含1,2,4,5-四取代苯基的吡唑-4-甲酰胺類化合物的設(shè)計、合成及生物活性

董心睿，夏 喆，王楨學(xué)，邊 強，李華斌

（南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院,天津300071）

吡唑甲酰胺類化合物含有吡唑和酰胺2種高活性結(jié)構(gòu)基團，因而具有廣泛的生物活性.自20世紀(jì)40年代以來，在農(nóng)藥開發(fā)領(lǐng)域不斷有文獻報道具有生物活性的吡唑甲酰胺類衍生物，其中報道最多的是殺蟲劑［1～8］和殺菌劑［9，10］，此外，具有除草活性、殺螨活性及其它生物活性的吡唑甲酰胺類化合物也相繼被報道［11～13］，如吡螨胺、唑蟲酰胺和呋吡菌胺等農(nóng)藥新品種.吡唑甲酰胺類農(nóng)藥因其作用機理獨特、安全高效、無互抗性、有效用量小及吡唑環(huán)上取代基多方位變化等優(yōu)點而備受關(guān)注.吡唑甲酰胺類化合物由于酰胺基在吡唑環(huán)上的取代位點不同而產(chǎn)生不同的生物活性.其中，當(dāng)酰胺基在吡唑環(huán)的4-位時，多數(shù)表現(xiàn)出較好的殺菌活性［14～17］，部分化合物表現(xiàn)出較好的除草活性、殺蟲活性和殺螨活性等［18～21］.該類化合物具有代表性的品種為日本住友化學(xué)公司開發(fā)的呋吡菌胺（Furametpyr）［22］.呋吡菌胺于1997年上市，對擔(dān)子菌綱的大多數(shù)病菌尤其是水稻紋枯病具有優(yōu)異防治效果，大田防治的劑量為有效成分450～600 g/hm2.其作用機制是通過抑制真菌線粒體中琥珀酸的氧化，從而避免立枯絲核菌菌絲體分離，而對真菌線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化無影響.2003年，日本三井化學(xué)株式會社在英國植保會議上介紹了新的酰胺類殺菌劑吡噻菌胺（Penthiopyrad）［23］.該藥劑有效成分劑量通常為100～200 g/hm2，其殺菌譜廣，對銹病和菌核病顯示出優(yōu)異活性，對灰霉病、白粉病和蘋果黑星病也顯示出較好的抑制活性.

丙炔氟草胺（Flumioxazin）［24］是日本住友工業(yè)株式會社創(chuàng)制并開發(fā)的N-苯基鄰氨甲酰亞胺類除草劑，于播種后出苗前按有效成分60～90 g/hm2施用，對花生安全，對馬齒莧、反枝莧和藜等花生田等常見闊葉雜草有顯著防治效果.唑草酮（Carfentrazone-ethyl）［25］是1990年由美國富美實（FMC）公司開發(fā)的三唑啉酮類除草劑，于苗后莖葉處理，使用劑量通常為9～35 g/hm2，主要用于防除闊葉雜草和莎草，適用于小麥、大麥、水稻和玉米等作物田.上述2個除草劑品種都屬于原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑，即通過抑制葉綠素生物合成過程中原卟啉原氧化酶而引起細胞膜破壞，使葉片迅速干枯、死亡.該類除草劑具有微量高效、生態(tài)環(huán)境友好且不易產(chǎn)生抗性等特點［26～29］，具有很高的研究價值和應(yīng)用前景.目前，已經(jīng)有30多種PPO抑制劑被研發(fā)［30］.研究結(jié)果表明，該類除草劑的結(jié)構(gòu)共性為含有1，2，4，5-四取代苯基.

為了發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、高效低毒且作用機制獨特的新型農(nóng)藥，本文通過活性亞結(jié)構(gòu)拼接的方式，保持呋吡菌胺和吡噻菌胺的吡唑-4-甲酰胺結(jié)構(gòu)，引入1，2，4，5-四取代苯基，設(shè)計并合成了一系列含1，2，4，5-四取代苯基的吡唑-4-甲酰胺類化合物，目標(biāo)化合物的設(shè)計思路如圖1所示.對所有目標(biāo)化合物進行了殺菌活性篩選，并對其構(gòu)效關(guān)系進行了初步分析.

