氧化損傷誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞系基因表達(dá)譜的差異和表型改變

梅　林，王　嵩，閆　博，楊安鋼，趙　晶，嚴(yán)　宏

?

·實驗論著·

氧化損傷誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞系基因表達(dá)譜的差異和表型改變

梅林1，王嵩1，閆博2，楊安鋼2，趙晶2，嚴(yán)宏1

Citation:Mei L, Wang S, Yan B,etal. Discrepant gene expression profile and phenotype changes in human lens epithelial cells after oxidative damage.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):822-825

摘要

目的：探討人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化刺激后基因表達(dá)譜的差異以及相應(yīng)的表型改變。

方法：培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3并給予H2O2刺激。24h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測，并采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫DAVID對氧化刺激組相比對照組顯著上調(diào)的基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能富集分析。RT-qPCR對上調(diào)的基因進(jìn)行驗證。通過MTT和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

結(jié)果：表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，氧化刺激造成HLEC中367個基因上調(diào)，GO分析表明這些基因富集于310個功能類別中，主要包括p53信號通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞程序性死亡通路等。RT-qPCR結(jié)果證實，6個主要參與促凋亡或抗凋亡調(diào)節(jié)的基因，包括BCL2A1、TP53I3、FAS、ZMAT3、DDB2和BCL2L1，在氧化刺激后表達(dá)水平明顯上升。MTT實驗和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，H2O2刺激后HLEC凋亡逐漸上升，是細(xì)胞氧化損傷的主要表現(xiàn)。

結(jié)論：氧化刺激可同時誘導(dǎo)HLEC中促凋亡基因和抗凋亡基因表達(dá)水平上調(diào)，但最終仍然導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：人晶狀體上皮細(xì)胞；氧化損傷；表達(dá)譜芯片；細(xì)胞凋亡

引用：梅林，王嵩，閆博，等.氧化損傷誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞系基因表達(dá)譜的差異和表型改變.國際眼科雜志2016;16(5):822-825

0引言

晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)是晶狀體抵抗氧化損傷、維持正常生理功能的重要防線。健康的LEC可合成抗氧化物及抗氧化酶，調(diào)節(jié)晶狀體內(nèi)環(huán)境，修復(fù)受損細(xì)胞及蛋白質(zhì)等，LEC的生理狀態(tài)對于保持晶狀體透明性至關(guān)重要[1-2]。然而，來自外界環(huán)境的刺激如紫外線照射、外傷或手術(shù)引起的局部炎癥以及糖尿病高血糖等都會對LEC造成損害，而其中一個共同途徑就是這些有害因素均能造成細(xì)胞內(nèi)活性氧簇分子(reactive oxygen species，ROS)增加，包括H2O2、O2-和·OH。當(dāng)ROS的累積超出人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)的清除能力時，就會引起細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞新陳代謝失常，進(jìn)而導(dǎo)致白內(nèi)障形成[3]。既往研究表明，氧化損傷對細(xì)胞的影響涉及到細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等諸多方面，因此研究HLEC經(jīng)受氧化損傷后最主要的表型變化并探索其阻斷策略，對進(jìn)一步了解白內(nèi)障發(fā)病機制、尋找預(yù)防或治愈白內(nèi)障的治療方法具有重要意義。

1材料和方法

1.1材料人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3來自中山大學(xué)眼科研究中心惠贈。DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司)，胰蛋白酶(上海碧云天公司)，Affymetrix Prime View表達(dá)譜芯片(美國Affymetrix公司)，Trizol試劑(日本TaKaKa公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司)，實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒(德國Qiagen公司)，RT-qPCR熒光探針(日本TaKaRa公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)，分光光度計(美國Bio-Rad公司)，實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組人晶狀體上皮細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于6cm皿中，加入4mL含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，內(nèi)含105U/L青霉素和105g/L鏈霉素。細(xì)胞置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)50mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時，向培養(yǎng)基中加入濃度為70μmol/L H2O2作為氧化損傷組，對照組細(xì)胞不予處理。24h后，使用Trizol提取細(xì)胞總RNA。

