茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的初步研究

李睿思++楊永建++陳征燕++趙秀麗

摘 要：茶對人體具有降三高、減肥、提神、防老年癡呆癥等功效。然而學(xué)校大多數(shù)同學(xué)在口渴的情況下選擇喝茶葉水人數(shù)比例只占12.3%。因此，研究喝茶可能提高記憶能力、飲茶是否對青少年智力發(fā)展具有幫助具有意義。本文通過3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，分別分析了不同配比的茶葉浸提液中茶多酚的含量測定，不同加工方式的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，不同濃度的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，最終喝茶對青少年智力發(fā)展具有一定作用的結(jié)論。

關(guān)鍵詞：茶葉浸提液；小鼠；學(xué)習(xí)；記憶能力；影響

中圖分類號：R944.26 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832075

緒論

資料[1-2]表明，長期飲用碳酸飲料容易引起肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松等癥。通過調(diào)查問卷方式了解到在口渴情況下大多數(shù)同學(xué)是喝白開水，喝茶葉水（簡稱喝茶）比例只有12.3%。茶，是中華民族的舉國之飲，中國幾千年的飲茶史，足以證明飲茶的重要性。有資料[3]表明，茶葉中有益的成份主要是茶多酚和茶多糖，喝茶對人體有許多益處：如降血糖、降血壓、降血脂，可減肥、提神等，還可以防老年癡呆癥。

老年癡呆癥的癥狀之一是漸進(jìn)式記憶障礙，而記憶能力是智力的重要組成，對學(xué)習(xí)能力影響非常大。青少年時(shí)期是一個(gè)人智力發(fā)展的高峰期，在國家提倡大健康的背景下，飲茶能否對青少年智力發(fā)展提供有益的幫助，這是值得研究的問題。通過查閱文獻(xiàn)，相關(guān)研究資料很少。因此決定建立“茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的初步研究”課題，對該問題進(jìn)行研究。

1 材料和方法

課題組從2015年9月—2016年2月，利用課余、節(jié)假日，進(jìn)行了以下3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，分別是不同配比的茶葉浸提液中茶多酚含量的測定、不同加工方式的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響、不同濃度的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1.1 實(shí)驗(yàn)1

不同配比的茶葉浸提液中茶多酚含量的測定

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料采用按制造工藝分類的茶葉，即紅茶和綠茶，采用市場上常見的品牌和產(chǎn)地茶葉。實(shí)驗(yàn)使用的綠茶為一級的龍井茶，產(chǎn)地是浙江杭州錢塘產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號為GB/T18650 ，廠商是杭州憶江南茶業(yè)有限公司；紅茶則為一級大紅袍，原料產(chǎn)地為云南臨滄，而產(chǎn)地則是福建漳州，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號為GB/T13738.2，廠商是漳州天福茶業(yè)有限公司。另外，本次實(shí)驗(yàn)還用到了購買于上海金穗生物科技有限公司的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%）、 KMnO4溶液、3moL/L H2SO4溶液、鄰二氮菲亞鐵指示劑（0.025moL/L）等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品配置

茶葉浸提液配比時(shí)，統(tǒng)一使用75mL的沸水，通過控制茶葉的重量來提取不同濃度的茶葉浸提取液。具體是分別將0.75g、0.83g、0.94g、1.07g、1.25g、1.50g、1.88克、2.50g、3.75g、7.50g的茶葉放入75mL的沸水中浸泡10min，得到配比為1：100、1：90、1：80、1：70、1：60、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10的浸提液。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在本次實(shí)驗(yàn)中主要采用的是高錳酸鉀滴定法[5]，用于測定各樣品中茶多酚的含量。

1.2 實(shí)驗(yàn)2

不同加工方式的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)使用的動物是ICR雄性小鼠，鼠齡3周（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心購得，許可證號：scxk（浙）2008-0033），飼料是由浙江省實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)基地、浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心共同制造的，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為GB14924-2001。另外，墊料是經(jīng)121℃、30min高壓蒸汽滅菌木質(zhì)刨花，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心購得，綠茶和紅茶與實(shí)驗(yàn)一的相同。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為：對照1組——小鼠11只，飲用水為去氯自來水（存放24h后自來水）；綠茶組——小鼠15只，飲用水為配比1：30的綠茶浸提液；紅茶組——小鼠15只，飲用水為配比1：30的紅茶浸提液。3組小鼠其它生活條件相同。根據(jù)文獻(xiàn)[4]和人們的喝茶習(xí)慣，本實(shí)驗(yàn)采用配比為1：30的茶葉浸提液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 觀察法

