不同飼養(yǎng)密度對籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群的影響

于江明　王秋菊　劉勃麟　寧博林　王　龍　趙乾雨　劉勝軍　全佳慧（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶163319）

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不同飼養(yǎng)密度對籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群的影響

于江明王秋菊?劉勃麟寧博林王龍趙乾雨劉勝軍??全佳慧
（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶163319）

摘要:本試驗采用聚合酶鏈式反應（PCR）-變性梯度凝膠電泳（DGGE）方法探究不同飼養(yǎng)密度對籠養(yǎng)海蘭灰蛋雞十二指腸腸道菌群的影響。隨機選取1 250只11周齡海蘭灰蛋雞，按照不同飼養(yǎng)密度隨機分為5個組：A組900 cm2/只、B組675 cm2/只、C組540 cm2/只、D組450 cm2/只、E組380 cm2/只，每個組內(nèi)50個重復。5個組均在相同的環(huán)境和飼養(yǎng)管理模式下進行飼養(yǎng)。分別于16、26、50周齡時，在每個組中隨機選取5只雞，取十二指腸內(nèi)容物，用PCR-DGGE法進行腸道菌群分析。結(jié)果表明，在同一個飼養(yǎng)密度內(nèi)，隨著飼養(yǎng)周齡的增加籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似系數(shù)逐漸減小；16周齡時高密度組與低密度組之間十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性很高，即腸道菌群結(jié)構(gòu)差異較?。?6和50周齡時高密度組與低密度組之間十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性很低，即腸道菌群結(jié)構(gòu)差異很大。由此可見，隨著飼養(yǎng)周齡的增加籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)差異增大；2種有益菌（Lactobacillus gastricus和Lactobacillus alvi）在高飼養(yǎng)密度組（D組和E組）中消失，飼養(yǎng)密度高于450 cm2/只對籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)具有不利的影響。

關(guān)鍵詞:蛋雞；飼養(yǎng)密度；十二指腸細菌菌群；PCR-DGGE

?同等貢獻作者

??通信作者:劉勝軍，教授，博士生導師，E-mail：lsj4396@163.com

隨著家禽集約化養(yǎng)殖程度的越來越高，飼養(yǎng)密度成為家禽養(yǎng)殖中普遍存在的應激因素［1］。王龍［2］研究了不同飼養(yǎng)密度對層疊籠養(yǎng)蛋雞生產(chǎn)性能及福利的影響，結(jié)果顯示隨著飼養(yǎng)密度增加，雞群受到的應激刺激增大，雞群羽毛覆蓋程度差，血液皮質(zhì)酮水平增高，入舍雞產(chǎn)蛋數(shù)降低，雞群死亡率升高，高密度飼養(yǎng)嚴重影響蛋雞的生產(chǎn)性能。應激條件下，除了影響家禽外在的羽毛狀態(tài)和生產(chǎn)性能外，對其內(nèi)部腸道健康也有重要的影響［3］。腸道微生物區(qū)系是評價腸道健康的重要指標，腸道微生物對宿主的營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、免疫等均起重要作用［4］。小腸是腸道中重要的吸收部位，90%的食物在小腸中被吸收；而十二指腸是小腸中管徑最大、位置最深、最為固定的小腸段，且胰管與膽總管均開口于十二指腸，因此十二指腸的健康直接影響動物機體的健康。研究飼養(yǎng)密度對蛋雞十二指腸細菌菌群結(jié)構(gòu)的影響，對探究家禽機體內(nèi)部影響蛋雞健康狀況的作用機理至關(guān)重要。關(guān)于腸道細菌結(jié)構(gòu)的研究，以往的微生物純培養(yǎng)方法只能體外培養(yǎng)10%～60%的細菌［5］，該方法不能完整、準確的描述腸道菌群結(jié)構(gòu)，因此逐漸被淘汰；變性梯度凝膠電泳（DGGE）和聚合酶鏈式反應（PCR）等基于16S核糖體RNA（rRNA）基因為基礎的分子技術(shù)的發(fā)展，加快了對腸道微生物區(qū)系的檢測和認知［6-7］，因此目前多采用更加快速和細致的PCR-DGGE方法分析腸道菌群結(jié)構(gòu)。關(guān)于DGGE方法檢測胃腸道細菌結(jié)構(gòu)的應用已非常廣泛，但該技術(shù)在家禽腸道菌群結(jié)構(gòu)分析的應用仍在初期，關(guān)于蛋雞腸道菌群變化的研究很少，研究飼養(yǎng)密度應激對蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響未見報道。因此，本研究通過采用PCR-DGGE技術(shù)分析不同飼養(yǎng)密度對籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，從家禽腸道健康角度來反映飼養(yǎng)密度對蛋雞產(chǎn)生的應激，為蛋雞腸道微生物區(qū)系的全面分析奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物及設計

