雙側腦室注射STZ所致線粒體功能障礙對大鼠空間認知及海馬神經(jīng)的影響

廖冬燕　屈澤強廣西中醫(yī)藥大學　530001南寧市明秀東路179號朱永蘋　奚錦要　廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院　530011農(nóng)清棟　廣西中醫(yī)藥大學　530200

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雙側腦室注射STZ所致線粒體功能障礙對大鼠空間認知及海馬神經(jīng)的影響

廖冬燕屈澤強*廣西中醫(yī)藥大學530001南寧市明秀東路179號
朱永蘋奚錦要廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院530011
農(nóng)清棟廣西中醫(yī)藥大學530200

摘要目的：探討雙側腦室定位注射（intracerebroventricular injection，ICV）鏈脲佐菌素（STZ）所致線粒體功能損傷對大鼠空間認知及海馬神經(jīng)的影響。方法：選用SD大鼠于第1、3 d進行兩次ICV STZ造模。21 d后進行Morris水迷宮（MWM）學習記憶行為學檢測、大腦海馬勻漿ATP水平和線粒體細胞色素C氧化酶（COX）活性檢測，并進行海馬神經(jīng)元中性紅尼氏染色形態(tài)計量學病理分析。結果：與正常組相比，STZ組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05）；平臺撤除后目標象限游泳時間顯著減少（P＜0.05）；海馬ATP和COX水平顯著降低（P＜0.05）；海馬神經(jīng)元形態(tài)皺縮、變性，神經(jīng)元胞體數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。結論：ICV STZ所致病理模型大鼠出現(xiàn)明顯空間認知障礙及海馬神經(jīng)元變性，同時線粒體功能嚴重受損，提示ICV STZ可破壞大腦海馬神經(jīng)元線粒體功能，干擾腦內(nèi)正常能量代謝，是引起神經(jīng)元變性及認知功能受損的重要機制，ICV STZ所致癡呆模型可發(fā)展為能量代謝障礙性之AD病理模型。

關鍵詞鏈脲佐菌素；老年性癡呆；線粒體功能；空間認知；海馬神經(jīng)

老年性癡呆（alzheimer’s disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)退行性疾病，以海馬組織結構的萎縮，神經(jīng)元數(shù)目減少為特征。AD確切發(fā)病機理尚不清楚。研究表明，能量代謝障礙是導致神經(jīng)元退變的共同通路，它與AD腦神經(jīng)元丟失、SP形成、NFT等有密切聯(lián)系［1］。AD患者腦內(nèi)普遍存在葡萄糖利用降低和氧化代謝異常，且代謝下降與癡呆的嚴重程度一致，AD患者在未出現(xiàn)神經(jīng)精神損害和影像學檢查未發(fā)現(xiàn)腦萎縮前即可見大腦頂顳葉皮層和海馬的糖代謝異常，氧化磷酸化系統(tǒng)已受到損害［2］，提示線粒體功能下降、能量代謝衰減可能是AD的早期事件。AD患者腦內(nèi)胰島素受體酪氨酸激酶活性下降，胰島素/胰島素受體信號轉導存在嚴重障礙［3］?；谝陨袭惓?，有學者提出了神經(jīng)元胰島素受體脫敏在散發(fā)性AD的發(fā)病中起重要作用的假說［4-5］。

1996年Hoyer首次使用雙側腦室定位注射（ICV）鏈脲佐菌素（STZ）的方法來干擾腦內(nèi)胰島素受體系統(tǒng)以破壞葡萄糖利用［6］。腦室注射STZ后，除海馬和皮層的葡萄糖代謝降低外，尚有小神經(jīng)膠質細胞活化的炎癥反應、氧化應激和髓鞘質損害［7-8］。該模型模擬了散發(fā)性AD的許多重要的方面，可作為研究散發(fā)性AD的一個有用的動物模型。

本研究應用MWM評價ICV STZ大鼠的空間學習記憶能力，對與學習記憶關系密切的大腦海馬進行病理切片及線粒體功能分析，探討ICV STZ所致線粒體功能損傷對空間認知及海馬神經(jīng)的影響。