觀察法主要指的是在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室，小鼠自由攝食，飲水，飼養(yǎng)觀察35d，每天觀察小鼠活動情況，記錄小鼠飲水量，攝食量，每周稱量小鼠體重。

1.2.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

在飼養(yǎng)35d后，小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3d，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為“定位航行”和“空間搜索”2部分，定位航行實(shí)驗(yàn)4d，每天記錄小鼠潛伏期；空間搜索實(shí)驗(yàn)1d，記錄小鼠穿越平臺次數(shù)和Ⅰ象限的時(shí)間，通過這些數(shù)據(jù)來測試小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.3.3 生化指標(biāo)檢測

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖小鼠，提取腦組織，檢測腦組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。主要包括MDA含量測定和SOD活性測定，其中MDA含量測定主要采用的是硫代巴比妥酸（TBA）法[6]，操作步驟按MDA測定試劑盒說明操作，而SOD活性測定則是采用WST-1法[7]，按SOD測試盒說明操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)3

不同濃度的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)二的相同

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組為

對照2組——10只，飲用水為去氯自來水（存放24h后自來水）；綠茶組（1：10）——10只，飲用水為配比1：10的綠茶浸提液；綠茶組（1：30）——10只，飲用水為配比1：30的綠茶浸提液；綠茶組（1：100）——10只，飲用水為配比1：100的綠茶浸提液；紅茶組（1：10）——10只，飲用水為配比1：10的紅茶浸提液；紅茶組（1：30）——10只，飲用水為配比1：30的紅茶浸提液；紅茶組（1：100）——10只，飲用水為配比1：100的紅茶浸提液。

7組小鼠其它生活條件相同。且根據(jù)實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果，配比為1：10的茶葉浸提液中茶多酚的含量約為1：30的一倍，而配比為1：100的茶葉浸提液中茶多酚的含量約為1：30的50%，故本實(shí)驗(yàn)采用這3個(gè)配比。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)56d后，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)；進(jìn)行自主活動實(shí)驗(yàn)，這主要反映小鼠心理緊張程度。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行自主活動實(shí)驗(yàn)，自主活動箱模擬夜晚情景，分別將每只小鼠單獨(dú)放入測試箱中，打開風(fēng)扇、日光燈和攝像機(jī)開關(guān)。實(shí)驗(yàn)總時(shí)間為8min，小鼠熟悉環(huán)境3min，測定自主活動5min。儀器自動記錄每只小鼠總活動路程、總活動時(shí)間、在測試箱中央?yún)^(qū)域活動的路程（中央活動路程）、在測試箱中央?yún)^(qū)域活動和停留總時(shí)間（中央活動和停留總時(shí)間）、在中央?yún)^(qū)域活動的時(shí)間（中央活動時(shí)間）、在4個(gè)邊上活動和停留的總時(shí)間（邊上活動和停留總時(shí)間）、在4個(gè)邊上活動的時(shí)間（邊上的活動時(shí)間）7項(xiàng)數(shù)據(jù)，再人工記錄小鼠排便粒數(shù)；檢測生化指標(biāo)。自主活動實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖小鼠，提取腦組織，檢測腦組織乙酰膽堿脂酶（ACh）[8]的活性、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

2 研究結(jié)果

2.1 不同配比茶葉浸提液中茶多酚的含量

采用高錳酸鉀滴定法測定茶葉浸提液中茶多酚的含量，通過觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以發(fā)現(xiàn)：不論是綠茶還是紅茶，隨著茶葉量的增加，茶葉浸提液中茶多酚的含量增加；2種茶葉相比，綠茶浸提液中茶多酚的含量高于對應(yīng)配比的紅茶浸提液中茶多酚的含量。

