組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響

王珊珊　高海娜　趙圣國　鄭　楠　張養(yǎng)東　王加啟　閆素梅（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

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組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響

王珊珊1，2，3高海娜2，3趙圣國2，3鄭楠2，3張養(yǎng)東2，3王加啟1，2，3閆素梅1?
（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），
北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

摘要:本試驗(yàn)旨在研究不同濃度的組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2（JAK2）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5（STAT5）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響。將原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分為對(duì)照組和7個(gè)試驗(yàn)組，采用無必需氨基酸的培養(yǎng)基，對(duì)照組不添加組氨酸，試驗(yàn)組是在對(duì)照組基礎(chǔ)上分別添加0.15、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 mmol/ L的組氨酸。采用噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞12 h增殖情況；運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)β-酪蛋白和8個(gè)信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)。結(jié)果表明：1）當(dāng)組氨酸濃度為0.15～9.60 mmol/ L時(shí)，與對(duì)照組相比，奶牛乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量均增加。2）β-酪蛋白表達(dá)量隨組氨酸濃度的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但試驗(yàn)組均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。3）與對(duì)照組相比，組氨酸的添加可極顯著促進(jìn)各信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)（P＜0.01）；試驗(yàn)組中，隨著組氨酸濃度的升高，磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白［P-mTOR（Ser(2481)）］和磷酸化真核細(xì)胞翻譯延伸因子2［P-eEF2（Thr(56)）］蛋白的表達(dá)量下降，而磷酸化核糖體S6蛋白激酶1［P-S6K1（Thr(389)）］的蛋白表達(dá)增加；當(dāng)組氨酸濃度為2.40 mmol/ L時(shí)，磷酸化酪氨酸激酶2［P-JAK2（Tyr(1007/ 1008)）］、磷酸化真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1［P-4EBP1（Thr(37)）］和磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α［P-eIF2α（Ser(51)）］蛋白的表達(dá)量最高，磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5［P-STAT5（Tyr(694)）］、磷酸化mTOR調(diào)控蛋白［P-raptor （Ser(863)）］和mTOR復(fù)合物1中的綁定蛋白（GβL）蛋白在組氨酸濃度為9.60 mmol/ L時(shí)表達(dá)量最高。綜合可知，組氨酸的添加可通過促進(jìn)JAK2-STAT5信號(hào)通路中P-JAK2（Tyr(1007/ 1008)）和PSTAT5（Tyr(694)）蛋白的表達(dá)來進(jìn)而調(diào)控β-酪蛋白表達(dá)。最適濃度（0.15～9.60 mmol/ L）范圍內(nèi)的組氨酸還可通過mTORC1的P-raptor（Ser(863)）蛋白作用于下游靶點(diǎn)P-4EBP1（Thr(37)）來促進(jìn)β-酪蛋白表達(dá)，最終調(diào)控乳蛋白合成。

關(guān)鍵詞:組氨酸；細(xì)胞增殖；酪氨酸激酶2；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；β-酪蛋白

乳蛋白是衡量乳品質(zhì)的重要營養(yǎng)指標(biāo)，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白約占其總量的82%，而αs1-酪蛋白和β-酪蛋白均占到酪蛋白總量的38%。β-酪蛋白在酪蛋白中比例恒定，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，它的合成和分泌可作為乳腺細(xì)胞分泌作用的標(biāo)志之一［1］。前人研究已經(jīng)證實(shí)，牛乳中大于90%的乳蛋白是乳腺上皮細(xì)胞以血液中的氨基酸為原料合成的［2-3］。氨基酸已經(jīng)成為乳蛋白合成過程中的主要限制性因素［4-5］，除賴氨酸和蛋氨酸外，其他氨基酸對(duì)于乳蛋白合成過程也是必需的［2，5-7］。其中組氨酸也被證實(shí)不僅可作為粗飼料中主要的限制性氨基酸之一［8］，還可作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的限制因素來調(diào)節(jié)乳蛋白合成［9］。同時(shí)也有研究表明，乳腺組織從血液中攝取的氨基酸與乳腺合成乳蛋白的氨基酸并不一致，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸和賴氨酸攝入量大于輸出量；而組氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸攝入量低于輸出量［10-11］。因此，研究乳蛋白合成過程中所需的適宜氨基酸濃度是非常必要的。