1　實驗材料

STZ購自Sigma公司（St.Louis，USA，批號S0130）；中性紅、多聚甲醛購自上海化學試劑總廠；戊巴比妥鈉購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；COX定量檢測試劑盒購自上海杰美公司；MWM設備全套由北京中科院生理所生產(chǎn)。

2　方　法

2.1動物分組和造模本實驗采用清潔級SD大鼠，雄性，體重250～300g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK桂2007-0003。隨機分為ICV STZ模型組（STZ組）和正常組（NC組）各15只。參照文獻［9］，分別于第1 d和第3 d進行兩次ICV STZ造模術。大鼠以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后頭顱固定于立體定位儀上，按照《大鼠腦立體定位圖譜Ⅲ》［10］，在前囟后0.8 mm、旁開2.2 mm處，進針4.5 mm。STZ溶解于人工腦脊液（147 mmol/L NaCl；2.9 mmol/L KCl；1.6 mmol/L MgCl2；1.7 mmol/L CaCl2；2.2 mmol/L dextrose），模型組注射劑量STZ1.5mg/kg，正常組注入等體積人工腦脊液。

2.2 MWM空間學習與記憶行為測試造模后21 d，參照文獻［11］進行MWM測試，測試程序：①定位航行實驗：計量指標取逃避潛伏期。②空間探索試驗：撤除平臺計算大鼠2 min目標象限的游泳時間。

2.3海馬組織切片標本的制備MWM行為學檢測結束后，以10 mg/ml濃度的戊巴比妥鈉（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室插管快速灌注生理鹽水80 ml，再灌注預冷的4%多聚甲醛約100 ml，然后快速取出大腦置于4℃的4%多聚甲醛中后固定8 h，依次放入4℃的10%、20%、30%的蔗糖緩沖液（0.1PB，pH=7.2～7.4）中浸泡至沉底，進行冠狀連續(xù)冰凍切片，每個層面取1張腦片，片厚20 μm，每12張取1張，每只大鼠共取6張切片，進行中性紅尼氏染色。

2.4海馬神經(jīng)元中性紅尼氏染色及計數(shù)染色步驟：①0.01 mol/L PBS中洗5 min，1%中性紅染液浸泡25 min；②自來水漂洗3次，每次5 s；③梯度酒精脫水：70%、80%、95%、100%、100%酒精中各3 s；④60℃烤片約3 min；⑤玻片完全干燥后，中性樹膠封片，普通光鏡下觀察。每組選5只動物，每只取6張切片。400倍鏡下計數(shù)雙側海馬5個方格視野（CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、CA4區(qū)、DG區(qū)）具有細胞核的神經(jīng)元胞體數(shù)目。

2.5 HPLC法檢測ATP含量海馬組織按每毫克組織10 μl的量加入0.5 mol/L的高氯酸于冰上勻漿。靜置30 min，14 000 rpm，4℃，離心10 min。取上清以0.5 mol/L的KOH調pH至7.0，靜置10 min，再次離心棄沉淀。以150 mmol/L NaH2PO4緩沖液對4.6-mm-i.d× 30-mm，5-μm-particle-size hypersil BDS C-18色譜柱進行梯度洗滌。將20 ml的標準液注入色譜柱，測其滯留時間（約13 min），此期間紫外光波長調至254 nm，注入20 μl的樣品，通過對比標準液可對滯留時間出現(xiàn)的波峰進行共同色譜分析。

2.6線粒體COX活性檢測海馬取出后以生理鹽水1∶19研磨制備5%勻漿。低溫離心，2 000 rpm，16 min，取上清。COX測定按試劑盒說明書進行。

2.7統(tǒng)計學分析采用SPSS 11.5 for Windows統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示。組間各天逃避潛伏期差異比較采用重復測量多因素方差分析，組內(nèi)各天逃避潛伏期比較采用單因素方差分析，其他指標兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異。

