黃顙魚促甲狀腺激素受體基因的克隆及其對(duì)飼料中添加碘化鉀的表達(dá)反應(yīng)

王春玲　章宏塔高有領(lǐng)?　錢國(guó)英?（.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波3500；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海20306）

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黃顙魚促甲狀腺激素受體基因的克隆及其對(duì)飼料中添加碘化鉀的表達(dá)反應(yīng)

王春玲1，2章宏塔1高有領(lǐng)1?錢國(guó)英1?
（1.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，寧波315100；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

摘要:本試驗(yàn)旨在得到黃顙魚促甲狀腺激素受體（TSHR）基因的cDNA全長(zhǎng)序列，同時(shí)掌握其組織表達(dá)差異，并揭示飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚甲狀腺TSHR基因表達(dá)及生長(zhǎng)性能的影響。采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆TSHR基因cDNA全長(zhǎng)序列，再應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TSHR基因的相對(duì)表達(dá)量，并制備了碘化鉀添加量分別為0（對(duì)照）、10、50和100 mg/ kg的4種試驗(yàn)飼料進(jìn)行為期27 d的黃顙魚養(yǎng)殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示：本試驗(yàn)成功克隆得到長(zhǎng)度為2 786 bp的TSHR基因cDNA的全長(zhǎng)序列，其中開放閱讀框2 238 bp，編碼745個(gè)氨基酸，Blast程序分析表明黃顙魚TSHR氨基酸序列與其他已知魚類的相似性為60%～87%。組織表達(dá)分析結(jié)果表明TSHR基因在甲狀腺組織中的相對(duì)表達(dá)量較高，其次是肝臟、肌肉和腸道。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)果表明，100 mg/ kg組甲狀腺TSHR基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組（P＜0.05），50 和100 mg/ kg組的增重、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。由此得出，飼料中添加適量的碘化鉀不僅影響TSHR基因的表達(dá)，還能有效促進(jìn)黃顙魚的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞:黃顙魚；碘化鉀；促甲狀腺激素受體；基因克隆；基因表達(dá)

甲狀腺激素（THs）由甲狀腺組織合成和分泌，包括四碘甲狀腺原氨酸（T4）和3，5，3-三碘甲狀腺原氨酸（T3），是含量極低的生物活性物質(zhì)，幾乎作用于水生動(dòng)物的各個(gè)部分，研究證實(shí)THs不僅可以促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育，維持機(jī)體代謝平衡，還能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，提高其興奮性，維持機(jī)體的免疫系統(tǒng)［1-4］。魚類THs的分泌過程與高等脊椎動(dòng)物相似，其中碘和促甲狀腺激素受體（TSHR）是THs合成途徑中的2個(gè)重要因素，碘由鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)郊谞钕贋V泡內(nèi)，碘化合成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸，進(jìn)而生成THs［5-6］。因此碘是機(jī)體生長(zhǎng)和代謝過程中的一種必不可少的微量元素，目前已經(jīng)證實(shí)飼料中缺乏碘會(huì)引起魚類甲狀腺功能減退以及甲狀腺腫等癥狀［7］。NRC標(biāo)準(zhǔn)中魚類對(duì)飼料中碘的需求量較低，但是在低碘含量的淡水區(qū)域常因?yàn)榈夂康牟蛔愣鹑钡庑约膊〉陌l(fā)生，因此，在飼料中補(bǔ)充碘能有效地增加魚類對(duì)飼料中碘的攝取量，從而維持其正常的生長(zhǎng)、代謝。

