肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

龍建云，訾曉淵，李靜，黃亮，曹杰，嚴(yán)以群(.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外一科，上海00438；.第二軍醫(yī)大學(xué)干細(xì)胞與醫(yī)學(xué)研究中心，上海00438)

?

肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

龍建云1，訾曉淵2，李靜1，黃亮1，曹杰1，嚴(yán)以群1
(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外一科，上海200438；2.第二軍醫(yī)大學(xué)干細(xì)胞與醫(yī)學(xué)研究中心，上海200438)

[摘 要]原發(fā)性肝癌是一種惡性程度高的腫瘤，易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，其中最常見的轉(zhuǎn)移途徑為血行轉(zhuǎn)移。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是肝癌血行轉(zhuǎn)移的中心環(huán)節(jié)，實(shí)時監(jiān)測循環(huán)腫瘤細(xì)胞對患者個體化治療、療效評估及監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有很好的價值，使其成為肝癌研究的熱點(diǎn)，但由于肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞缺乏特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記物，為進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用造成一定的困難。本文就肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞常用的檢測技術(shù)及現(xiàn)階段所進(jìn)行的研究結(jié)果做一綜述。

[關(guān)鍵詞]肝癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測；臨床應(yīng)用

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是一種發(fā)病率在男性中排第五、女性中排第三，致死率排第三的惡性腫瘤，高發(fā)于亞、非洲，近年來發(fā)病率在歐美等地呈逐年上升趨勢[1]。針對原發(fā)性肝癌，公認(rèn)的治療方案有手術(shù)切除、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)、靶向藥物(索拉非尼)、肝移植、放射治療及化療等[1-2]。但臨床表明上述治療手段均不能有效的延長患者的生存期，這主要是與肝癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是一個多因素、多階段的復(fù)雜過程，其具體機(jī)制目前尚不是很明確。近年來由原發(fā)瘤灶釋放入血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)引起的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移成為研究熱點(diǎn)[3-4]。其中支持CTC最有力的證據(jù)是肝癌晚期患者行肝移植后，健康的肝臟短期內(nèi)重新患上腫瘤[3]。而目前臨床上主要是依靠血清及影像學(xué)檢查，如血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，但精確性均不高，特別是對直徑＜1 cm的小肝癌中[5]。因此一些學(xué)者提出與其去尋找腫瘤細(xì)胞釋放入血的特異性指標(biāo)，不如直接去分離及檢測原發(fā)瘤灶釋放入血的腫瘤細(xì)胞[6]。

1　CTC

1869年，澳大利亞學(xué)者Ashworth在尸檢中首次找到類似具有腫瘤細(xì)胞特性的血細(xì)胞，由此提出CTC的概念[7]。CTC是指從原發(fā)病灶或是轉(zhuǎn)移灶釋放到脈管系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，通常情況下進(jìn)入循環(huán)血液中的腫瘤細(xì)胞會死亡，只有極少數(shù)生存能力強(qiáng)、具有高活力及高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞能生存下來，聚集形成微小癌栓，并在一定條件下形成轉(zhuǎn)移灶[3]。目前主要采用了CSS(Cell Search System)檢測方法捕獲外周血中的CTC，CSS是一種負(fù)性富集與檢測為一體的半自動檢測技術(shù)，依靠上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)分選CTC，富集效率可達(dá)1×104～2×104倍，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)唯一批準(zhǔn)用于檢測CTC的方法，已廣泛應(yīng)用于乳腺癌，前列腺癌，腎癌等腫瘤研究中，具有高度靈敏性及特異性[3，8-9]。但鑒于肝癌CTC的特殊性，目前肝癌CTC研究還處于實(shí)驗(yàn)探索階段。