2.2 不同加工方式的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2.1 日常記錄情況

要進(jìn)行攝食量的比較。通過觀察各組小鼠平均每只每天的攝食量可以發(fā)現(xiàn)：綠茶組與紅茶組在攝食量上差別不大。與對照1組相比，第1周，綠茶組與紅茶組的攝食量比對照1組稍多，之后幾周均比對照1組稍少；進(jìn)行飲水量的比較。實(shí)驗(yàn)表明：綠茶組和紅茶組小鼠在飲茶水量上相差不大，且與對照1組的飲水量也相差不大；再比較體重。結(jié)果表明：與對照1組相比，前4周，綠茶組和紅茶組小鼠的體重均大于對照1組，第5周趨向相同；進(jìn)行茶多酚攝入量的比較。根據(jù)實(shí)驗(yàn)一結(jié)果和小鼠飲茶量、體重，可以發(fā)現(xiàn)：綠茶組小鼠的每天每克體重茶多酚攝入量（平均值）比紅茶組多，2者隨著小鼠的體重增加呈減少趨勢，但每天每只小鼠的茶多酚攝入量增加。

2.2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

潛伏期是小鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時(shí)間，它反映小鼠學(xué)習(xí)和記憶的能力。潛伏期越短，說明小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力越好。由Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：綠茶組小鼠與對照1組的潛伏期變化趨勢大致相同，綠茶組小鼠的潛伏期總體上比對照1組短。紅茶組在訓(xùn)練期間潛伏期一直呈下降趨勢，且在第1天、第2天、第4天的潛伏期均比對照1組少。另外，穿越平臺次數(shù)和Ⅰ象限時(shí)間（%）反映的是小鼠對原先平臺空間位置記憶的保持能力。穿越平臺次數(shù)越多、在Ⅰ象限時(shí)間（%）（原先平臺所處的象限）越多，說明小鼠對原先平臺位置記憶能力越好。而且綠茶組小鼠的穿越平臺次數(shù)和在Ⅰ象限時(shí)間（%）均比對照1組多，紅茶組小鼠停留在Ⅰ象限時(shí)間（%）比對照1組多。

2.2.3 生化指標(biāo)檢測

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，提取小鼠腦組織，檢測腦組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，從機(jī)理上判定茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。檢測結(jié)果如下表1。

從表1可知，與對照1組相比，綠茶組與紅茶組小鼠的腦內(nèi)MDA含量較低，p值均<0.01，存在顯著性差異；綠茶組與紅茶組小鼠的腦內(nèi)SOD活性有所下降，但p值均>0.05，沒有顯著性差異。說明小鼠連續(xù)飲用紅茶、綠茶浸提液均會降低腦內(nèi)MDA含量，可能減少腦內(nèi)神經(jīng)元病理損傷、提高學(xué)習(xí)記憶能力。與綠茶組相比，紅茶組小鼠的腦內(nèi)MDA含量較低，且p=0.0021<0.01，存在極顯著性差異。SOD活性有所下降，但p值>0.05，沒有顯著性差異。說明紅茶浸提液可能對小鼠效果更好。

2.3 不同濃度的茶葉浸提液對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.3.1 紅、綠茶1：10配比組小鼠生存情況

配比為1：10實(shí)驗(yàn)組：小鼠每天每克體重茶多酚攝入量綠茶組為0.3152mg、紅茶組為0.2087mg， 5d內(nèi)死亡達(dá)70%、50%，結(jié)論提示高濃度的茶葉浸提液可能影響小鼠生存。

2.3.2 綠茶其它配比組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過比較綠茶組（1：30）、（1：100）的茶多酚攝入量可以發(fā)現(xiàn)：2種不同配比的綠茶組、小鼠每天每克體重茶多酚攝入量（平均值）1：30實(shí)驗(yàn)組比1：100實(shí)驗(yàn)組多，2者隨著小鼠的體重增加呈減少趨勢。但每天每只小鼠的茶多酚攝入量增加。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，將飼喂8周后的小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測試小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