Fig.1 Design strategy of 1H-pyrazole-4-carboxamides containing 1,2,4,5-tetra-substituted phenyl

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

柱層析用H型硅膠（青島海洋化工廠）；所用試劑均為國產(chǎn)分析純.Bruker Avance-300和400 MHz型核磁共振波譜（NMR）儀，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士布魯克公司；X-4型數(shù)字顯示顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司；Varian 7.0 T型傅里葉變換高分辨質(zhì)譜（HRMS）儀，美國瓦里安公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 化合物1～3的合成參照文獻［31，32］方法合成化合物1，2和3，合成路線如Scheme 1所示．

Scheme 1 Synthetic routes of compounds 5 and 5′

1.2.2 1，2，4，5-四取代苯基吡唑-4-甲酰胺（5a～5j和5′a～5′m）的合成以1-甲基-5-氨基-N-（2-氟-4-氯-5-甲氧羰基苯基）-1H-吡唑-4-甲酰胺（5a）的合成為例.在50 mL的圓底燒瓶中加入0.71 g（5 mmol）1-甲基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酸（3a），在冰鹽浴冷卻下滴加10 mL二氯亞砜，滴加完畢，自然升至室溫，攪拌3 h，減壓抽掉二氯亞砜，得0.98 g黃色固體1-甲基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酰氯（4a），不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng).在50 mL圓底燒瓶中，加入0.45 g（2.2 mmol）2-氯-4-氟-5-氨基苯甲酸甲酯、10 mL二氯甲烷和1.2 mL吡啶，用冰鹽浴冷卻至0℃以下，加入0.39 g（2 mmol）化合物4a，自然升至室溫，通過薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應(yīng)；待反應(yīng)完畢，減壓脫去溶劑，殘留液用30 mL鹽酸（1 mol/L）洗滌，過濾，固體再用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，過濾，干燥得到0.38 g灰白色固體1-甲基-5-氨基-N-（4-氯苯基）-1H-吡唑-4-甲酰胺（5a）.采用相同的方法合成5b～5j和5′a～5′m.

目標(biāo)化合物5和5′的理化數(shù)據(jù)及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1，核磁共振氫譜（1H NMR）數(shù)據(jù)列于表2.

Table 1 Appearance,melting points,yields and HRMS data of compounds 5a—5j and 5′a—5′m*

Table 2 1H NMR data of compounds 5a—5j and 5′a—5′m*

Continued

1.2.3 目標(biāo)化合物的生物活性測試將一定量的目標(biāo)化合物溶解在適量二甲基甲酰胺（DMF）中，然后用乳化水稀釋至50 mg/L，采用離體平皿法［9］測試其殺菌活性.供試病原菌包括黃瓜枯萎病菌（C.cucumerinum）、花生褐斑病菌（C.rachidicola）、蘋果輪紋病菌（P.piricola）、蕃茄早疫病菌（A.solani）、小麥赤霉病菌（G.zeae）、馬鈴薯晚疫病菌（P.infestans）、油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）、黃瓜灰霉病菌（B.cinerea）、水稻紋枯病菌（R.solani）和辣椒疫霉病菌（P.capsica）.

2 結(jié)果與討論

2.1 合成及結(jié)構(gòu)表征

以2-氰基-3-乙氧基丙烯酸乙酯（1）為原料，與取代肼反應(yīng)，關(guān)成吡唑環(huán)，得到化合物2；在堿性條件下水解，酸化后得到化合物3；然后經(jīng)過酰氯化反應(yīng)得到酰氯4，不進行分離，直接用于下一步反應(yīng)；與四取代苯胺縮合，得到目標(biāo)化合物5和5′.其中，中間體1-取代基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酰氯（4）的制備非常關(guān)鍵.因為化合物4的雙官能團（氨基和酰氯）可能會發(fā)生縮合反應(yīng)，產(chǎn)生自聚.由于取代苯胺氨基的活性比吡唑環(huán)上的氨基高，可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件而控制自聚的發(fā)生.實驗結(jié)果表明，在高溫或原料滴加速度過快時，會產(chǎn)生帶有熒光點的副產(chǎn)物，但通過普通的1H NMR不足以確定其結(jié)構(gòu).因此，在實驗過程中，需要注意以下2個條件：（1）控制反應(yīng)溫度，需要用冰鹽浴冷卻至0℃以下；（2）加入1-甲基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酰氯的速度要慢，因為該反應(yīng)會放熱.