氨基酸除可作為蛋白質(zhì)合成的底物還可作為信號(hào)分子通過信號(hào)通路調(diào)控乳蛋白合成［12-13］。Yang等［14］以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型試驗(yàn)得出蛋氨酸二肽可通過酪氨酸激酶2（JAK2）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5（STAT5）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路調(diào)控αS1-酪蛋白的成。高海娜等［15］也已證實(shí)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中組氨酸的額外添加可通過mTOR信號(hào)通路促進(jìn)酪蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)。蛋白質(zhì)翻譯后的化學(xué)修飾，對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，是蛋白質(zhì)生物合成的較后步驟。常用的修飾類型有糖基化、甲基化、乙?；?、磷酸化等。其中磷酸化翻譯后修飾是目前大家研究較為普遍的共價(jià)修飾，在哺乳動(dòng)物的生命過程中，占總共價(jià)修飾的1/3便是磷酸化修飾。在真核生物中，磷酸化主要發(fā)生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等殘基［16］。因此，推測(cè)組氨酸也可通過JAK2-STAT5和mTOR信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，最終影響β-酪蛋白合成相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)。

本研究旨在以體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，研究添加不同濃度組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，研究組氨酸對(duì)β-酪蛋白、JAK2-STAT5和mTOR信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響，為組氨酸對(duì)乳中β-酪蛋白合成調(diào)控機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要儀器

恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Thermo）、電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、光密度分析儀（Bio-Rad）等。

1.1.2主要試劑

DMEM/ F12培養(yǎng)基（Gibco，貨號(hào)：11995-065/ 11765-054）、無必需氨基酸培養(yǎng)基（Gibco定制，貨號(hào)：ICH11404101）、胎牛血清（FBS，Gibco，貨號(hào)：10099-141）、青鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C0222）、胰酶（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C0203）、L -組氨酸（Sigma，貨號(hào)：H - 5659-25G）、噻唑藍(lán)（MTT，Sigma，貨號(hào)：0793-5G）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma，貨號(hào)：D4540）、mTOR（Immunoway，貨號(hào)：YT2913）、磷酸化mTOR［P-mTOR（Ser2481），Immunoway，貨號(hào)：YP1134］、真核細(xì)胞始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1，Immunoway，貨號(hào)：YT0018）、磷酸化4EBP1［P-4EBP1 （Thr37），Immunoway，貨號(hào)：YP0001］、mTOR調(diào)控蛋白（raptor，Cell Signaling Technology，貨號(hào)：sc-27744）、磷酸化mTOR調(diào)控蛋白［P-raptor （Ser863），Santa cruz，貨號(hào)：sc-130214］、核糖體S6蛋白激酶1（S6K1，Cell Signaling Technology，貨號(hào)：nos 9202）、磷酸化S6K1［P-S6K1（Thr389），Cell Signaling Technology，貨號(hào)：nos 9205］、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2（eEF2，Cell Signaling Technology，貨號(hào)：nos 2332）、磷酸化eEF2［P-eEF2（Thr56），Cell Signaling Technology，貨號(hào)：nos 2331］、真核細(xì)胞起始因子2α（eIF2α，Immunoway，貨號(hào)：YT1507）、磷酸化eIF2α［P-eIF2α（Ser51），Immunoway，貨號(hào)：YT0093］、JAK2（Santa cruz，貨號(hào)：sc-278）、磷酸化JAK2［P-JAK2（Tyr1007/ 1008），Santa cruz，貨號(hào)：sc-21870］、STAT5（Bioss，貨號(hào)：bs-1142R）、磷酸化STAT5［P-STAT5（Tyr694），Bioss，貨號(hào)：bs-1659R］、mTOR復(fù)合物1中的綁定蛋白（GβL，Cell Signaling Technology，貨號(hào)：nos. 3274）、β-酪蛋白（Biorbyt，貨號(hào)：orb18512）、β-激動(dòng)蛋白（β-actin，Immunoway，貨號(hào)：YT0099）、羊抗兔（二抗，Sigma，貨號(hào)：A9169）、兔抗羊（二抗，Millipore，貨號(hào)：AP106P）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室前期已建立原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系（選取初產(chǎn)、泌乳天數(shù)為100 d的3歲中國荷斯坦奶牛）［17］。將原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于含有10%FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基中，在38℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿（Corning，貨號(hào)：430165）的80%～90%時(shí)，用胰酶溶液于38℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大縮成圓形時(shí)，用DMEM/ F12培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)；用移液器反復(fù)吹打后，收集細(xì)胞懸液于離心管中，900 r/ min室溫離心5 min；棄上清液，加入新鮮的含有10% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸浮液。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞密度調(diào)整到大約5×104個(gè)/ mL接種到96孔培養(yǎng)板（Corning），每孔200 μL，用含有10% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基貼壁處理24 h，用不含F(xiàn)BS的DMEM/ F12培養(yǎng)基饑餓6 h，細(xì)胞處理時(shí)用無必需氨基酸的培養(yǎng)基（Gibco定制，貨號(hào)：ICH11404101）代替正常培養(yǎng)基。試驗(yàn)分為對(duì)照組和7個(gè)試驗(yàn)組，對(duì)照組不添加組氨酸，試驗(yàn)組是在對(duì)照組基礎(chǔ)上分別添加0.15、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 mmol/ L的組氨酸，每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)8 h后向每孔添加20 μL MTT工作液（5 mg/ mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清后向每孔加入150 μL DMSO，37℃振蕩10 min后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長下的吸光值（OD450 nm）來判定細(xì)胞增殖狀況。細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGE）計(jì)算公式：