TSHR是一種G蛋白-偶聯(lián)受體，屬于糖蛋白激素受體超家族的成員，能與促甲狀腺激素結(jié)合激發(fā)甲狀腺的一系列反應(yīng)，從而促進(jìn)THs的釋放；不同物種間TSHR結(jié)構(gòu)很保守，主要由7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域、短的胞質(zhì)域和較大的胞外域構(gòu)成，其中胞外域含富亮氨酸重復(fù)序列，胞外域主要負(fù)責(zé)配體的特異性結(jié)合［8-9］。TSHR與促甲狀腺激素信號(hào)特異性結(jié)合后，激活典型的G-蛋白偶聯(lián)效應(yīng)器（腺苷酸環(huán)化酶和磷酸酯酶C），誘發(fā)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激甲狀腺組織合成、分泌T4，隨后T4在脫碘酶的作用下轉(zhuǎn)化為T3，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育等生命過程［10-12］。因此，TSHR在所有脊椎動(dòng)物垂體-甲狀腺軸的調(diào)節(jié)過程中具有極其重要的作用。目前已在分子水平上對(duì)大麻哈魚（Oncorhynchus rhodurus）［13］、條紋狼鱸（Morone saxatilis）［8］、非洲鯰（Clarias gariepinus）［14］、斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）［15］、歐洲狼鱸（Dicentrarchus labrax）［16］和塞內(nèi)加爾鰨（Solea senegalensis）［9］等魚類的TSHR基因進(jìn)行了研究，但有關(guān)黃顙魚TSHR基因的研究尚未見報(bào)道。

鑒于TSHR基因和碘的重要作用，本研究首先采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆黃顙魚TSHR基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并分析黃顙魚TSHR基因在不同組織中的表達(dá)差異性，在此基礎(chǔ)上，由于碘對(duì)甲狀腺功能的重要性，或能對(duì)TSHR基因產(chǎn)生影響，因此本研究的第2個(gè)目的是揭示飼料中添加不同水平的碘化鉀對(duì)黃顙魚TSHR基因表達(dá)及生長(zhǎng)性能的影響。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

基因克隆所用黃顙魚購自浙江省寧波市鄞州區(qū)東裕菜市場(chǎng)，選取1條健康的黃顙魚，體重145.2 g，體長(zhǎng)24 cm，解剖后取腦、甲狀腺、心臟、肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、性腺、頭腎、胃、腸道組織，用液氮速凍研磨并分別取部分進(jìn)行混合，隨后將混合后的組織加入裝有Trizol的離心管中混勻，置于-80℃超低溫冰箱保存，用于提取總RNA。

本研究所采用的主要試劑包括SuperQuickRT cDNA Kit和2×Es TaqMasterMix，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，SMARTerRACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司，DL1000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DNaseⅠ、TaKaRa LA Taq with GC Buffer、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）購自TaKaRa公司，Trans5αChemically Competent Cell購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）購自上海捷瑞生物工程有限公司，碘化鉀購自SIGMA公司（純度＞99.5%）。其他常用的化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2養(yǎng)殖試驗(yàn)

試驗(yàn)飼料以市售黃顙魚飼料為基礎(chǔ)飼料（杭州?；曙暳祥_發(fā)有限公司，2號(hào)料，粗蛋白質(zhì)含量為41%），分別添加0（對(duì)照）、10、50和100 mg/ kg的碘化鉀配制成4種試驗(yàn)飼料，碘化鉀含量實(shí)測(cè)值分別為0.31、8.58、47.50和92.63 mg/ kg，換算成碘含量后的結(jié)果列于表2。添加方法為：首先將碘化鉀溶于水中，將其加入粉碎后的市售飼料中混勻，用絞肉機(jī)制成直徑為3 mm的飼料，低溫風(fēng)干后，用密封袋封裝后置于冰箱中（-20℃）冷凍保藏，備用。試驗(yàn)飼料的營(yíng)養(yǎng)水平列于表1。

表1　試驗(yàn)飼料的營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Nutrient levels of experiment diets（DM basis）　g/ kg