1.2.2表達(dá)譜芯片檢測總RNA樣品經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳進(jìn)行質(zhì)檢，合格的RNA樣品采用Affymetrix表達(dá)譜芯片配套試劑盒，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程對樣品RNA中的mRNA進(jìn)行放大、標(biāo)記和純化，獲得帶有生物素標(biāo)記的cRNA。雜交時，采用雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中45℃，16h滾動雜交，并在洗滌工作站按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行芯片的洗滌。采用GeneChip Scanner 3000對芯片結(jié)果進(jìn)行掃描，采用Command Console Software 4.0讀取原始數(shù)據(jù)，采用Gene Spring Software 11.0中的RMA算法對質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理[1,4]。

1.2.3 Gene Ontology分析根據(jù)表達(dá)譜芯片結(jié)果，將氧化損傷組相比于對照組表達(dá)量比值>2.0者定義為上調(diào)差異基因，并采用DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)，對差異基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能富集分析。應(yīng)用Fisher精確概率法找出差異基因中，相比整個基因組背景相比，顯著富集的基因功能分類。P<0.05的功能分類定義為在差異基因中顯著富集。

1.2.4 RT-qPCR檢測使用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計對RNA樣品質(zhì)檢并定量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)操作流程獲取cDNA，并進(jìn)行RT-qPCR檢測，反應(yīng)體系為20.0μL：熒光探針10.0μL、上下游引物各1.0μL、cDNA模板2.0μL、去離子水6.0μL。反應(yīng)條件：第一步95℃，3min；第二步95℃，10s；第三步55℃，15s；第四步72℃，15s。其中第二步到第四步設(shè)40個循環(huán)[1]。BCL2A1：上游，5’-GCAGTGTGGTCTCCGAATGTCT-3’；TP53I3：上游，5’-AAGGAAATAACCACCATGTTAGCCGTGCAC-3’[5]；FAS：上游，5’-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3’[6]；ZMAT3：上游，5’-ATGATCCTCTTGCAACACG-3’[7]；DDB2：上游，5’-TCACTTCCAGCACCTCACAC-3’；BCL2L1：上游，5’-GGACAGCATATCAGAGCTTTGAACA-3’[8]；GAPDH作為內(nèi)參：上游，5’-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3’。所有下游引物均采用RT-qPCR試劑盒中的通用引物。

1.2.5 MTT實驗將HLE-B3以5000/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)至80%孔底面積，吸出培養(yǎng)液，加入含70μmol/L H2O2的新配培養(yǎng)液，分別于12、18、24、36h后，進(jìn)行MTT實驗，方法為：每孔加入5mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)4h后，吸出廢液，每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速搖勻10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490nm處測量各孔的吸光值。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡以同樣方法對HLE-B3進(jìn)行H2O2刺激。24h后，收集氧化損傷組和對照組細(xì)胞，PBS洗滌后重懸。根據(jù)凋亡檢測試劑盒的使用說明，對細(xì)胞分別進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色，使用流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞，并分析最終結(jié)果。

統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)以常氧組與低氧組間相對比值表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1氧化損傷組與對照組的mRNA表達(dá)譜差異表達(dá)譜芯片中顯著上調(diào)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：氧化損傷組表達(dá)量與對照組表達(dá)量比值>2.0。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，H2O2刺激誘導(dǎo)氧化損傷共引起367個mRNA表達(dá)上調(diào)，部分結(jié)果見表1。功能富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)的基因富集于310個相關(guān)分類中，富集值最高的分類為p53信號通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞程序性死亡通路等(圖1)。

2.2表達(dá)譜芯片結(jié)果驗證經(jīng)RT-qPCR對BCL2A1、TP53I3、FAS、ZMAT3、DDB2、BCL2L1表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。這些數(shù)據(jù)表明，氧化損傷發(fā)生后，此6個基因表達(dá)水平相比對照組顯著提高(圖2)，實驗結(jié)果與表達(dá)譜芯片結(jié)果相吻合。