目標(biāo)化合物的1H NMR譜解析以化合物5c為例.δ7.54處為吡唑環(huán)上氫的吸收峰，呈單峰；δ7.36處為酰胺N上氫的吸收峰，呈寬峰；δ8.15和7.15處分別為苯環(huán)上2個氫的吸收峰，被氟原子裂分，呈雙重峰，其中耦合常數(shù)大的（J=10.5 Hz）處于氟原子鄰位，耦合常數(shù)小的（J=7.4 Hz）處于氟原子間位；δ5.23處為吡唑環(huán)上的氨基氫的吸收峰，呈寬峰；δ4.60～4.52處為異丙基的次甲基吸收峰，呈多重峰；δ3.66處為吡唑環(huán)上甲基氫的吸收峰，呈單峰；δ1.41和1.37處分別為異丙基的2個甲基的吸收峰，呈單峰.

2.2 生物活性及初步構(gòu)效關(guān)系分析

對化合物5a～5′m進行了相對抑菌率測定，計算方法見下式：

相對抑菌率計算結(jié)果列于表3.化合物5和5′在50μg/mL濃度下，對10種供試病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性.其中，對于蘋果紋輪病菌，化合物5c的抑菌率達到95.5%，化合物5h和5′k的抑菌率均超過60%，化合物5d的抑菌率超過50%；對于水稻紋枯病菌，化合物5c，5i，5′a和5′j的抑菌率均超過60%；對于油菜菌核病菌，化合物5j和5′c的抑菌率均超過50%；對于黃瓜灰霉病菌，化合物5h，5′a和5′m的抑菌率最低可達50%.化合物5c表現(xiàn)出較廣的殺菌譜，對于花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌、蕃茄早疫病菌、馬鈴薯晚疫病菌和水稻紋枯病菌的抑菌率均超過50%；化合物5h對蘋果輪紋病菌、黃瓜灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌率均超過50%.

Table 3 Fungicidal activities of target compounds at 50μg/mL

初步構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，吡唑環(huán)N取代基為甲基或叔丁基時，化合物表現(xiàn)出較好的活性；整體來看，含并環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物5′殺菌活性低于含單個苯環(huán)的化合物5，如高活性化合物5c和5h均為只含單個苯環(huán)的化合物；苯環(huán)取代基R2為低于4個碳的脂肪鏈時，化合物殺菌活性更高，如化合物5c和5d；而當(dāng)苯環(huán)取代基R2為不少于4個碳的脂肪鏈或酯基時，化合物活性大幅下降，如化合物5e，5f，5g，5a和5b的殺菌活性很低.

3 結(jié) 論

利用活性亞結(jié)構(gòu)拼接的方法，設(shè)計合成了一系列含1，2，4，5-四取代苯基的吡唑-4-甲酰胺類化合物.生物活性測試結(jié)果表明，部分化合物對蘋果紋輪病菌、水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌和黃瓜灰霉病菌表現(xiàn)出較好的殺菌活性.尤其是化合物5c表現(xiàn)出較廣的殺菌譜，當(dāng)其濃度為50μg/mL時對蘋果紋輪病菌的抑菌率高達95.5%.初步構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，吡唑環(huán)N取代基為甲基或叔丁基時，化合物表現(xiàn)出較好的活性；含并環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物5′的殺菌活性低于含單個苯環(huán)的化合物5；苯環(huán)取代基R2為低于4個碳的脂肪鏈時，化合物殺菌活性更高，這為進一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了依據(jù).尤其是化合物5c，可作為先導(dǎo)化合物進行后續(xù)優(yōu)化研究.