養(yǎng)殖試驗(yàn)用魚購自浙江省余姚市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站的黃顙魚養(yǎng)殖基地，選取均重為30.3 g的健康黃顙魚120尾，將魚隨機(jī)放入8個(gè)魚缸（容量300 L）內(nèi)，每缸15尾。將8個(gè)魚缸隨機(jī)分成4組，每組2個(gè)魚缸，每天定時(shí)投喂2次（09：00和16：00），表觀飽食投喂，采食約30 min后收集殘餌稱重。每天觀察黃顙魚的活動(dòng)狀況，定期用二氧化氯對(duì)水體進(jìn)行消毒。試驗(yàn)用水為曝氣的自來水，光照為自然光源，用增氧機(jī)晝夜持續(xù)增氧，每天12：00清洗養(yǎng)殖水桶并換水，換水量為總水量的1/2，以保持水體清新。試驗(yàn)期共27 d。飼養(yǎng)期間測(cè)定水溫、溶解氧濃度和攝食量。試驗(yàn)期間水溫22～24℃，溶解氧濃度大于6.2 mg/ L。養(yǎng)殖27 d后進(jìn)行稱重，每個(gè)魚缸隨機(jī)取5尾魚采樣，每尾魚稱重并測(cè)量體長(zhǎng)，解剖后稱肝臟、腸道重，并取甲狀腺組織用液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)的熒光定量PCR測(cè)定。

1.3總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

各個(gè)組織（用于熒光定量）以及混合組織樣品（用于基因克?。┓謩e用Trizol Reagent法提取總RNA，并檢測(cè)其質(zhì)量，方法如下：DNaseⅠ去除其中的DNA雜質(zhì)，用Nanodrop2000核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的濃度和純度（1.9＜A260/ A280＜2.1），并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用康為世紀(jì)公司的SuperQuickRT cDNA Kit并參照說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。反應(yīng)體系為10 μL：dNTP Mix為2 μL、Primer Mix 為1 μL、RNA模板為1 μL、RT緩沖液為2 μL、反轉(zhuǎn)錄酶為0.5 μL、雙蒸水（ddH2O）為3.5 μL。反應(yīng)條件如下：37℃反應(yīng)15 min、85℃反應(yīng)5 s。以混合組織提取的RNA為模板，按照SMARTerRACE cDNA Amplification Kit說明書合成RACE cDNA模板，-20℃保存。

1.4TSHR基因cDNA全長(zhǎng)克隆

1.5TSHR基因序列拼接及生物信息學(xué)分析

將簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的部分序列、5’端RACE克隆序列和3’端RACE克隆序列用DNAStar軟件中的Seqman程序拼接，即得到黃顙魚TSHR基因的全長(zhǎng)cDNA序列；用ExPASy（http：/ / web. expasy.org/ translate/）在線翻譯TSHR基因序列，推斷其開放閱讀框序列和編碼的氨基酸序列；用DNAStar軟件中的EditSeq程序推斷TSHR蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等；利用DNAStar中MegAlign程序?qū)σ勋@得的黃顙魚TSHR的氨基酸序列與非洲鯰（AAN01360.1）、斑點(diǎn)叉尾（AY533543）、斑馬魚（NM001145763.2）、塞內(nèi)加爾鰨（CBK38913. 1）和大口黑鱸（AKC32650.1）TSHR的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)并分析各物種間TSHR氨基酸序列的相似性和分歧度；用SignalP 4.1 Server在線軟件（http：/ / www. cbs. dtu. dk/ services/ SignalP/）預(yù)測(cè)分析信號(hào)肽；用TMHMM在線軟件（http：/ / www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM/）預(yù)測(cè)分析氨基酸的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；用NetNGlyc在線軟件（http：/ / www.cbs.dtu.dk/ services/ NetNGlyc/）預(yù)測(cè)分析N-糖基化位點(diǎn)；用NetPhos 2.0 Server在線軟件（http：/ / www. cbs. dtu. dk/ services/ NetPhos/）預(yù)測(cè)分析磷酸化位點(diǎn)；用PSIPRED v3.3在線軟件（http：/ / bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/）分析TSHR的2級(jí)結(jié)構(gòu)；用在線程序SMART（http：/ / smart.emblheidelberg.de）分析氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域。采用MEGA 6.0軟件中的鄰位相接（NJ）法對(duì)不同物種的TSHR氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap的值為1 000，計(jì)算各分支的置信度。