RGR（%）＝試驗(yàn)組OD450 nm/對(duì)照組OD450 nm。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）檢測(cè)

1.2.3.1試驗(yàn)處理

將原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種到含有10% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中（Thermo，貨號(hào)：172958）中貼壁處理24 h，用不含F(xiàn)BS的DMEM/ F12培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行6 h的處理。試驗(yàn)分為對(duì)照組和4個(gè)試驗(yàn)組，對(duì)照組不添加組氨酸，試驗(yàn)組是在對(duì)照組基礎(chǔ)上分別添加0.15、2.40、9.60、19.20 mmol/ L的組氨酸。每種處理3個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2樣品總蛋白提取

處理結(jié)束后提取原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白。向RIPA裂解液中添加1 mmol/ L苯甲基磺酰氟（PMSF）、1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑制成混合液混合后置于冰上。用細(xì)胞刮（Costar，貨號(hào)：3008）收集細(xì)胞裂解物2 000×g離心3 min，吸取上清置于離心管中分裝。取適量樣品采用BCA（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：P0012）法測(cè)樣本總蛋白濃度，剩余樣品冷凍以備用。

1.2.3.3蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

分別向每種樣品中添加SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），95℃加熱10 min使蛋白質(zhì)熱變性。調(diào)整上樣量為30 μg進(jìn)行電泳，濃縮膠（80 mV，30 min），分離膠（120 mV，120 min）。蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（200 mA，4℃轉(zhuǎn)膜50 min）。轉(zhuǎn)移后，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5 min。TBST配成的3%血清封閉液（300 μL雞血清加10 mL TBST），放在搖床上封閉PVDF膜5 h，取出PVDF膜后用TBST漂洗3次，每次5min。將其與1×磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的1 000倍的第1抗體結(jié)合，在搖床上孵育過夜，取出PVDF膜后用TBST漂洗3次，每次5 min。后與1×PBS稀釋3 000倍的第2抗體結(jié)合，在搖床上孵育2 h。再次用TBST漂洗3次，每次5 min。用ECL顯色法試劑盒（Pierce，貨號(hào)：32106）進(jìn)行顯色。在暗室用膠片（柯達(dá)，XBT-1）在X射線攝影暗匣（廣東粵華，AX-Ⅱ）內(nèi)曝光，用光密度儀（Bio-Rad，GS-800）掃描膠片。最后用ImageJ2x分析灰度值。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件ANOVA程序進(jìn)行方差分析，平均值多重比較采用Duncan氏法，P＜0.05時(shí)表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。蛋白質(zhì)免疫印跡數(shù)據(jù)采用各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比的方法。

2　結(jié)　果

2.1組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

由圖1所示，與對(duì)照組相比，在無必需氨基酸的培養(yǎng)基中組氨酸的濃度為1.20～4.80 mmol/ L時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖極顯著增加（P＜0.01）；而當(dāng)濃度增加到19.20 mmol/ L時(shí)，可抑制細(xì)胞的增殖，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；其他組氨酸濃度的添加對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，但與對(duì)照組差異均不顯著（P＞0.05）。