3　結果

3.1 MWM檢測大鼠空間學習記憶能力大鼠各天逃避潛伏期及總體均值比較結果見表1。第1 d至第4 d，STZ組與NC組比較差異均具有顯著性（P＜0.05），正常組隨著訓練天數(shù)的增加，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，表現(xiàn)在第2 d與第1 d之間、第3 d與第2 d之間差異具有顯著意義。而STZ組大鼠各天逃避潛伏期兩兩比較無顯著性差異。說明ICV STZ模型大鼠空間學習能力明顯受損，表現(xiàn)為STZ組各天的學習成績均顯著低于NC組；且多次重復訓練對STZ組大鼠學習成績的提高無明顯效果。

表1　各組大鼠4天逃避潛伏期及總體均值的比較?。ā纒）

表1　各組大鼠4天逃避潛伏期及總體均值的比較?。ā纒）

注：重復測量多因素方差分析（MANOVA of repeated measuring）：①P＜0.05，與NC組相比單因素方差分析（One-way ANOVA）：a VS b，a VS c，b VS c，P＜0.05

組別　n　　第1d　　第2d　　第3d　　第4d　　均值NC組　15　 44.07±4.52a　35.76±5.07b　26.02±4.89c　23.47±6.24　 32.33±5.18 STZ組　15　 55.88±3.93①　53.86±4.85①　50.82±5.37①　50.56±3.53①52.78±4.42①

平臺撤除后，大鼠游泳軌跡反映了其對平臺的搜索策略。圖1顯示，NC組大鼠基本是在原平臺象限（目標象限）內(nèi)尋找平臺，而STZ組大鼠幾乎不會尋找平臺。表2結果顯示，STZ組目標象限游泳時間明顯低于NC組，差異具有顯著性意義（P＜0.05），說明STZ模型大鼠空間學習記憶能力明顯受損。

表2　各組大鼠空間探索實驗中目標象限游泳時間比較?。╯，±s）

表2　各組大鼠空間探索實驗中目標象限游泳時間比較?。╯，±s）

注：與NC組比較，經(jīng)t檢驗，①P＜0.05

組別　n　　時間NC組　15　50.75±5.21 STZ組　15　22.07±5.34①

圖1　空間探索試驗中撤除平臺后兩組大鼠游泳軌跡圖

3.2大鼠海馬神經(jīng)元中性紅尼氏染色形態(tài)計量學分析中性紅染色圖片見圖2。海馬神經(jīng)元計數(shù)分析結果見表3。NC組大鼠海馬神經(jīng)元結構完整，可見數(shù)量較多的神經(jīng)元胞體聚集，胞漿中尼氏體成紅色顆粒狀散在均勻分布，胞核大而圓，著色淺淡。STZ組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，細胞數(shù)量明顯減少，CA3區(qū)厚度變薄，神經(jīng)元數(shù)量顯著低于NC組（P＜0.05）。結果說明，STZ雙側腦室注射可導致大鼠大腦海馬的損傷，表現(xiàn)在海馬回神經(jīng)元胞體形態(tài)結構的異常及神經(jīng)元數(shù)量的減少。

表3　各組大鼠海馬神經(jīng)元胞體總數(shù)目比較?。▊€數(shù)，±s）

表3　各組大鼠海馬神經(jīng)元胞體總數(shù)目比較　（個數(shù)，±s）

注：與NC組比較，經(jīng)t檢驗：①P＜0.05

組別　n　　神經(jīng)元個數(shù)NC組　5　2948.72±163.94 STZ組　5　1560.18±134.05①

圖2　大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏染色圖片

3.3海馬勻漿組織ATP含量與COX活性檢測見表4，海馬組織ATP水平檢測結果顯示，STZ組與NC組比較，STZ組低于NC組（P＜0.05）；海馬組織COX活性檢測結果，STZ組顯著低于NC組（P＜0.05）。結果說明模型鼠ATP水平及COX活性均顯著低于正常組，ICV STZ可導致大腦海馬神經(jīng)元線粒體功能嚴重損傷。

表4　各組大鼠海馬ATP水平及COX活性比較　（±s）

表4　各組大鼠海馬ATP水平及COX活性比較?。ā纒）

注：與NC組比較，①P＜0.05

組別　n　ATP（μg /ml）　COX［U/（μg.min）］NC組　10　2.037±0.294　0.395±0.184 STZ組　10　0.698±0.252①　0.132±0.096①