2.3氧化損傷誘導(dǎo)HLEC細(xì)胞發(fā)生凋亡MTT實驗結(jié)果表示，HLE-B3細(xì)胞經(jīng)過H2O2刺激后，隨著時間延長，細(xì)胞凋亡逐漸增加，直至氧化刺激后36h，僅7%細(xì)胞存活(圖3)。Annexin V-FITC/PI染色后流式細(xì)胞儀分析顯示，H2O2刺激后24h，存活細(xì)胞約占25%，而凋亡細(xì)胞比例達(dá)到57%，其結(jié)果與MTT實驗大致相符(圖4)。

3討論

圖1實驗組相比對照組上調(diào)差異基因的聚類分析(氧化損傷在細(xì)胞凋亡、程序性死亡通路、細(xì)胞活力等310個分類中有最高差異值)。

大量研究表明，ROS是晶狀體混濁及白內(nèi)障發(fā)病的罪魁禍?zhǔn)?。正常情況下，ROS可以被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)及時清除，但是當(dāng)ROS產(chǎn)生增加，或衰老等因素導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力減弱時，ROS就會在體內(nèi)累積，造成氧化損傷[9]。

表1氧化損傷后顯著上調(diào)的基因

基因ID英文縮寫英文全稱上調(diào)比值NM_153361IL8Interleukin86.80NM_006516BCL2A1B-celllymphoma2-relatedproteinA15.78NM_018689TP53I3Tumorproteinp53inducibleprotein35.59NM_020768FASFas(TNFreceptorsuperfamily,member6)5.08NM_022470ZMAT3Zincfinger,matrin-type33.48NM_004994MMP9Matrixmetallopeptidase93.20NM_000089LCE1FLatecornifiedenvelope1F3.10NM_001001669SAT1Spermidine/spermineN1-acetyltransferase13.09NM_006252KANK3KNmotifandankyrinrepeatdomains33.05NM_030915DDB2Damage-specificDNAbindingprotein22.95NM_000302RRM2BRibonucleotidereductaseM2B2.92NM_001191BCL2L1B-celllymphoma2-like12.76NM_001025366CASP1Caspase1,apoptosis-relatedcysteinepeptidase2.69NM_000610CD44CD44molecule2.51