圖1　組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)12 h相對(duì)生長率的影響Fig.1 Effect of His on bovine mammary epithelial cells relative growth rate after cultured for 12 h

2.2組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，當(dāng)組氨酸濃度為0 . 1 5～ 19.20 mmol/ L時(shí)，β-酪蛋白表達(dá)量隨組氨酸濃度的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；且當(dāng)濃度為2.40 mmol/ L時(shí)，β-酪蛋白表達(dá)量最高。這說明組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)的促進(jìn)效果與劑量有關(guān)。

2.3組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK2-STAT5信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響

由表1和圖3-a可知，與對(duì)照組相比，組氨酸的添加可極顯著提高P-JAK2（Tyr1007/ 1008）和PSTAT5（Tyr694）蛋白的表達(dá)量（P＜0.01）。當(dāng)組氨酸濃度為2.40 mmol/ L時(shí)，P-JAK2（Tyr1007/ 1008）蛋白表達(dá)量最高；而組氨酸濃度為9.60 mmol/ L時(shí)，P-STAT5（Tyr694）蛋白的表達(dá)量最高。這說明組氨酸的添加可促進(jìn)JAK2-STAT5信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)，但高劑量添加促進(jìn)效果減弱。

2.4組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響

由表2和圖3-a可知，與不添加組氨酸的對(duì)照組相比，添加0.15～19.20 mmol/ L組氨酸的試驗(yàn)組其P-mTOR（Ser2481）、P-raptor（Ser863）和GβL蛋白的表達(dá)量均極顯著增加（P＜0.01），其中，當(dāng)組氨酸濃度為0.15 mmol/ L時(shí)，P-mTOR（Ser2481）蛋白的表達(dá)量最高，當(dāng)組氨酸濃度為9.60 mmol/ L 時(shí)P-raptor（Ser863）和GβL蛋白的表達(dá)量最高，但高劑量添加促進(jìn)效果減弱。

圖2　組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of histidine on expression of β-casein in bovine mammary epithelial cells

由表3和圖3-b可知，與對(duì)照組相比，組氨酸的添加可極顯著促進(jìn)P-S6K1（Thr389）、P-4EBP1 （Thr37）、P-eIF2α（Ser51）和P-eEF2（Thr56）的蛋白的表達(dá)量（P＜0. 01）。當(dāng)組氨酸濃度為0.15 mmol/ L時(shí)，P-eEF2（Thr56）蛋白的表達(dá)量最高；當(dāng)組氨酸濃度為2. 40 mmol/ L時(shí)P-4EBP1 （Thr37）和P-eIF2α（Ser51）蛋白的表達(dá)量最高；而當(dāng)組氨酸濃度為19.20 mmol/ L時(shí)P-S6K1（Thr389）蛋白的表達(dá)量最高?？梢?，組氨酸的添加可促進(jìn)mTOR信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)。

表1　組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK2-STAT5信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響Table 1 Effects of His on expressions of phospho-proteins of JAK2-STAT5 signaling pathway in bovine mammary epithelial cells

表2　組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTORC1信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effects of His on expressions of phospho-proteins of mTORC1 signaling pathway in bovine mammary epithelial cells

表3　組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR下游信號(hào)蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effects of His on expressions of mTOR downstream signaling proteins in bovine mammary epithelial cells

3　討　論

3.1組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

氨基酸與激素、維生素、生長因子等相似，是影響乳腺組織增殖、分化和泌乳的重要營養(yǎng)物質(zhì)［18］。徐柏林［19］研究表明精氨酸的外源添加可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。同樣李喜艷［20］采用單一添加賴氨酸或蛋氨酸檢測(cè)24、48和72 h的增殖結(jié)果也表明，賴氨酸或蛋氨酸的添加可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。本文以體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，在無必需氨基酸的培養(yǎng)基中添加不同濃度的組氨酸，結(jié)果表明組氨酸的添加可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，但隨著濃度的增加增殖率出現(xiàn)先增后降的現(xiàn)象，這與高海娜等［15］的試驗(yàn)結(jié)果相似，這可能是組氨酸過量所產(chǎn)生的毒理作用導(dǎo)致［21］。

圖3　組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK2-STAT5和mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of His on expressions of proteins of JAK2-STAT5 and mTOR signaling pathways in bovine mammary epithelial cells

