
唐農(nóng)*廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023

摘要目的：觀察益肺宣肺降濁方對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬病理和神經(jīng)元凋亡的影響。方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉再通法制備癡呆模型，隨機(jī)分為模型組、石杉堿甲組、中藥高劑量組、中藥中劑量組和中藥低劑量組（注：中藥為益肺宣肺降濁方）。藥物治療30 d后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，光鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)的病理變化，用TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：在定位航行試驗(yàn)中，中藥3個(gè)組的平均潛伏期較模型組明顯縮短，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，中藥3個(gè)組與模型組比較，成功次數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各中藥組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死、變性和凋亡明顯減輕。結(jié)論：益肺宣肺降濁方具有改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力及減輕海馬損傷和神經(jīng)元凋亡的作用。

關(guān)鍵詞益肺宣肺降濁方；血管性癡呆；學(xué)習(xí)能力；記憶能力；病理；神經(jīng)元凋亡

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由各種腦血管病引起的獲得性、持續(xù)性智能損害綜合征，臨床中最突出的表現(xiàn)是學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能的下降。在發(fā)達(dá)國家中VD占全部癡呆患者的25%～50%，成為導(dǎo)致癡呆的第二大原因［1］。在所有的癡呆類型中，從某種程度上講，血管性癡呆是可以防治的［2］。伴隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高以及老齡化社會(huì)的到來，血管性癡呆的發(fā)病率越來越高，一方面給老年患者的身心健康帶來嚴(yán)重的危害，另一方面也給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，因此，預(yù)防和治療血管性癡呆將會(huì)受到越來越多人的關(guān)注。筆者參照呂氏造模方法［3］實(shí)驗(yàn)，用兩側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉再通法制備VD模型，用Morris水迷宮觀察益肺宣肺降濁方對VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）觀察海馬CA1區(qū)病理變化，用TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPE級SD雄性大鼠190只，體重200±20 g，由湖南斯南萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（No：43004700002251）。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)藥品及試劑益肺宣肺降濁方免煎顆粒（黃芪15 g、人參15 g、麥冬15 g、桔梗10 g、杏仁10 g、三七15 g、蘇子15 g、石菖蒲15 g、酒大黃6 g）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，4℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用雙蒸水稀釋成適當(dāng)濃度。石杉堿甲片（雙益平）由上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司提供，國藥準(zhǔn)字H10960133。

1.2造模及篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前8 h禁食，用10%水合氯醛按照3 ml/kg標(biāo)準(zhǔn)行腹腔注射麻醉。所有的手術(shù)器械先給予高溫滅菌，固定好大鼠，然后頸部去毛，碘伏消毒后，行頸正中切口，依次應(yīng)用玻璃分針分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用0號(hào)絲線結(jié)扎，手術(shù)過程中注意不要牽拉迷走神經(jīng)，阻斷血流20 min，同時(shí)在大鼠距尾尖1 cm處斷尾，放血約0.3 ml，然后松開絲線恢復(fù)大腦血流10 min，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，即以三次缺血20 min、再灌注10 min的方式造成VD模型。第3次血流再灌注后，切口給予適量頭孢粉末預(yù)防感染，隨即縫合皮膚，放回籠中正常飼養(yǎng)?？瞻捉M只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎也不阻斷［3］。造模成功后運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行VD模型篩選（經(jīng)過模型篩選納入實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物122只），Morris水迷宮（MWM）參照相關(guān)文獻(xiàn)制作［4］，模型篩選參照趙憲林等［5］的VD大鼠模型篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3分組及給藥將造模成功大鼠隨機(jī)分為中藥高、中、低劑量組，石杉堿甲組，模型組，每組20只，空白組22只。造模第20 d開始灌胃給藥，給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定，以臨床人用藥等效劑量做為中劑量，益肺宣肺降濁方高、中、低劑量組大鼠的給藥劑量分別為24.36 g/（kg·d）、12.18 g/（kg·d）、6.09 g/（kg·d），石杉堿甲給藥劑量為0.15 mg/（kg·d）。給藥濃度折算至每天按1 ml/100g大鼠體重灌胃，模型組及空白組均予相應(yīng)體積的雙蒸水。每天給藥1次，30 d后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶能力檢測。

1.4取材、HE染色及神經(jīng)元凋亡檢測方法行為學(xué)測試結(jié)束后，用10%的水合氯醛按照0.3 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)行腹腔注射麻醉，快速開胸暴露大鼠心臟，剪開右心耳，夾持心尖，將粗針頭經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾將針頭固定?？焖俚稳?7℃生理鹽水100～250 ml沖洗大鼠體內(nèi)血液，直至右心耳處流出淺白色液體或基本澄清。隨即灌注4℃4%多聚甲醛，先快速灌入約30 s，然后緩慢灌注，直至大鼠頭部變硬，四肢震顫停止即結(jié)束灌注。然后，立即斷頭取腦，分離出雙側(cè)海馬放入4%多聚甲醛中固定。然后經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、連續(xù)冠狀切片，片厚約5 μm，采用HE染色觀察組織形態(tài)，TUNEL法檢測海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。

2　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，3組或以上計(jì)量資料比較用單因素方差分析，所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)　果

3.1各組學(xué)習(xí)成績比較見表1。從表1可見，經(jīng)過益肺宣肺降濁中藥方治療后，VD大鼠的學(xué)習(xí)成績明顯改善，且在一定的中藥劑量范圍之內(nèi)，學(xué)習(xí)成績與中藥劑量正相關(guān)。