表2　采用的引物及其序列Table 2 Primers and their sequences used in the experiment

1.6TSHR基因的組織表達(dá)差異

為了檢測(cè)黃顙魚體內(nèi)TSHR基因的表達(dá)情況，根據(jù)GenBank中作為內(nèi)參基因的黃顙魚甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因（JQ068865.1）序列以及本試驗(yàn)克隆得到的黃顙魚TSHR cDNA序列分別設(shè)計(jì)合成實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參引物GAPDH-F和GAPDH-R及TSHR基因引物TSHR-qF和TSHR-qR（表2）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系：2×SYBRPremix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）為6 μL，上、下游引物各0.24 μL，ROX reference DyeⅡ?yàn)?.24 μL，ddH2O補(bǔ)足至12.5 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55.2℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng)60 s，95℃反應(yīng)15 s（制備熔解曲線）。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熔解曲線分析PCR反應(yīng)是否正常，最后得出各組織TSHR基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系圖。

1.7分析方法

粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法［17］測(cè)定，粗脂肪含量采用索氏抽提法［18］測(cè)定，粗灰分含量采用GB/ T 5009.4—2010［19］的方法進(jìn)行測(cè)定，水分含量采用直接干燥法進(jìn)行測(cè)定［20］，碘含量采用GB/ T 13882—2010［21］的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.8計(jì)算方法

特定生長(zhǎng)率（SGR，g/ d）＝100×（ln末重-ln初重）/養(yǎng)殖天數(shù)；

飼料系數(shù)（FCR）＝攝食量/增重；

肥滿度（CF，g/ cm3）＝體重/體長(zhǎng)3；

肝胰指數(shù)（HSI，%）＝100×肝臟重/體重；

腸指數(shù)（%）＝100×腸重/體重。

1.9數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法［22］計(jì)算，黃顙魚各組織的TSHR基因的表達(dá)量是相對(duì)于肌肉組織TSHR基因的表達(dá)量。采用SPSS 19.0對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)做單因素方差分析（one-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1黃顙魚TSHR基因的克隆及序列分析

以黃顙魚混合組織cDNA為模板，克隆出與預(yù)期大小相符的cDNA片段，利用預(yù)測(cè)的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性分析，該目的基因與鯰形目斑點(diǎn)叉尾的TSHR基因很相似，表明該基因?yàn)辄S顙魚的TSHR基因。序列分析可知，黃顙魚TSHR基因cDNA序列全長(zhǎng)2 786 bp，其中開放閱讀框2 238 bp（239～2 476 bp），5’端非翻譯區(qū)（UTR）為238 bp（1～238 bp），3’端UTR為310 bp（2 477～2 786 bp），共編碼745個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA（圖1），將該序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)KT722732。

DNAStar軟件Editseq程序預(yù)測(cè)分析說明：黃顙魚TSHR蛋白質(zhì)序列包括63個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K、R），65個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D、E），293個(gè)疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V），221個(gè)極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y），該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為83.8 ku，理論的等電點(diǎn)（pI）為7.163。經(jīng)SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)分析該蛋白質(zhì)序列的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TSHR蛋白質(zhì)序列的N端信號(hào)肽為第1～19位的氨基酸（MCLLALVILTFCSTRTCTG），并且在第19和20位的氨基酸上可能存在裂解位點(diǎn)（圖1）。