由“綠茶組”Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)到第5天時(shí)，綠茶組（1：100）的潛伏期有明顯縮短，但各組小鼠之間沒有顯著性差異；本實(shí)驗(yàn)通過記錄Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)的穿越平臺次數(shù)和Ⅰ象限時(shí)間（%）發(fā)現(xiàn)：綠茶組（1：100）、（1：30）的穿越平臺的次數(shù)與對照2組相比，p值<0.05，存在顯著性差異；綠茶組（1：100）穿越平臺的次數(shù)最多，結(jié)論提示飲用配比為1：100的綠茶浸提液可能效果更好。另外，通過觀察“綠茶組”自主活動實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出：自主活動實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)指標(biāo)沒有同一性變化趨勢，且各組之間p值均>0.05，沒有顯著性差異；在進(jìn)行生化指標(biāo)檢測時(shí)，Ach含量是考察學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)，小鼠腦內(nèi)Ach含量升高，會增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。小鼠腦內(nèi)MDA含量降低、SOD升高，抗氧化作用增強(qiáng)，也可能會增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。由“綠茶組”小鼠腦組織生化指標(biāo)檢測結(jié)果如圖2表示。

從表2可以得出：綠茶組（1：100）小鼠腦中的乙酰膽堿脂酶（ACh）的活性最高，與對照2組相比，p值<0.01，存在極顯著差異；綠茶組（1：100）、綠茶組（1：30）小鼠腦中的丙二醛（MDA）的含量較低，與對照2組相比，p值<0.05，存在顯著性差異。

2.3.3 紅茶組

通過觀察紅茶組（1：30）、（1：100）的茶多酚攝入量曲線可以發(fā)現(xiàn)2種不同配比的紅茶組、小鼠每天每克體重茶多酚攝入量（平均值）1：30實(shí)驗(yàn)組比1：100實(shí)驗(yàn)組多，2者隨著小鼠的體重增加呈減少趨勢。但每天每只小鼠的茶多酚攝入量增加。在進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過觀察“紅茶組”Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期結(jié)果表明：第4天，紅茶（1：30）的潛伏期有明顯縮短，有增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的趨勢，但各組之間無顯著性差異。此外，通過觀察“紅茶組”Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)的穿越平臺次數(shù)和Ⅰ象限時(shí)間（%）的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：紅茶組（1：30）的穿越平臺的次數(shù)最多，但各組之間相比，p值均>0.05，沒有顯著性差異。在I象限時(shí)間（%）中，紅茶組（1：100）最多，與對照2組相比，p值<0.05，存在顯著性差異，所以紅茶組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)綜合結(jié)論：紅茶（1：100）、（1：30）配比的浸提液均有可能提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，配比為1：100的紅茶浸提液可能效果更好。另外，本次實(shí)驗(yàn)對“紅茶組”自主活動實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了詳細(xì)的分析，通過對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自主活動實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)指標(biāo)對心理緊張程度不一致，且各組小鼠之間p值均>0.05，沒有顯著性差異，說明小鼠連續(xù)飲用不同濃度的紅茶浸提液對心理緊張程度沒有相關(guān)性。進(jìn)行“紅茶組”腦的生化指標(biāo)檢測，結(jié)果如表3所示。

從表3可以得出：紅茶組（1：30）小鼠腦中的乙酰膽堿脂酶（ACh）的活性最高，與對照2組相比，p值<0.01，存在極顯著差異；與紅茶組（1：100）相比， p=0.0048<0.01，存在極顯著性差異。結(jié)論表明，小鼠飲用配比為1：30的紅茶浸提液更有利提高學(xué)習(xí)記憶能力。

3 結(jié)論

經(jīng)過3組實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)：隨著茶葉量的增加，浸提液中茶多酚的含量會隨之增加，綠茶增加的量會高于紅茶，實(shí)驗(yàn)二說明小鼠連續(xù)飲用茶葉浸提液可能有利于身體的發(fā)育，提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，綠茶與紅茶沒有明顯差異；實(shí)驗(yàn)三則表明高濃度的紅茶、綠茶浸提液均會影響小鼠生存，濃度為1：100配比的紅茶、1：30配比的綠茶浸提液均有可能提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但對心理緊張程度無相關(guān)性，飲用配比為1：30的紅茶浸提液、配比為1：100的綠茶浸提液可能效果更好。

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