圖2RT-qPCR驗證過氧化氫刺激后所選基因mRNA水平提高bP<0.01vs對照組。

圖3氧化刺激后，HLEC存活率隨著時間推移逐漸下降。

表2氧化損傷后高表達(dá)基因RT-qPCR驗證結(jié)果

±s

圖4過氧化氫處理24h后HLEC的凋亡水平。

本研究利用表達(dá)譜芯片對氧化損傷后HLEC基因表達(dá)水平的變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，氧化損傷組367個基因的表達(dá)水平相比于對照組明顯上調(diào)。通過GO分析，我們發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的差異基因大部分位于細(xì)胞凋亡或程序性死亡相關(guān)信號通路中。由此推測，凋亡可能是氧化損傷對HLEC的最主要影響。首先，p53信號通路的激活最為顯著。p53是目前研究相對明確的抑癌基因，它可以通過阻斷細(xì)胞周期、加速細(xì)胞衰老、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[10]。有研究表明，p53相關(guān)凋亡通路對調(diào)控HLEC凋亡以及白內(nèi)障的生成具有重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)水平上調(diào)的p53下游基因中，以TP53I3和FAS較為典型。TP53I3是DNA損傷應(yīng)答(DDR)系統(tǒng)中的一員，當(dāng)DNA發(fā)生輕度損傷時，可激活TP53I3，參與受損DNA的修復(fù)。同時，DDR系統(tǒng)會活化p53，一方面可以阻斷細(xì)胞周期來配合DNA損傷的修復(fù)，另一方面p53可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多活化的TP53I3，但這一過程會產(chǎn)生少量ROS。因此當(dāng)外界刺激造成DNA嚴(yán)重?fù)p傷時，就會引起p53極端過表達(dá)并激活更多下游基因與TP53I3相互作用，導(dǎo)致ROS累積，最終啟動細(xì)胞凋亡信號通路，如FAS[12]。FAS是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，也是p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游調(diào)控基因，當(dāng)配體FasL與受體FasR結(jié)合后，會通過銜接蛋白活化起始caspase，再經(jīng)過caspase酶家族的其他成員將信號逐級放大傳播，最終啟動凋亡程序[13]。由此我們推測，本研究中，當(dāng)HLEC經(jīng)歷氧化刺激后，TP53I3的高表達(dá)一方面代表了DDR系統(tǒng)的激活，另一方面也意味著p53依賴的促凋亡信號通路的啟動，而FAS的高表達(dá)可能直接導(dǎo)致了細(xì)胞的程序性死亡。其次，在諸多促凋亡基因高表達(dá)的同時，我們注意到，一些抑制凋亡基因的表達(dá)水平也有著明顯上升，如ZMAT3、BCL2A1和BCL2L1。其中ZMAT3也是p53的下游基因之一。p53可以誘導(dǎo)ZMAT-3產(chǎn)生一種鋅指蛋白，并作用于p53的下游基因如FAS，起到加速其mRNA降解的作用，抑制細(xì)胞凋亡[14]。除了ZMAT3、BCL2A1和BCL2L1作為BCL2家族抗凋亡分子中的成員，其高表達(dá)可能也對抑制HLEC凋亡起重要作用。線粒體外膜透化并釋放細(xì)胞色素C是細(xì)胞凋亡通路中的重要環(huán)節(jié)，而這一環(huán)節(jié)的啟動源于BH3-only蛋白(BCL2 homology domain 3-only protein)與線粒體外膜的BAX、BAK受體結(jié)合，BCL2家族的抗凋亡分子可以與BH3-only蛋白作用使其失活，或競爭性結(jié)合BAX和BAK，從而阻斷細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡[15]。由此可見，HLEC氧化損傷后，促凋亡基因與抗凋亡基因均有上調(diào)，而二者拮抗的結(jié)果將決定細(xì)胞的命運。因此，我們對H2O2氧化刺激后細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行了檢測。MTT實驗表示，細(xì)胞經(jīng)H2O2處理12h時，仍有85%細(xì)胞存活，隨后存活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，由此推測細(xì)胞的損傷修復(fù)和抗凋亡系統(tǒng)在氧化刺激初期可修復(fù)部分損傷、抵抗凋亡信號通路。隨著時間的推移，由于氧化損傷較為嚴(yán)重，細(xì)胞的修復(fù)功能無法代償，于是更多細(xì)胞發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果也表示，H2O2后24h，約75%細(xì)胞死亡，其中超過70%細(xì)胞發(fā)生了凋亡，壞死細(xì)胞僅占不到30%，說明大多數(shù)細(xì)胞的死亡源于氧化刺激后凋亡程序的啟動。

綜上所述，細(xì)胞凋亡是HLEC發(fā)生氧化損傷后的重要表現(xiàn)，這一過程涉及多個凋亡和抗凋亡信號通路的調(diào)節(jié)。未來我們將對這些通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行更為詳細(xì)的研究，以進(jìn)一步了解細(xì)胞凋亡在白內(nèi)障發(fā)病過程中的作用，并為臨床上通過抑制HLEC細(xì)胞凋亡以預(yù)防或治療白內(nèi)障提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1王嵩，梅林，閆博，等.生理低氧對人晶狀體上皮細(xì)胞系基因表達(dá)譜的影響.眼科新進(jìn)展 2015;35(5):409-412

2 Lou MF. Thiol regulation in the lens.JOculPharmacolTher2000;16(2):137-148

3 Martinez G, de Iongh RU. The lens epithelium in ocular health and disease.IntJBiochemCellBiol2010;42(12):1945-1963

4王嵩.參與生理氧環(huán)境下人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷關(guān)鍵基因的篩選與鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)碩士論文2015

5 Lee JH, Kang Y, Khare V,etal. The p53-inducible gene 3(PIG3) contributes to early cellular response to DNA damage.Oncogene2010;29(10):1431-1450