4　討論

STZ是一種亞硝基脲衍生物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)它破壞胰島素受體的自身磷酸化和內(nèi)在酪氨酸激酶活性，增加磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性，抑制胰島素信號轉導，破壞腦中的葡萄糖和能量代謝［7］。STZ其代謝產(chǎn)物的烷化作用可產(chǎn)生活性氧基團從而導致氧化應激及線粒體和核DNA的損傷［12］。ICV STZ模型動物在沒有引起明顯血糖升高、胰腺組織異常以及胰島素免疫反應活性異常的情況下，大腦出現(xiàn)體積縮小、神經(jīng)元退性行病變，伴隨有中樞神經(jīng)元丟失、神經(jīng)膠質細胞異?；罨?、磷酸化Tau蛋白、Aβ水平升高等類似AD的廣泛病理改變［13］。

許多證據(jù)表明，線粒體能量代謝障礙在神經(jīng)退性行疾病的發(fā)生中占有重要地位，線粒體功能異常是促進和參與AD發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一［14］。線粒體不僅是有機體90%的ATP合成場所，還有產(chǎn)生超氧陰離子等活性氧、調節(jié)細胞氧化還原電勢和信號傳導等重要生理功能［15］。臨床上AD患者腦組織電鏡下發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)異常，腦勻漿也檢測到參與到線粒體能量生成的多個酶系功能或其表達都受到損害。AD患者海馬、丘腦等腦區(qū)COX的活性下降［2］、神經(jīng)元線粒體發(fā)生形態(tài)學上改變［16］，在尚未形成NFT的神經(jīng)元中就可以觀察到線粒體形態(tài)異常，線粒體變性可能是AD最早發(fā)生的病理改變之一［17］。本研究證實，與正常組相比，ICV STZ模型鼠海馬區(qū)ATP含量及線粒體COX酶活性顯著降低，海馬神經(jīng)元胞體廣泛變性和壞死，神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。表明腦室內(nèi)注射STZ可導致大腦海馬神經(jīng)元線粒體功能發(fā)生障礙，進而影響神經(jīng)元的正常功能而發(fā)生凋亡和壞死，導致海馬區(qū)大量神經(jīng)元的丟失。STZ破壞線粒體功能所導致的神經(jīng)元凋亡和壞死可能涉及相關腦區(qū)的氧化應激損傷機制。研究表明［18］，氧化應激對組織細胞造成危害的直接表現(xiàn)為損傷線粒體，導致線粒體呼吸功能受損。線粒體是活性氧和氧代謝的主要場所，線粒體功能障礙反過來導致活性氧基團的進一步升高，形成大量過氧化物，這一惡性循環(huán)使機體產(chǎn)生過度氧化應激，最終會導致神經(jīng)元凋亡或死亡。確切的具體機制仍有待更進一步的研究證實。

本研究采用經(jīng)典的MWM方法檢測大鼠的空間學習記憶能力的改變。實驗結果發(fā)現(xiàn)，ICV STZ可導致大鼠空間認知能力明顯受損，表明其存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，這與其他學者的研究結果一致［19-20］，提示STZ誘導的線粒體功能障礙介導了中樞海馬神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，最終導致大鼠的空間學習記憶能力受損。雙側腦室注射STZ破壞大腦海馬神經(jīng)元線粒體功能，干擾腦內(nèi)正常能量代謝，此為最終引起神經(jīng)元變性及認知功能受損的重要機制，雙側腦室注射STZ所致癡呆模型可發(fā)展為能量代謝障礙性之AD病理模型。

參考文獻

［1］Cardoso S M，Santana I，Swerd Low RH，et al. Mitochondria dysfunction of Alzheimer’s disease cybrids enhances A -beta toxicity［J］. J Neurochem，2004，9（6）：1417-1423.

［2］Drzezga A，Riemenschneider M，Strassner B，et al. Cerebral glucose metabolism in patients with AD and different APOE genotypes［J］. Neurology，2005，64（1）：102-108.