TSHR是貫穿脂雙層的跨膜蛋白，黃顙魚TSHR氨基酸序列包含長(zhǎng)度為264個(gè)氨基酸的疏水性7個(gè)跨膜螺旋區(qū)，分別位于421～443、450～472、487～509、540～562、582～604、625～647和662～684氨基酸處和長(zhǎng)度為420個(gè)氨基酸的胞外區(qū)（1～420氨基酸處）：包含N-末端的信號(hào)肽序列、長(zhǎng)度為61個(gè)氨基酸的膜內(nèi)區(qū)（685～745氨基酸處），膜外區(qū)和膜內(nèi)區(qū)均呈親水性?？缒ぢ菪齾^(qū)是由3個(gè)胞內(nèi)環(huán)和3個(gè)胞外環(huán)連接起來，是典型的G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)：黃顙魚TSHR基因序列中有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)和20個(gè)保守的半胱氨酸，其中糖基化位點(diǎn)分別是76NISL、197NGTK、301NLTE（圖1）；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)：TSHR有38個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，包括20個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、11個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、7個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，其中胞外區(qū)有14個(gè)絲氨酸位點(diǎn)（39S、64S、65S、90S、95S、148S、151S、247S、252S、280S、328S、332S、337S、382S）、8個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)（55T、87T、110T、115T、138T、238T、267T、368T）和4個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（37Y、351Y、384Y、386Y），第2個(gè)胞內(nèi)環(huán)內(nèi)有1個(gè)絲氨酸位點(diǎn)（535S），第2胞外環(huán)有2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（475Y、480Y），第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)有2個(gè)絲氨酸位點(diǎn)（616S、619S）、1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（612Y），胞內(nèi)區(qū)有3個(gè)絲氨酸位點(diǎn)（711S、715S、716S）、3個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)（709T、719T、726T）。二級(jí)結(jié)構(gòu)：預(yù)測(cè)TSHR包含21個(gè)α螺旋、15個(gè)β折疊和34個(gè)無規(guī)則卷曲。SMART預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，TSHR存在4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包括3個(gè)富亮氨酸重復(fù)［LRRNT（56～77氨基酸處）、LRR_8（78～137氨基酸處）、LRR_5（149～226氨基酸處）］結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域［7tm_1（430～677氨基酸處）］（圖2）。

利用Clustal X進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果（圖3）顯示，7個(gè)跨膜螺旋區(qū)都處于保守性較高的區(qū)域。黃顙魚TSHR氨基酸序列和其他魚類已知的TSHR氨基酸序列有57%～87%的相似度和2. 0%～11.5%的分歧度（表3）。

黃顙魚與條紋狼鱸、羅非魚、塞內(nèi)加爾鰨、大麻哈魚A和大麻哈魚B、斑馬魚、非洲鯰、斑點(diǎn)叉尾等16種物種的TSHR氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹列于圖4。從中可以看出整個(gè)進(jìn)化樹分為2個(gè)亞群，各種魚類聚為1個(gè)亞群，哺乳類、兩棲類、鳥類形成1個(gè)亞群。其中黃顙魚TSHR處于魚類這一分支，且與斑點(diǎn)叉尾和非洲鯰親緣關(guān)系最近，斑馬魚次之，與哺乳類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分支和物種的進(jìn)化關(guān)系一致，而且從進(jìn)化樹可以看出TSHR在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中出現(xiàn)一定程度的分化。

2.2黃顙魚TSHR基因的組織表達(dá)差異

黃顙魚TSHR基因在不同組織中的表達(dá)情況列于圖5，結(jié)果顯示，TSHR基因在黃顙魚各組織中均有表達(dá)且彼此之間存在差異，在甲狀腺中的相對(duì)表達(dá)量較高，其次是肝臟、肌肉和腸道，在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量較少。

2.3飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

由表4可知，隨飼料中碘化鉀的添加量的升高增重和特定生長(zhǎng)率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，飼料中碘化鉀添加量為50和100 mg/ kg時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。各組之間攝食量差異不顯著（P＞0.05）。隨飼料中碘化鉀添加量的升高，飼料系數(shù)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，飼料中碘化鉀添加量為50和100 mg/ kg時(shí)，飼料系數(shù)顯著降低（P＜0.05）。肥滿度、肝胰脂數(shù)和腸指數(shù)各組之間均差異不顯著（P＞0.05）。

圖1　黃顙魚TSHR基因cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 cDNA full-long sequence and deduced amino acid sequence of TSHR gene in yellow catfish

圖2　黃顙魚TSHR序列保守的結(jié)構(gòu)域Fig.2 The conservative domain in TSHR sequence of yellow catfish

表3　不同物種TSHR氨基酸序列的相似度和分歧度Table 3 Percent identity and divergence of amino acid sequence among different species　%