3.2組氨酸對(duì)信號(hào)通路介導(dǎo)β-酪蛋白合成相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)的影響

Bionaz等［1］為探究調(diào)控奶牛乳腺組織蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系，采用乳腺組織活檢，檢測(cè)了JAK2-STAT5信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體等44個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)的變化，揭示了乳蛋白合成的啟動(dòng)與氨基酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到乳腺上皮細(xì)胞的過程是相關(guān)的。Appuhamy等［22］和Apelo等［23］通過以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型的試驗(yàn)證明必需氨基酸可通過mTOR信號(hào)通路調(diào)控mTOR、4EBP1、S6K1、eEF2 和eIF2α等因子的磷酸化作用進(jìn)而影響乳蛋白合成。此外，高海娜等［15］利用實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）檢測(cè)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白基因（CSN2）表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，在厄爾平衡溶液中添加0.15～9.60 mmol/ L的組氨酸時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，CSN2的表達(dá)量顯著上調(diào)。這些試驗(yàn)結(jié)果均為進(jìn)一步研究氨基酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白的合成機(jī)理提供了理論依據(jù)。

本試驗(yàn)采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)添加不同濃度的組氨酸對(duì)體外培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白和JAK2-STAT5、mTOR信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白水平的影響。結(jié)果表明，組氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)的促進(jìn)效果與劑量有關(guān)，一定濃度可促進(jìn)表達(dá)，高濃度反而使促進(jìn)效果減弱，這與前人的研究報(bào)道相似［24］。組氨酸濃度為19.20 mmol/ L時(shí)，出現(xiàn)對(duì)β-酪蛋白促進(jìn)效果減弱，可能與此濃度組氨酸下的細(xì)胞增殖率下降有關(guān)。Mercier等［25］證明，乳蛋白的合成率很大程度上受到乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量的影響。這說明組氨酸的添加可通過增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量的途徑來調(diào)控乳蛋白的合成和分泌。此外，在生產(chǎn)方面Lee等［26］通過提供可代謝蛋白缺乏飼糧過瘤胃保護(hù)組氨酸證實(shí)，組氨酸的添加可以增加采食量進(jìn)而提高乳蛋白產(chǎn)量。Kim等［8］也通過組氨酸灌注試驗(yàn)證明組氨酸可顯著提高產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量。這與本試驗(yàn)的結(jié)果是相一致的。

STAT5最先發(fā)現(xiàn)是在研究催乳素刺激乳房上皮細(xì)胞的過程中，其可被多種細(xì)胞因子包括催乳激素、生長激素、促紅細(xì)胞生成素等激活［27-28］，進(jìn)而維持細(xì)胞正常功能、調(diào)節(jié)增殖和分化［29］。史琳琳［16］已經(jīng)證明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中額外添加激素類物質(zhì)時(shí)，其可通過JAK2-STAT5信號(hào)通路影響β-酪蛋白合成。在JAK2-STAT5信號(hào)通路中，STAT5 C端的Tyr（STAT 5a Tyr694和STAT 5bTyr699）的磷酸化對(duì)于STAT5核轉(zhuǎn)移及STAT5 的DNA結(jié)合能力有重要的作用［30］。激活的JAK2激酶磷酸化STAT5作用到細(xì)胞核內(nèi)相應(yīng)的脫氧核糖核酸區(qū)域，進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程影響蛋白質(zhì)合成。本研究結(jié)果顯示組氨酸的添加可以增強(qiáng)P-JAK2 （Tyr1007/ 1008）和P-STAT5（Tyr694）的表達(dá)；P-STAT5 （Tyr694）蛋白為組氨酸濃度為9.60 mmol/ L時(shí)表達(dá)量最高，與β-酪蛋白表達(dá)并未未完全一致，可能原因是其他如激素類物質(zhì)參與信號(hào)通路調(diào)控過程所致。