［3］李棟，黃晏，周文霞，等.大腦胰島素信號通路與葡萄糖代謝在阿爾茨海默病中的作用與關系［J］.國際藥學研究雜志，2016，43（1）：26-32.

［4］Revill P，Moral M A，Prous J R. Impaired insulin signaling and the pathogenesis of Alzheimer’s disease ［J］. Drugs Today（Barc），2006，42 （12）：785-790.

［5］Messier C，Teutenberg K. The role of insulin，insulin growth factor，and insulin-degrading enzyme in brain aging and Alzheimer’s disease［J］. Neural Plast，2005，12（4）：311-328.

［6］Hoyer S，Hennenberg N，Knappet S，et al. Brain glucose metabolism is controlled by amplification and desensitization of the neuronal insulin receptor ［J］. Ann NY Acad Sci，1996，777：374-379.

［7］Hoyer S，Lee S K，Loffler T，et al. Inhibition of the neuronal insulin receptor. An in vivo model for sporadic Alzheimer disease［J］. Ann N Y Acad Sci，2000，920：256-258.

［8］Weinstock M，Shoham S. Rat models of dementia based on reductions in regional glucose metabolism，cerebral blood flow and cytochrome oxidase activity［J］.JNeural Transm，2004，111 （3）：347-366.

［9］Qu Z Q，Zhou Y，Zeng Y S，et al. Protective effects of a Rhodiola crenulata extract and salidroside on hippocampal neurogenesis against streptozotocin-induced neural injury in the rat ［J］. PLoS One，2012，7（1）：e29641.

［10］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜（III）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：12-18.

［11］鐘振國，屈澤強，鮑運平，等.三七總皂苷對老年性癡呆大鼠空間探索學習記憶力的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2006，29（1）：34-37.

［12］Gille L，Schott-Ohly P，F(xiàn)riesen N，et al. Generation of hydroxyl radicals mediated by streptozotocin in pancreatic islets of mice in vitro［J］. Pharmacol Toxicol，2002，90（6）：317-326.

［13］Lester-Coll N，Rivera E J，Soscia S J，et al. Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes：Relevance to sporadic Alzheimer's disease［J］. Journal of Alzheimers Disease，2006，9（1）：13-33.

［14］Moreira P I，Cardoso SM，Santos MS，et al. The key role of mitochondria in Alzheimer’sdisease［J］.JAlzheimer’s Disease，2006，9（2）：101-107.

［15］Newmeyer D D，F(xiàn)erguson-Miller S. Mitochondria：releasing power for life and unleashing the machineries of death［J］. Cell，2003，112（4）：481-489.

［16］Baloyannis S J. Mitochondrial alterations in Alzheimer’s disease［J］. J Alzheimers Dis，2006，9（2）：119-126.

［17］Hirai k，Aliev G，Nunomura A，et al. Mitochondrial Abnormalities in Alzheimer’s Disease［J］. J Neurosci，2001，21（9）：3017-3023.

［18］Liu SS. Cooperation of a“Reactive Oxygen Cycle”with Q cycle and the proton cycle in the respiratory chainsuperoxide generation and cycling mechanisms in mitochondria［J］. J BioenergBiomembr，1999，31（4）：367-379.

［19］楊文青，馬晶，劉爭，等.側腦室注射鏈脲佐菌素致大鼠腦內(nèi)胰島素通路障礙和認知水平降低［J］.中國病理生理雜志，2013，29（3）：462-468.

［20］張玉霖，歐陽昌漢，張又枝.白藜蘆醇對側腦室注射鏈脲佐菌素誘導學習記憶障礙大鼠的保護作用［J］.湖北科技學院學報：醫(yī)學版，2015，29（5）：380-382.

（2016-02-10收稿/編輯楊繼峰）

·中藥方劑·

*通信作者，副教授，研究方向：中樞神經(jīng)損傷與修復，E-mail：quzeqiang@foxmail.com

基金項目：廣西自然科學基金資助項目（編號：2012GXNSFBA053099）；廣西高等學?？蒲匈Y助項目（編號：201203YB110）

中圖分類號：R473.74

文獻標識碼：A

文章編號：1003-0719（2016）02-0071-04