2.4飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚甲狀腺TSHR基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR分析結(jié)果（圖6）顯示，飼料中碘化鉀添加量為100 mg/ kg時(shí)黃顙魚甲狀腺TSHR基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.05），是其他組的2.3～17.5倍，其余各組之間差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼料中碘化鉀添加量的增加，黃顙魚甲狀腺TSHR基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)。

3　討　論

3.1黃顙魚TSHR基因生物信息學(xué)分析

本研究成功獲得黃顙魚TSHR基因的cDNA全長(zhǎng)為2 786 bp，推導(dǎo)出黃顙魚的TSHR蛋白由745個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列與鯰形目斑點(diǎn)叉尾TSHR氨基酸序列的相似性最高（87%），且與其他魚類的TSHR氨基酸序列的相似性也較高，并且該氨基酸序列具有糖蛋白受體家族的典型特征，Segaloff等［23］認(rèn)為TSHR屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族中的A組，具有一個(gè)比較獨(dú)特的大的胞外域，調(diào)節(jié)與促甲狀腺激素的結(jié)合，胞外域中具有豐富的亮氨酸重復(fù)序列，胞外域約占總序列長(zhǎng)度的1/2，有7tm_1結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)域由3個(gè)胞外環(huán)和3個(gè)胞內(nèi)環(huán)構(gòu)成，這些都與本研究獲得的cDNA序列相符合。Rocha等［16］從性腺中克隆出來的TSHR cDNA基因序列也具有類似的典型糖蛋白家族特征。進(jìn)化樹分析表明魚類、鳥類和哺乳類動(dòng)物的TSHR最后聚為一支，預(yù)示著TSHR蛋白有著共同的祖先，只是隨著時(shí)間推移，動(dòng)物進(jìn)化分化出了不同類型的受體蛋白。

比對(duì)黃顙魚與其他相關(guān)物種的TSHR基因，發(fā)現(xiàn)黃顙魚與斑點(diǎn)叉尾和非洲鯰的相似性較高，其次是斑馬魚、大西洋鮭魚等魚類，動(dòng)物分類與基因進(jìn)化的關(guān)系相一致，表明TSHR基因在物種進(jìn)化中具有保守性及其對(duì)生理功能發(fā)揮的重要性。

3.2黃顙魚TSHR基因組織表達(dá)特異性分析

本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺和非甲狀腺組織中均能檢測(cè)到TSHR基因的表達(dá)，這一結(jié)果和Vischer等［14］、Goto-Kazeto等［15］、Ponce等［9］、Sampath-Kumar等［8］、Rocha等［16］分別對(duì)非洲鯰、斑點(diǎn)叉尾、塞內(nèi)加爾鰨、條紋狼鱸、歐洲鱸的研究結(jié)果一致，TSHR基因除了在硬骨魚的甲狀腺中表達(dá)外，在心臟、肌肉、垂體、腸道、胃、腎、肝臟、脾臟、頭腎、腦、性腺等組織中也有表達(dá)，只是各組織中TSHR基因表達(dá)豐度呈現(xiàn)出多樣性。本研究結(jié)果顯示TSHR基因在黃顙魚的心臟、肝臟、脾臟、胃、腎臟、頭腎、腦、肌肉、腸、性腺、甲狀腺組織中均有表達(dá)，說明TSHR具有廣泛的調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理代謝的作用，其中脾臟是免疫器官，因此TSHR基因或許與免疫功能相關(guān)。已有研究證實(shí)哺乳動(dòng)物的甲狀腺內(nèi)穩(wěn)態(tài)的紊亂會(huì)導(dǎo)致其免疫細(xì)胞比例的變化［24］，在虹鱒的試驗(yàn)中，人為的改變甲狀腺激素的狀態(tài)會(huì)引起免疫系統(tǒng)中白細(xì)胞的組成發(fā)生變化［25］；Wang等［26］也已經(jīng)證明在早期的抗原免疫反應(yīng)中，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、外周T細(xì)胞通過促甲狀腺激素進(jìn)行相互聯(lián)系，而且促甲狀腺激素具有免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的作用［27］，由此推測(cè)TSHR在脾臟中與促甲狀腺激素結(jié)合起免疫調(diào)節(jié)作用，但TSHR的具體免疫作用機(jī)理目前仍然不清楚。