1.1肝癌CTC與腫瘤干細(xì)胞

目前多中心研究提示肝癌CTC不單單只有一種表面標(biāo)記物，CTC具有多種細(xì)胞亞群，如CD90+CD40+CTC、KRT18+EpCAMCTC、DAPI+Pan-CK+CTC、CD45-CD90+CD44+CTC、CD45-ICAM-1+CTC等，并且認(rèn)為肝癌CTC具有腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)的特性[6，10-12]。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)CD90+CD40+CTC具有CSC自我更新特性，Smirnov、Liu等[12，14]用流式分選法從肝癌患者外周血中分離出CD45-ICAM-1+CTC，該亞群細(xì)胞在正常人外周血液中未檢測出，ICAM-1是一種受Nanog轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的細(xì)胞間黏附分子，具有誘導(dǎo)微小血栓及腫瘤形成的能力，Schulze 等[15]用免疫磁珠法分離EpCAM+CTC，結(jié)合臨床發(fā)現(xiàn)EpCAM+CD45-CTC相對于EpCAM-CD45-CTC的患者具有更強(qiáng)致瘤性。以上研究一方面證實(shí)了肝癌CTC的存在，另一方面也表明了相對于原發(fā)部位的腫瘤細(xì)胞，CTC具有更多基因表型，具有高致瘤性、高侵襲力及高轉(zhuǎn)移特性，是一種特殊類型的CSC[12，15]。因此了解CSC特性，研究CSC與CTC聯(lián)系，有利于深入研究CTC基因型及表型異質(zhì)性。

1.2肝癌CTC與基因

TP53是一種抑癌基因，主要控制細(xì)胞周期及細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)生長基因的轉(zhuǎn)錄，在很多腫瘤患者體內(nèi)處于激活狀態(tài)[16]。Her-2是一種編碼酪氨酸激酶受體的基因，屬于上皮生長因子家族，單克隆抗體曲妥單抗即一種針對乳腺癌Her-2的靶向治療藥物[17]，但是肝癌中Her-2擴(kuò)增是否具有特異性目前還存在很大的爭議[18-21]。Xu等[22]根據(jù)肝細(xì)胞表面表達(dá)去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，用免疫磁珠分選出肝癌CTC，后用Hep Par1抗體進(jìn)行免疫熒光鑒別，同時進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)2例患者17號染色體呈明顯的三倍體性狀，同時伴有雙等位基因TP53缺失及Her-2基因擴(kuò)增。但是肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中TP53缺失，Her-2基因擴(kuò)增這一現(xiàn)象是否具有普遍性，還有待進(jìn)一步的研究。Xian等[18，23]認(rèn)為在惡性腫瘤中Her-2的擴(kuò)增是不常見，但Neo等[19-20]認(rèn)為Her-2的過表達(dá)在腫瘤中是常見的。因此需要大規(guī)模的臨床研究來驗(yàn)證上述基因表達(dá)在肝癌CTC中是否具有特異性。

2　肝癌CTC的檢測及創(chuàng)新

在過去的十幾年里，研究人員采用了一系列技術(shù)試圖去高效率捕獲肝癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，但是由于CTC數(shù)目極少，106～107個血細(xì)胞中只有不到1個CTC，使得用常規(guī)方法很難捕獲[21]，至今尚未得到一個分離肝癌CTC的金方法。CTC的檢測包括富集和分析兩個步驟，鑒于每一種方法均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員又進(jìn)行了一系列創(chuàng)新，將各種不同方法結(jié)合在一起，試圖富集更多的CTC用來臨床研究。