6 Seo JC, Han SW, Yin CS. Evaluation of a Apo-1/Fas promoter polymorphism in Korean stroke patients.ExpMolMed2002;34(4):294-298

7 Luo S, Bai Y, Lan H. Influence of interference of WIG-1 on the multi-drug resistance in small cell lung cancer.ZhonghuaZhongLiuZaZhi2014;36(10):733-738

8 Sun WC, Liang ZD, Pei L. Propofol-induced rno-miR-665 targets BCL2L1 and influences apoptosis in rodent developing hippocampal astrocytes.Neurotoxicology2015;51:87-95

9 Lou MF. Redox regulation in the lens.ProgRetinEyeRes2003;22(5):657-682

10 Brooks CL, Gu W. Ubiquitination, phosphorylation and acetylation:the molecular basis for p53 regulation.CurrOpinCellBiol2003;15(2):164-171

11 Lim SA, Joo CK, Kim MS,etal. Expression of p53 and caspase-8 in lens epithelial cells of diabetic cataract.JCataractRefractSurg2014;40(7):1102-1108

12 Kotsinas A, Aggarwal V, Tan EJ,etal. PIG3:A novel link between oxidative stress and DNA damage response in cancer.CancerLett2012;327(1-2):97-102

13 Cullen SP, Martin SJ. Fas and TRAIL ‘death receptors’ as initiators of inflammation:implications for cancer.SeminCellDevBiol2015;39:26-34

14 Bersani C, Xu LD, Vilborg A,etal. Wig-1 regulates cell cycle arrest and cell death through the p53 targets FAS and 14-3-3σ.Oncogene2014;33(35):4407-4417

15 Vogler M. BCL2A1:the underdog in the BCL2 family.CellDeathDiffer2012;19(1):67-74

Discrepant gene expression profile and phenotype changes in human lens epithelial cells after oxidative damage

Lin Mei1, Song Wang1, Bo Yan2, An-Gang Yang2, Jing Zhao2, Hong Yan1

Foundation item:National Natural Science Foundation of China(No. 81370997)

1Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China;2Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Hong Yan. Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China. yhongb@fmmu.edu.cn

Received：2016-02-22Accepted：2016-04-11

Abstract

?AIM:To explore the discrepant gene expression profiles and the related phenotype changes in human lens epithelial cells(HLEC) after oxidative stimulation.

?METHODS:Human lens epithelial cell line(HLE-B3) were cultured in normal condition or with H2O2for 24h. Total RNA were extracted for gene expression profiling assay and gene ontology analysis was performed for the significantly up-regulated genes using bioinformational database DAVID. The elevated expressions of up-regulated genes in HLEC after oxidative stimulation were confirmed by RT-qPCR. The apoptosis of HLEC induced by oxidative damage was detected using 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometry.

?RESULTS:Gene expression profiling assay demonstrated that 367 genes were up-regulated in HLEC after oxidative stimulation. These genes were enriched in 310 biological processes mainly associated with p53-related signaling pathways, apoptosis, programed cell death and etc. Six genes mainly pro- or anti-apoptotic, including BCL2A1,TP53I3,FAS,ZMAT3,DDB2 and BCL2L1, were confirmed to be up-regulated by oxidative stimulation using RT-qPCR(P<0.05). Results of MTT assay and flow cytometry showed that apoptosis of HLEC gradually appeared after cells were treated with H2O2and became the main consequence of oxidative stimulation.

?CONCLUSION:Oxidative stimulation can induce up-regulation of proapoptotic genes and lead to apoptosis of HLEC, even though antiapoptotic genes can also be promoted.

KEYWORDS:?human lens epithelial cells;oxidative damage;gene expression profile;apoptosis

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.07

收稿日期：2016-02-22 修回日期： 2016-04-11

通訊作者：嚴(yán)宏，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：白內(nèi)障、小兒眼病.yhongb@fmmu.edu.cn

作者簡介：梅林，在讀博士研究生，研究方向：白內(nèi)障。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No.81370997)
作者單位：
1(710038)中國陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院眼科；
2(710032)中國陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室