mTOR、raptor和GβL均為雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）的組成成分。mTOR作為調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵因子，已有學(xué)者證明除P-mTOR （Ser2448）外P-mTOR（Ser2481）也可作為調(diào)控乳蛋白合成的重要位點(diǎn)［24，31］。本試驗(yàn)中也證實(shí)了與對(duì)照組相比，組氨酸的添加可顯著提高P-mTOR （Ser2481）的蛋白表達(dá)量。raptor能夠綁定mTOR與信號(hào)通路下游蛋白S6K1和4EBP1結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量最終改變細(xì)胞的生長和增殖狀態(tài)［32-33］。GβL在mTOR的激活過程中也起著正向的調(diào)控作用，它作為mTOR的綁定蛋白與mTOR和raptor共同調(diào)控mTOR活性。前人研究表明GβL與P-mTOR（Ser2448）之間存在正相關(guān)［34］，本研究也證明了GβL與P-mTOR（Ser2481）也是正相關(guān)的。且當(dāng)組氨酸濃度為9.60 mmol/ L 時(shí)P-raptor（Ser863）和GβL蛋白表達(dá)量同時(shí)達(dá)到最高水平。

S6K1、4EBP1、eEF2、eIF2α作為mTOR信號(hào)通路下游重要的靶蛋白，它們的磷酸化狀態(tài)與乳蛋白的合成過程密切相關(guān)。S6K1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍表達(dá)，可以被多種細(xì)胞外信號(hào)激活，而被mTOR磷酸化的S6Kl活性可以上升近百倍。前人研究發(fā)現(xiàn)mTOR可以直接或間接的調(diào)控S6K中多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中P-S6K1（Thr389）可直接被mTOR磷酸化，間接調(diào)控可通過改變磷酸酶活性來完成［35］。本文結(jié)果也證實(shí)了與對(duì)照組相比，組氨酸的添加可顯著促進(jìn)P-S6K1（Thr389）蛋白的表達(dá)，且其表達(dá)量隨組氨酸濃度的增加而增加。而β-酪蛋白表達(dá)并未與P-S6K1（Thr389）的表達(dá)完全一致，可能原因是組氨酸高濃度時(shí)P-S6K1 （Thr389）會(huì)促進(jìn)其他酪蛋白如αS-酪蛋白和κ-酪蛋白的表達(dá)。此外，激活mTOR調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯還可通過誘導(dǎo)4EBP1磷酸化而完成［22］，高海娜等［15］試驗(yàn)得出，組氨酸的添加可通過mTORC1的P-raptor（Ser792）作用于下游靶點(diǎn)P-S6K1（Thr389）促進(jìn)酪蛋白表達(dá)。本試驗(yàn)進(jìn)一步證明，組氨酸在最適濃度范圍內(nèi)的添加還可通過mTORC1的P-raptor（Ser863）作用于下游靶點(diǎn)P-4EBP1（Thr37）促進(jìn)酪蛋白表達(dá)。

在蛋白質(zhì)合成過程中，eEF2通過誘導(dǎo)肽基轉(zhuǎn)運(yùn)RNA從核糖體A位到P位的移位而使肽鏈進(jìn)一步延伸，eEF2可通過磷酸化蘇氨酸56位點(diǎn)降低其與核糖體的親和力從而終止肽鏈延伸［36］。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，隨著組氨酸濃度的增加P-eEF2 （Thr56）蛋白的表達(dá)量是下降的但均極顯著高于對(duì)照組。此外真核生物還可通過激活蛋白激酶使eIF2α磷酸化，在翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，這是一種重要的調(diào)節(jié)方式。eIF2α磷酸化后，除了對(duì)大多數(shù)mRNA翻譯起抑制作用外，還能特異性激活某些mRNA的翻譯，合成特異的蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［37］。本文結(jié)果表明組氨酸的添加對(duì)P-eIF2α（Ser51）蛋白的表達(dá)存在先向上升后下降的作用，且在濃度為2.40 mmol/ L表達(dá)量最高。

綜上所述，以體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，組氨酸的添加可通過促進(jìn)JAK2-STAT5和mTOR信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)，影響β-酪蛋白合成，進(jìn)而調(diào)控乳蛋白合成。

4　結(jié)　論

①在無必需氨基酸的培養(yǎng)基中濃度為0.15～9.60 mmol/ L的組氨酸時(shí)，可促進(jìn)體外培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，但當(dāng)濃度增加到19.20 mmol/ L時(shí)可抑制其增殖。β-酪蛋白表達(dá)量最高時(shí)組氨酸的濃度為2.40 mmol/ L。