2.1細(xì)胞密度梯度離心和細(xì)胞過濾法

根據(jù)腫瘤細(xì)胞的物理特性篩選循環(huán)血液中的腫瘤細(xì)胞，如細(xì)胞密度梯度離心法及細(xì)胞過濾法，細(xì)胞密度梯度離心法是根據(jù)血流中不同細(xì)胞群的密度梯度差異，將肝癌病人血樣品中的腫瘤細(xì)胞濾出[24]。而細(xì)胞過濾技術(shù)是指通過濾網(wǎng)或樹脂薄膜將直徑大于8 μm的腫瘤細(xì)胞分離，根據(jù)這一原理出現(xiàn)了各種微小過濾裝置如ScreenCell裝置，它可以分離出82%～88%的腫瘤細(xì)胞[25-26]。這兩種方法優(yōu)點(diǎn)在于能夠保證分離到的腫瘤細(xì)胞的完整性，且不會破壞細(xì)胞表面標(biāo)志物，可以為熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)、免疫磁珠分選(magnetic activated cell sortion，MACS)等做純化前準(zhǔn)備，并且有利于進(jìn)一步的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)及基因?qū)W分析[24]，缺點(diǎn)在于根據(jù)物理特性篩選CTC方法特異性及敏感性差，易混雜其他血細(xì)胞，且會遺漏掉部分腫瘤細(xì)胞[27]。

2.2流式細(xì)胞儀分選和免疫磁珠分選

流式細(xì)胞儀是根據(jù)細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物來篩選CTC，具有快速性及準(zhǔn)確性[28]，雖然這一方法在大樣本檢測中有一定的局限性，但其在經(jīng)過細(xì)胞梯度離心和細(xì)胞過濾后的血樣品中再次分離出有EpCAM或CD133等表面標(biāo)記物的腫瘤細(xì)胞中具有一定的優(yōu)勢[24]。免疫磁珠分選原理主要是將特殊抗體捆綁在磁珠上，抗體會與腫瘤表面的抗原發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，然后移向外部磁場從而達(dá)到分離的目的，有正性富集與負(fù)性富集兩種方式，最具有代表性的是CSS或Iso ux systems[22]。但研究表明用EpCAM標(biāo)記物分選腫瘤細(xì)胞的CSS分選方式并不適于肝癌。一方面盡管肝臟也是上皮源性器官，但臨床肝癌組織不到30%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)EpCAM[3]。另一方面肝癌形成轉(zhuǎn)移灶過程中會發(fā)生上皮間質(zhì)化(epithelial mesenchymal，EMT)，雖然腫瘤細(xì)胞能夠獲得侵襲性，但同時也會喪失一些特定的表面標(biāo)記物表達(dá)，如EpCAM等，因此限制了以EpCAM為標(biāo)記物的檢驗(yàn)方法(CSS)的使用[29]。

2.3肝癌CTC的檢測創(chuàng)新

鑒于單一技術(shù)分離CTC的局限性，科研人員對此進(jìn)行了一系列創(chuàng)新，如采用新的腫瘤表面標(biāo)記物如ASGPR、聯(lián)合其他抗體一起檢測CTC、PCR和負(fù)性富集結(jié)合、條形碼粒子等檢測方法。復(fù)旦肝病研究中心Li等[29]根據(jù)肝癌患者肝細(xì)胞膜表面含有大量ASGPR，且部分表達(dá)CPS1或P-CK，獨(dú)創(chuàng)了一種聯(lián)合ASGPR、CPS1、P-CK的免疫熒光染色鑒定方法，具有81%的敏感性及100%特異性。但部分研究者認(rèn)為ASGPR是肝細(xì)胞表面的特異分子，80%肝癌患者肝細(xì)胞表面可以檢測到，用它做標(biāo)記物缺少針對腫瘤細(xì)胞的特異性[22]。因此這一模板的實(shí)用性還有待商榷。除此之外，Guo等[30]還創(chuàng)建了一種新模板，將負(fù)性富集和qRT-PCR結(jié)合(EpCAMmRNA+)來檢測CTC，檢測結(jié)果與Cellsearch系統(tǒng)有76.7%的相似度，具有高度敏感性及特異性，但仍需大量的樣本及臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其合理性。且隨著納米技術(shù)在臨床研究應(yīng)用的深入，Zheng等[31]發(fā)明了一種新型的條形碼粒子，帶有球形膠體狀結(jié)晶簇，表面有聚合放大的適體探針及六角形對稱的納米粒子，底盤有探針固定化的接觸面，能夠捕獲多種類型的CTC，敏感性高達(dá)92.83%。但是目前這些新型的捕獲CTC方法還處于摸索階段，有待進(jìn)一步完善。