3.2各組記憶成績比較見表2。從表2可見，模型組大鼠記憶行為能力明顯受損，而益肺宣肺降濁方對VD模型大鼠有一定程度的保護(hù)作用，并且中藥各組之間存在一定的量效關(guān)系。

表1　各組學(xué)習(xí)成績比較

表2　各組記憶成績比較

3.3 HE染色光鏡下觀察大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖1。海馬組織常規(guī)石臘切片，HE染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細(xì)胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色。光鏡下可見空白組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密、整齊，細(xì)胞形態(tài)完整、輪廓清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚，核仁圓潤、清晰。中藥高劑量組、石杉堿甲組與空白組比較差異較小，其余各組存在不同程度的差異。

圖1　各組HE染色結(jié)果比較（×20）

3.4 TUNEL法檢測大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況結(jié)果見圖2及表3。各組隨機(jī)取6只大鼠標(biāo)本用于神經(jīng)元凋亡檢測，其中神經(jīng)元凋亡（TUNEL陽性細(xì)胞）以綠色熒光表示，空白組偶見陽性細(xì)胞，僅有少量細(xì)胞凋亡；模型組陽性細(xì)胞明顯增多，簇?fù)沓蓤F(tuán)狀；中藥高劑量組及石杉堿甲組與空白組比較未見明顯差別，其余各組存在不同程度的差異。

圖2　各組神經(jīng)元凋亡（綠色熒光）結(jié)果比較（×20）

4　討　論

石杉堿甲是從中藥材中提取出來的天然植物堿，作為一種可逆性膽堿酯酶抑制劑，臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明其具有提高認(rèn)知功能、增強(qiáng)記憶保持和促進(jìn)記憶再現(xiàn)的作用。本實(shí)驗(yàn)選擇石杉堿甲作為對照藥物，并且把中藥組分為高、中、低劑量組，是為了進(jìn)一步證明益肺宣肺降濁方對血管性癡呆的治療作用。從檢測的記憶屬性來看，Morris水迷宮試驗(yàn)可以用于篩選VD的有效防治藥物［6-7］，其中最常用的評價(jià)指標(biāo)是定位航行實(shí)驗(yàn)的“逃避潛伏期”（占48．48%），其次是空間探索實(shí)驗(yàn)的“跨越平臺(tái)次數(shù)”（占27．27%）［8］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明益肺宣肺降濁方具有改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及減輕海馬損傷和神經(jīng)元凋亡的作用，且中藥在一定的劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加療效更顯著。

表3　TUNEL法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目?。ā纒）

表3　TUNEL法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目?。ā纒）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與石杉堿甲組比較，③P＜0.01；與中藥高劑量組比較，④P＜0.01

組別　n　　神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目空白組　6　19.16±11.58模型組　6　118.33±31.41①中藥高劑量組　6　26.66±10.32②中藥中劑量組　6　49.16±11.58①②③④中藥低劑量組　6　71.66±10.80①②③④石杉堿甲組　6　30.00±14.14②

血管性癡呆在傳統(tǒng)中醫(yī)中沒有專門的論述，縱觀血管性癡呆歷年的研究成果，在病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)上，比較一致的看法是，其發(fā)病病位在腦，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為臟腑虧損，氣不足，尤與心肝脾腎虧虛關(guān)系密切，標(biāo)實(shí)為痰阻、血瘀、濁毒，而很少提及到肺臟，這不能不說是一個(gè)缺陷。早在上世紀(jì)90年代，我校唐農(nóng)教授首先提出“腦病從肺論治”觀點(diǎn)，本研究的益肺宣肺降濁方是依據(jù)“從肺論治癡呆”的新觀點(diǎn)擬定的經(jīng)驗(yàn)方，前期的臨床實(shí)踐已證實(shí)其具有良好的療效［9-12］。表明肺臟虛損在VD發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著重要的作用。

癡呆病的特征是記憶的不同程度喪失，而記憶的喪失實(shí)際上是腎的“藏納”功能障礙，即收藏不利，則直接影響到信息的存儲(chǔ)。而腎之“藏”是以肺之“收”為前提條件的，肺是啟動(dòng)記憶存儲(chǔ)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。標(biāo)實(shí)方面，“瘀痰”的發(fā)生是氣血津液運(yùn)行失調(diào)的表現(xiàn)，“瘀”與肺的關(guān)系不必多言，“肺朝百脈”一言以蔽之?！疤禎帷眲t主要與肺、脾、腎三臟功能直接相關(guān)，“濁毒”則與“腑滯”相關(guān)。肺與大腸相表里，二者協(xié)調(diào)配合，共同完成氣的宣降功能。老年人臟腑功能衰退，肺氣不足，宣降失職，大腸傳導(dǎo)失司，糟粕滯留腸腑，產(chǎn)生濁毒，清氣不升，濁陰不降，上擾清竅，從而導(dǎo)致癡呆發(fā)生。因此，肺臟虛損在癡呆發(fā)生發(fā)展過程中是一個(gè)不可忽視的環(huán)節(jié)，在治療癡呆這一疾病時(shí)，重視調(diào)理肺氣具有重要的臨床指導(dǎo)意義［13-17］。

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（2015－11－15收稿/編輯楊繼峰）

*通信作者，男，（1963-），廣西中醫(yī)藥大學(xué)校長，醫(yī)學(xué)博士、教授、主任醫(yī)師

作者簡介：王清碧，男，（1985-），廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，住院醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥防治腦血管病

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（NO：81160435）

中圖分類號(hào)：R749

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-0719（2016）02-0067-04