隨機選取1 250只11周齡海蘭灰（Hy-Line Gray）蛋雞（由黑龍江興和生物科技有限公司提供），飼養(yǎng)籠尺寸（長×寬×高）為600 mm× 450 mm×430 mm，按照不同飼養(yǎng)密度隨機分為5個組：A組900 cm2/只（3只/籠）、B組675 cm2/只（4只/籠）、C組540 cm2/只（5只/籠）、D組450 cm2/只（6只/籠）、E組380 cm2/只（7只/籠），每個組內(nèi)50個重復，所有雞只飼養(yǎng)在同一層籠中，即距離地面第2層。整個試驗周期5個組均在同一環(huán)境和飼養(yǎng)管理模式下進行飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗樣品采集與處理

于16、26、50周齡時進行采樣。即每個組的每15個重復隨機挑選1～2個重復，每個重復選取5只雞，進行采樣。對于密度小的組（3、4只/籠），選6個重復，每2個重復選取5只雞。將選取的試驗雞，剪斷頸靜脈處死，無菌操作，剖腹分離十二指腸。將每個重復5只雞的十二指腸內(nèi)容物均勻混合后裝入1個15 mL離心管內(nèi)，編號，-80℃保存?zhèn)溆谩１?為十二指腸內(nèi)容物樣品編號。

表1　十二指腸內(nèi)容物樣品編號Table 1 Number of the contents of duodenum

1.2細菌16S rDNA片段的PCR擴增

采用CTAB手提法進行各內(nèi)容物樣品的DNA提取，以樣品基因組DNA為模板，采用細菌通用引物GC-338F和518R擴增樣品16S rDNA高變區(qū)序列，引物信息見表2。

表2　引物信息Table 2 Primer information

PCR擴增體系（50 μL）為：10×PCR buffer 5 μL；dNTP（2.5 mmol/ L）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0. 4 μL；GC-338F（20 μmol/ L）1 μL；518R （20 μmol/ L）1 μL；模板DNA 50 ng；補ddH2O至50 μL。

PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃復性45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

1.3PCR產(chǎn)物的DGGE分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V、60℃下電泳5 h。DGGE完畢后采用銀染法染色。

1.4DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進行PCR擴增。

將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到PMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，菌液由華大基因?qū)Σ迦氲募毦?6S rDNA片段進行序列測定。

1.5數(shù)據(jù)分析

在GenBank中使用Blast程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列。采用MEGA 5軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（bootstrap）為1 000。

細菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)以及均勻度的綜合指標。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強度（灰度），對各樣品中細菌多樣性指數(shù)（H）、均勻度（E）和豐富度（S）等指標進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1細菌16S rDNA的PCR擴增

以GC-338F和518R為引物擴增16S rDNA序列，各條帶均獲得250 bp左右的DNA片段（圖1），可以用于DGGE分析。

圖1　PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results

2.2PCR產(chǎn)物的DGGE

樣品16S rDNA PCR產(chǎn)物的DGGE分析結(jié)果見圖2。圖2所示的每條泳道的樣品均是5只雞十二指腸腸道內(nèi)容物的混合物，所以它反映的是不同組別之間十二指腸腸道菌群的平均狀態(tài)。圖2中不同位置的條帶代表不同的細菌；條帶的數(shù)量反映的是十二指腸腸道細菌種群的數(shù)量，條帶的數(shù)量越多，表示種群的數(shù)量越多，反之亦然；某一條帶的亮度和粗細反映的是十二指腸腸道某一種群細菌的數(shù)量，越粗越亮，表示該種群細菌的數(shù)量越多，反之亦然。圖中不同泳道的條帶位置、數(shù)量、亮度及粗細的差異表明同一周齡下不同飼養(yǎng)密度之間和同一飼養(yǎng)密度下不同周齡之間蛋雞十二指腸腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成均存在差異。