3　肝癌CTC與臨床表現(xiàn)的關(guān)系

3.1肝癌CTC與門脈癌栓的關(guān)系

既往一直認(rèn)為門脈癌栓是腫瘤全身擴(kuò)散的來源[32]。目前不管通過CSS直接檢測還是PCR技術(shù)間接檢測CTC，均提示CTC是存在于外周血液中的且其與門脈癌栓存在有著密切關(guān)系，有門靜脈癌栓的患者外周血中CTC陽性率顯著高于無門靜脈癌栓患者[33-34]。Vona等[35]用CSS檢測了44例肝癌患者外周血CTC，檢出率為52%，Li等[22]用RT-PCR檢測85例肝癌患者循環(huán)血液中的腫瘤細(xì)胞，通過檢測CTC中MACE-1 mRNA，SSX1 mRNA，Cpf11 mRNA，發(fā)現(xiàn)CTC檢出率與門脈癌栓的存在呈明顯相關(guān)性，且CTC的數(shù)目、微小癌栓的存在會影響腫瘤擴(kuò)散及患者1年生存期。門脈癌栓不僅與外周血CTC數(shù)目有關(guān)，而且脈管系統(tǒng)中不同部位的CTC與門脈癌栓形成也有密切的關(guān)系。Fang等[36]用CSS分別檢測了42例肝癌患者外周血及右心房中CTC的存在情況，發(fā)現(xiàn)右心房中的中位CTC數(shù)目比外周血液中多，兩個部位CTC數(shù)目存在明顯差異，該差異在術(shù)前及術(shù)后均有統(tǒng)計學(xué)意義，且右心房中的CTC數(shù)目與肝癌門脈癌栓呈正相關(guān)。

3.2肝癌CTC與腫瘤分期的關(guān)系

為了給不同肝癌患者選擇有效的個體化治療，出現(xiàn)了一系列的分期方法，如Okuda分期、BCLC(Barcelona Clinic Liver Cancer)分期、CUPI(Chinese University Prognostic Index)、TNM分期、Milan分期等[37]。研究表明外周血液中的CTC陽性率及腫瘤分期(Milan、BCLC、TNM分期)呈正相關(guān)，有肉眼血管侵犯及肝外轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)CTC陽性率更高。Schulze等[13]用CSS檢測CTC，并根據(jù)外周血中CTC數(shù)目對腫瘤進(jìn)行分期，并與臨床分期進(jìn)行比較，統(tǒng)計學(xué)提示用外周血CTC分期其準(zhǔn)確性為61%，敏感性為58%及特異性為83%。同時Schulze等還發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，在很多TNM分期提示為早期肝癌患者外周血中已能檢測CTC，與該項(xiàng)研究一致的是Xu 等[22]用ASGPR及其配體聯(lián)合檢測的85例HCC患者，在80%早期或腫瘤＜2 cm的肝癌患者外周血已能檢測出CTC。這也側(cè)面反映了肝癌是惡性程度很高的腫瘤，早期肝癌患者即有可能發(fā)展為全身性疾病。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)CTC陽性率及數(shù)目與腫瘤分化(Edmondson-Steiner分期)有關(guān)[38]。因此倘若能夠?qū)TC應(yīng)用于常規(guī)檢查，將會有利于肝癌患者的早期期診斷，并能監(jiān)測患者預(yù)后，進(jìn)而延長患者的生存期。