圖3　不同物種間TSHR推導(dǎo)的氨基酸序列的比對(duì)Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of TSHR among different fish species

圖4　基于TSHR氨基酸序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on TSHR amino acid sequences using NJ method

圖5　黃顙魚不同組織中TSHR基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of TSHR gene in different tissues of yellow catfish

3.3飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能和TSHR基因表達(dá)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚增重、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)有顯著影響，飼料中碘化鉀添加量在50和100 mg/ kg時(shí)可促進(jìn)黃顙魚的生長(zhǎng)，提高飼料利用效率。這一結(jié)果與之前的一些研究結(jié)果相符合，如Witt等［28］研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的碘的含量與太平洋馬鲅幼魚的生長(zhǎng)、成活率、變態(tài)發(fā)育以及魚體內(nèi)甲狀腺激素的含量相關(guān)，適量的碘能促進(jìn)其更快發(fā)育、更快生長(zhǎng)并且提高成活率；Gensic等［29］在虹鱒的飼料中添加碘后發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充碘的虹鱒生長(zhǎng)較好并且甲狀腺激素的含量高，其成活率和疾病防御能力也相應(yīng)提高。此外，Penglase等［30］研究發(fā)現(xiàn)大西洋鱈魚（Gadus morhua）幼蟲攝食的碘含量為129 mg/ kg時(shí)，碘對(duì)甲狀腺產(chǎn)生毒性，這一含量超過了本試驗(yàn)所得到的碘化鉀添加量的最大值，過量碘引起甲狀腺活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致生長(zhǎng)性能降低。也有一些研究結(jié)果與本研究結(jié)果不相符合，如Ribeiro等［31］研究表明海鯉飼料中不同水平或不同化學(xué)組成的碘（最大的含量為26 mg/ kg，相當(dāng)于碘化鉀34.4 mg/ kg）對(duì)海鯉的攝食量、生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)均沒有顯著影響；Bowzer等［32］將大眼梭鱸的胚胎暴露于100 mg/ L的碘溶液中30 min后，發(fā)現(xiàn)碘會(huì)降低胚胎的成活率，但并不影響其生長(zhǎng)，原因可能是碘的添加量、碘化物的種類和魚體發(fā)育的階段性等因素的不同引起的。

表4　飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響Table 4 Effects of dietary potassium iodide addition on growth performance of yellow catfish

圖6　飼料中添加碘化鉀對(duì)黃顙魚甲狀腺TSHR基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of dietary potassium iodide addition on expression of TSHR of yellow catfish

促甲狀腺激素能與甲狀腺濾泡細(xì)胞表面的TSHR結(jié)合，調(diào)節(jié)鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)［33］，隨后鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)男问綄⒌廪D(zhuǎn)入甲狀腺濾泡組織中［34-35］，最終促進(jìn)甲狀腺合成并分泌甲狀腺激素，使甲狀腺維持正常的活性狀態(tài)，在此過程中，TSHR基因起著關(guān)鍵的作用，若碘的供應(yīng)量不足，或引起鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過剩，進(jìn)而抑制TSHR基因的表達(dá)，因此在一定范圍內(nèi)，隨著碘含量的升高，TSHR基因的表達(dá)量也會(huì)相應(yīng)提高。本研究中TSHR的相對(duì)表達(dá)量隨著碘化鉀添加量的增加，呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，符合理論預(yù)期。碘對(duì)TSHR基因的影響最終會(huì)轉(zhuǎn)化成對(duì)甲狀腺激素和甲狀腺功能的影響，如Burel等［36］和Mustafa等［37］均發(fā)現(xiàn)飼料中足夠的碘能夠提高機(jī)體甲狀腺激素的含量，并且能提高其抗病能力，減少有害物質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)的影響。Ribeiro等［6］通過循環(huán)系統(tǒng)飼養(yǎng)塞內(nèi)加爾鰨研究碘和硒對(duì)其甲狀腺結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)飼料中添加碘能提高塞內(nèi)加爾鰨幼魚的成活率以及相應(yīng)的減少甲狀腺畸形（甲狀腺腫）的發(fā)生率，從而提高魚體的生長(zhǎng)速率。反之，碘缺乏對(duì)魚體引起的負(fù)作用也得到證實(shí)，如缺乏碘在魚幼蟲變形初期會(huì)引起甲狀腺活性降低，這已在大西洋比目魚中得到確認(rèn)［38］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，由此可初步推斷飼料中的碘能夠通過甲狀腺軸這一內(nèi)分泌途徑調(diào)節(jié)黃顙魚的生長(zhǎng)性能，這也為提高黃顙魚養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益提供了一個(gè)可行的途徑。