圖3下方的百分比表示以1組樣品為標準，其他各組樣品與其整體的相似度。其中，3組樣品與1組樣品的整體相似度最高為48.2%，14組樣品與1組樣品的整體相似度最低為19.3%，說明各組之間菌群相似度較低，差異較大。由圖3可知，1～15組樣品中含有的條帶數(shù)目分別是17條、14條、22條、22條、15條、22條、14條、15條、18條、12條、17條、22條、24條、14條、21條。1～15組樣品沒有完全共有的條帶，說明菌群結(jié)構(gòu)存在差異。

2.3各樣品之間的細菌群落結(jié)構(gòu)相似性

由表3可知，同一飼養(yǎng)密度條件下不同周齡內(nèi)籠養(yǎng)蛋雞十二指腸菌群結(jié)構(gòu)相似指數(shù)在12.1%～64.5%之間，其中6只/籠的試驗組16與26周齡的菌群結(jié)構(gòu)相似性最低，相似系數(shù)僅為12.1%；4只/籠的試驗組16與26周齡的菌群結(jié)構(gòu)相似性最高，相似系數(shù)為64.5%。整體來看，在同一個飼養(yǎng)密度內(nèi)，隨著飼養(yǎng)周齡的增加籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似系數(shù)逐漸減小，腸道菌群結(jié)構(gòu)差異逐漸增加，即飼養(yǎng)周齡對蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)影響很大。

同一周齡條件下不同飼養(yǎng)密度內(nèi)籠養(yǎng)蛋雞十二指腸菌群結(jié)構(gòu)相似指數(shù)在6.0%～70.3%之間，其中26周齡時B組與E組的菌群結(jié)構(gòu)相似性最低，相似系數(shù)為5.4%；16周齡時B組與E組的菌群相似性最高，相似系數(shù)為70.3%?？傮w來看，16周齡時高密度組與低密度組之間十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性很高，即腸道菌群結(jié)構(gòu)差異較??；26 和50周齡時高密度組與低密度組之間十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性很低，即腸道菌群結(jié)構(gòu)差異很大。

圖2　電泳分析結(jié)果（圖譜中條帶旁邊數(shù)字為切膠編號）Fig.2 Electrophoresis analysis results（the data besides band represent the gel extraction number）

圖3　電泳分析結(jié)果模式圖Fig.3 Model of electrophoresis analysis results

2.4主要電泳條帶的序列測定

DGGE凝膠條帶回收后，以338F/518R為引物進行PCR擴增，獲得目的DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆測序。

測序結(jié)果與GenBank中的序列進行比對，得到條帶所代表的細菌類型。每個回收條帶選取3個克隆進行了序列測定，結(jié)果見表4。32個測序結(jié)果中，微生物的同源性在84%～100%之間，大多數(shù)均大于98%，10個條帶的同源性達到了100%，僅6個條帶的同源性小于98%，其中條帶30與數(shù)據(jù)庫中Pediococcus siamensis菌株的相似度僅為84%，因此該序列代表的微生物可能為厚壁菌門（Firmicutes）新種。各組樣品中檢測到26種厚壁菌門細菌、5種蛋白菌門（Proteobacteria）細菌、1種放線菌門（Actinobacteria）細菌，由此可以看出，蛋雞十二指腸腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門。第28 號Pseudomonas japonica細菌僅第14組所特有；第16號Lactobacillus equi細菌是除第9組之外其他各組的共有菌；第7號Romboutsia ilealis細菌、第8號Lactobacillus gastricus細菌、第9號Lactobacillus vaginalis細菌、第10號Lactobacillus alvi細菌隨著飼養(yǎng)密度的增加逐漸消失；第17號Lactobacillus equi細菌和第19號Enterococcus cecorum細菌在最高密度組中和最低密度組中均檢測到。