②組氨酸的添加可通過促進(jìn)JAK2-STAT5信號(hào)通路中P-JAK2（Tyr1007/ 1008）和P-STAT5（Tyr694）蛋白的表達(dá)來進(jìn)而調(diào)控β-酪蛋白表達(dá)。最適濃度（0.15～9.60 mmol/ L）范圍內(nèi)的組氨酸還可通過mTORC1的P-raptor（Ser863）作用于下游靶點(diǎn)P-4EBP1（Thr37）來促進(jìn)β-酪蛋白表達(dá)，最終調(diào)控乳蛋白合成。

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（責(zé)任編輯王智航）

Effects of Histidine on Expressions of β-casein，and Janus Kinases 2-Signal Transducer and Activator of Transcription 5/ Mammalian Target Rapamycin Signaling Pathways Related Phospho-Proteins of in Vitro Cultured Bovine Mammary Epithelial Cells

WANG Shanshan1，2，3GAO Haina2，3ZHAO Shengguo2，3ZHENG Nan2，3ZHANG Yangdong2，3WANG Jiaqi1，2，3YAN Sumei1?
（1. College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2. Ministry of Agriculture-Milk and Dairy Product Inspection Center，Beijing 100193，China；3. State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the effects of supplementation of different concentrations of histidine on expressions of β-casein and Janus kinases 2（JAK2）-signal transducer and activator of transcription 5（STAT5）/ mammalian target rapamycin（mTOR）signaling pathways related phospho-proteins of in vitrobook=925,ebook=298cultured bovine mammary epithelial cells. The primary bovine mammary epithelial cells were used in this study，the special culture medium without essential amino acid（EAA）was used. Supplementation levels of histidine were 0（control），0.15，0.60，1.20，2.40，4.80，9.60 and 19.20 mmol/ L，respectively. After cultured for 12 h，primary bovine mammary epithelial cells proliferation was dectected by thiazolyl blue（MTT）method，the expressions of β-casein and 8 signaling pathway related phospho-proteins were determined by Western-Blot. The results showed as follows：1）compared with control group the bovine mammary epithelial cell proliferation was increased after the supplementation of 0.15 to 9.60 mmol/ L of histidine. 2）With the increase histidine concentration，the expression of β-casein measured tended to be increased at first and then decrease，and all experimental groups were significantly higher than control group（P＜0.01）. 3）Compared with control group，the supplementation of histidine could significantly promote the expressions of signaling pathway related phospho-proteins（P＜0. 01）；among experimental groups，the expressions of phospho-mTOR［P-mTOR （Ser(2481)）］and phospho-eukaryotic translation elongation factor 2［P-eEF2（Thr(56)）］were reduced along with the increasing histidine concentration，and the expression of phospho- ribosome protein subunit 6 kinase 1［PS6K1（Thr(389)）］was increased with the increasing histidine concentration；the expression of phospho-JAK2 ［P-JAK2（Tyr(1007/ 1008)）］，phospho- eukaryotic initiation factor 4E binding protein［P-4EBP1（Thr(37)）］and phospho-eukaryotic initiation factor 2α［P-eIF2α（Ser(51)）］were the highest at the supplementation of 2.40 mmol/ L histidine，and the expressions of phospho-STAT5［P-STAT5（Tyr(694)）］，phospho-mTOR raptor ［P-raptor（Ser(863)）］and mTOR complex binding protein（GβL）were highest at the supplementation of 9.60 mmol/ L histidine. These results demonstrate that histidine can promote the expression of β-casein via PJAK2（Tyr(1007/ 1008)）and P-STAT5（Tyr(694)）of JAK2-STAT5 signaling pathway. Histidine at optimal concentration（0.15 to 9.60 mmol/ L）range can also promote the expression of β-casein via P-raptor（Ser(863)）of mTORC1，which act on down-stream targets P-4EBP1（Thr(37)），and finally regulation of milk protein synthesis.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：916-925］

Key words：histidine；cell proliferation；JAK2；mTOR；β-casein

Corresponding author?，professor，E-mail：yansmimau@163.com

通信作者:?閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：yansmimau@163.com

作者簡介:王珊珊（1990—），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail：imauwss@163.com

基金項(xiàng)目:奶業(yè)“973”計(jì)劃（2011CB100800）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（nycytx-04-01）

收稿日期:2015-10-13

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.034

中圖分類號(hào):S823

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1006-267X（2016）03-0916-10