4　結(jié)　論

①本研究從黃顙魚組織中成功克隆了TSHR基因的cDNA全長(zhǎng)序列，GenBank登錄號(hào)為KT722732。

②TSHR基因在甲狀腺組織中的相對(duì)表達(dá)量較高，其次是肝臟、肌肉和腸道，其他組織中相對(duì)較少。

③飼料中添加碘化鉀顯著影響黃顙魚的增重、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)以及甲狀腺TSHR基因的表達(dá)。

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（責(zé)任編輯菅景穎）

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Thyrotropin Receptor Gene Cloning and Expression Response to Dietary Potassium Iodide Addition of Yellow Catfish （Pelteobagrus fulvidraco）

WANG Chunling1，2ZHANG Hongta1GAO Youling1?QIAN Guoying1?
（1. College of Biological and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；
2.College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract：The aims of the present study were to characterize the cDNA full-long sequence of thyrotropin receptor（TSHR）gene of yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco），and to determine the differential expression of TSHR gene in different tissues. In addition，the effects of dietary potassium iodide（KI）addition on TSHR gene expression and growth performance of yellow catfish were revealed. The rapid amplification of cDNA ends（RACE）technique was used to clone the cDNA full-long sequence of TSHR gene. Moreover，RT-qPCR technique was used to determine the relative expression level of TSHR gene. The KI adding levels were set to be 0（control），10，50 and 100 mg/ kg in four experimental diets，which were fed to yellow catfish for 27 days. The results showed as follows：the cDNA full-length sequence of TSHR gene was obtained，and it was 2 786 bp，including a complete open reading frame of 2 238 bp encoded a 745 amino acid residues. Blast online analysis indicated that the amino acid sequence of yellow catfish displayed 60%to 87%identity as compared with other known fish species. The analysis results of tissue differential expression of TSHR gene indicated that the highest relative expression level was in thyroid，followed by liver，muscle and intestine. The results of feeding trial were showed that the relative expression level of TSHR gene in thyroid in 100 mg/ kg group was significantly higher than that in other groups（P＜0.05），and the weight gain，specific growth rate and feed conversion ratio in 50 and 100 mg/ kg groups were significantly higher than those in control group（P＜0.05）. The results in this study imply that the dietary KI in the appropriate amount not only affects the expression of TSHR gene，but also promote the growth of yellow catfish effectively.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：940-952］

Key words：yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）；potasium iodide；thyrotropin receptor；gene clone；gene expression

Corresponding author?s：GAO Youling，associate professor，E-mail：gaoyl@zwu.edu.cn；QIAN Guoying，professor，E-mail：qiangy@zwu.edu. cn

通信作者:?高有領(lǐng)，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：gaoyl@zwu.edu.cn；錢國(guó)英，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：qiangy@zwu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介:王春玲（1989—），女，河南周口人，碩士研究生，從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：chunling209@163.com

基金項(xiàng)目:浙江省自然科學(xué)基金（LY14C190009）；浙江省重大科技專項(xiàng)（2012C12907）；寧波市科技局項(xiàng)目（2014A610193，2012B82016）

收稿日期:2015-09-15

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.037

中圖分類號(hào):S963

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1006-267X（2016）03-0940-13