表3　PCR-DGGE圖譜的相似性系數(shù)Table 3 Resemblance coefficient of PCR-DGGE map　%

表4　序列比對分析結(jié)果Table 4 Sequence bipartition analytic results

續(xù)表4　

采用MEGA 5軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（bootstrap）為1 000，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。

3　討　論

家禽生長發(fā)育過程中，腸道微生物菌群會產(chǎn)生各種對機體有利或有害的代謝產(chǎn)物，菌群和胃腸道上皮細胞之間的相互作用導致消化道各種結(jié)構(gòu)和功能的改變，菌群不僅可以影響脂肪的消化和改變碳水化合物、蛋白質(zhì)的消化，還能夠增加能量和蛋白質(zhì)的需要量，但對維生素的消化吸收具有負面的影響，此外，有益菌可以保護機體免受病原菌的侵入，是腸道免疫系統(tǒng)的一部分，所以說，腸道微生物區(qū)系對腸道功能起著至關(guān)重要的作用［8］。

腸道微生物的組成復雜，數(shù)量和種類因家禽的種類、年齡［9］、飼料和環(huán)境［10］而異，即使在相同飼養(yǎng)環(huán)境下的不同個體腸道菌群結(jié)構(gòu)也存在差異，為了減小個體差異對試驗的影響，本試驗在每個組中都隨機選取3～6個重復，每個重復選取5只籠養(yǎng)蛋雞，提取十二指腸內(nèi)容物進行檢測，使試驗數(shù)據(jù)更準確，提高PCR-DGGE圖譜的相似性。然而本試驗不同飼養(yǎng)密度蛋雞十二指腸腸道菌群的共有菌僅1株，即第16號Lactobacillus equi細菌，由此可見，飼養(yǎng)環(huán)境即使相同，雞只腸道菌群仍存在很大差異，分析原因可能與本試驗雞群是大群飼養(yǎng)（30 000只，5層籠）、飼養(yǎng)空間的大小和雞群群體大小對腸道菌群都產(chǎn)生影響有關(guān)。但各雞十二指腸的共同菌即第16號Lactobacillus equi細菌曾作為日本賽馬糞便中的優(yōu)勢菌群被報道［11-12］，說明該細菌為十二指腸腸道菌群的優(yōu)勢菌，并且表明該優(yōu)勢菌群不受飼養(yǎng)周齡和飼養(yǎng)環(huán)境的影響。第19號Enterococcus cecorum細菌是一種致病菌，大量的試驗表明該細菌可以導致家禽產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎及骨髓炎［13-15］，本試驗中在最低密度A組和最高密度E組中均檢測到該細菌，說明過高或過低的密度對十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)均有影響。大量試驗研究指出，第8號Lactobacillus gastricus細菌［16-17］和第10號Lactobacillus alvi細菌［18］是可以維護腸道平衡，防止病原菌入侵的有益菌，但在本試驗中這2種細菌均隨著飼養(yǎng)密度的增加而消失，說明飼養(yǎng)密度對十二指腸腸道菌群有影響，過高的飼養(yǎng)密度對其有不利的影響。

圖4　系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees

有研究顯示，腸道中的有益菌可以在保證雞蛋蛋重不變的情況下增加蛋殼的重量并提高蛋殼強度［19］。有益菌也可以通過改變有害菌的受體，從而阻斷其在消化道中的生長，總體而言，飼養(yǎng)密度或熱應激的增加會加大有害菌對有益菌的損害［10］。倪學勤等［20］采用PCR-DGGE技術(shù)分析蛋雞年齡和腸段部位對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，結(jié)果表明蛋雞腸道部位決定細菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，蛋雞的周齡影響腸道細菌多樣性；倪學勤等［21］通過PCR-DGGE技術(shù)分析蛋雞主要組織相容性復合體（MHC）基因?qū)δc道細菌種群結(jié)構(gòu)的影響，得出蛋雞盲腸細菌的多樣性最高，其次是回腸和空腸，嗉囊和十二指腸的細菌多樣性比較低，且隨著蛋雞周齡增加，各腸段細菌多樣性呈上升趨勢；李永洙等［22］通過PCR-DGGE技術(shù)分析不同品種、飼養(yǎng)階段的健康和不良雞群對盲腸細菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，結(jié)果顯示，不同品種、飼養(yǎng)階段的雞群，其盲腸細菌群落的組成差異顯著，并且細菌種群結(jié)構(gòu)對雞群的生長發(fā)育影響較大；王秋菊等［23］采用PCR-DGGE技術(shù)分析籠養(yǎng)海蘭褐蛋雛雞腸道菌群，得出同齡籠養(yǎng)海蘭褐蛋雛雞腸道細菌菌群結(jié)構(gòu)與腸道的不同部位有關(guān)，各腸段中細菌菌群的組成差異很大。在正常蛋雞飼養(yǎng)過程中，開產(chǎn)前與開產(chǎn)后蛋雞飼糧配方不同，可能會影響蛋雞腸道細菌組成。但本試驗結(jié)果顯示，16周齡時，不同飼養(yǎng)密度下籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)差異不顯著；飼喂同一飼糧的26和50周齡蛋雞，不同飼養(yǎng)密度下籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，說明日齡對蛋雞腸道菌群產(chǎn)生影響；而且同一個飼養(yǎng)密度下，隨著飼養(yǎng)時間的延長，籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似系數(shù)逐漸減小，腸道菌群結(jié)構(gòu)差異逐漸增加，即飼養(yǎng)時間對蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)影響很大。

4　結(jié)　論

①飼養(yǎng)密度對籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群產(chǎn)生影響，隨著飼養(yǎng)密度增加，即飼養(yǎng)密度高于450 cm2/只時，籠養(yǎng)蛋雞十二指腸中有益菌（Lactobacillus gastricus和Lactobacillus alvi）消失，對腸道菌群平衡產(chǎn)生不利影響。

②在同一個飼養(yǎng)密度下，隨著飼養(yǎng)時間的延長，籠養(yǎng)蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)相似系數(shù)逐漸減小，腸道菌群結(jié)構(gòu)差異逐漸增加，即隨著飼養(yǎng)周齡增加，蛋雞十二指腸腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生差異變化。

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?Contributed equally

??Corresponding author，professor，E-mail：lsj4396@163.com

（責任編輯武海龍）

Effects of Different Stocking Density on Microbial Flora of Duodenum for Caged Layer

YU Jiangming WANG Qiuju?LIU Bolin NING Bolin WANG Long ZHAO Qianyu LIU Shengjun??QUAN Jiahui
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Abstract：The test used the polymerase chain reaction（PCR）-denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）methods to explore the effects of different stocking density on the microbial flora of duodenum for caged Hy-line Gray laying hens. A total of 1 150 eleven-week-old Hy-line Gray laying hens were randomly allocated into 5 groups with 50 replications with the stocking density of 900，675，540，450 and 380 cm2per layer，respectively. All the hens were reared under the same environment condition and with the same management model. Five hens were selected randomly from every group at the age of 16，26 and 50 weeks，the intestinal samples of duodenum were taken to analyze the micro by PCR-DGGE. The results showed that in the same stocking density，the similarity coefficient of duodenum microbial flora of caged layers was decreased with the increasing of breeding weeks；at the 16 week of age，the microbial flora of duodenum was highly similar between high density group and low density group，there was no obvious difference for structure of intestinal flora；at the 26 and 50 week of age，the microbial flora of duodenum was lowly similar between high density group and low density group，there was significant differences for structure of intestinal flora. In conclusion，with the increasing of feeding week age，the structure of the microbial flora of duodenum is changed significantly；two kinds of beneficial bacteria（Lactobacillus gastricus and Lactobacillus alvi）disappear in high stocking density（group D and group E）；the feeding density higher than 450 cm2/ per layer have adverse effects on the structure of the microbial flora of duodenum of cage laying hens.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：899-907］

Key words：laying hens；stocking density；microbial flora of duodenum；PCR-DGGE

作者簡介:于江明（1992—），女，黑龍江海倫人，碩士研究生，養(yǎng)殖專業(yè)。E-mail：1293815530@qq.com

基金項目:黑龍江省自然科學基金（C2015040）；黑龍江省教育廳創(chuàng)新團隊項目（NO.2010td05）

收稿日期:2015-09-09

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.032

中圖分類號:S831

文獻標識碼:A

文章編號:1006-267X（2016）03-0899-09