3.3肝癌CTC與AFP的關(guān)系

AFP是臨床肝癌診斷中最有意義的血清學(xué)參考指標(biāo)。但研究表明AFP特異性不強(qiáng)，大約1/3的肝癌患者AFP呈陰性，且很多良性肝臟疾病患者體內(nèi)AFP也會呈升高趨勢，因此一些研究者試圖去尋找血清學(xué)更為特異性的指標(biāo)用來診斷AFP陰性肝癌患者[5]。而鑒于CTC的客觀性，目前已成為腫瘤血清學(xué)研究熱點(diǎn)，關(guān)于肝癌CTC與AFP之間是否存在相關(guān)性，存在很多不同的研究結(jié)果。Nel等[11]通過檢測出EpCAM+CTC里特異性基因表達(dá)如IGFBP1、HGFAC、Hif1a、TGFb、KRT19，發(fā)現(xiàn)AFPmRNA具有75%的敏感性及71%的特異性。Schulze等[15]研究發(fā)現(xiàn)EpCAM+CTC的肝癌患者AFP含量均＞400 ng/mL，這與Wu等[24]研究結(jié)果一致，Wu課題組成員發(fā)現(xiàn)CTC陽性患者AFP通常＞300 ng/mL，且術(shù)前AFPmRNA含量與復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性，而術(shù)后患者血液中AFPmRNA含量與復(fù)發(fā)存在風(fēng)險相關(guān)，且有門脈癌栓的肝癌患者，根據(jù)AFPmRNA變化情況可以判斷患者預(yù)后。Xu 等[22]用RT-PCR技術(shù)檢測了85例患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中MACE-1，SSX1，Cpf11基因mRNA，65.9%肝癌患者中發(fā)現(xiàn)了至少一種上述基因mRNA的表達(dá)，肝癌患者中三種CTC抗原基因mRNA的檢出率與血清AFP水平無顯著相關(guān)性。因此仍需要大樣本的、多中心研究來明確對肝癌CTC與AFP之間的關(guān)系。

4　肝癌CTC與個體化治療的關(guān)系

臨床醫(yī)生主要通過患者臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查結(jié)果給患者制定不同的治療方案，但目前腫瘤組織活檢及基因檢測才是個體化治療最好的指標(biāo)，然而由于穿刺活檢有創(chuàng)，臨床普及率不高。同時腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)認(rèn)為外界干預(yù)性治療如手術(shù)，TACE術(shù)，射頻，肝組織活檢會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自原發(fā)部位逸出進(jìn)入脈管系統(tǒng)，導(dǎo)致外周血中腫瘤細(xì)胞增多，增加患者術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險[3]。肝癌惡性程度高，復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～70%，目前主要依靠AFP及MRI發(fā)現(xiàn)肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶，但對于更早期的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，仍缺少有效的診斷方法，導(dǎo)致很多患者失去早期發(fā)現(xiàn)及治療的機(jī)會。因此CTC作為一種無創(chuàng)有效的指標(biāo)得到很大的關(guān)注，如果能夠早期診斷，如果能夠有效的應(yīng)用于臨床，監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，肝癌患者的死亡將有望大大降低。

4.1肝癌CTC與手術(shù)、肝移植的關(guān)系

關(guān)于有創(chuàng)治療會引起或抑制腫瘤擴(kuò)散，目前仍存在很大爭議。Fan等[39]通過建立肝癌原位轉(zhuǎn)移模型及流式細(xì)胞儀動態(tài)監(jiān)測CTC，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTC數(shù)目明顯下降且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯降低，因此Fan等認(rèn)為手術(shù)可以控制腫瘤轉(zhuǎn)移，且CTC的動態(tài)變化與腫瘤生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶相關(guān)。SUN等[34]開展的一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前及術(shù)后一個月EpCAM+CTC數(shù)目變化具有明顯差異，CTC7.5 mL＞2個比＜2個的患者有更高的復(fù)發(fā)率及更短的復(fù)發(fā)周期，并且CTC7.5 mL＞2個是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因，并且在AFP＜400 ng/mL，CTC7.5 mL＞2個的肝癌亞群患者體內(nèi)，術(shù)后預(yù)防性化療可以延緩患者腫瘤復(fù)發(fā)?？偟膩碚f，研究表明CTC可以作為監(jiān)測肝癌治療指標(biāo)，但仍需要大樣本研究證實(shí)CTC7.5 mL＞2是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。針對CTC與肝移植的關(guān)系，鑒于納入的肝移植患者少，尚無明確結(jié)論。但在復(fù)旦肝病研究中心小樣本研究[22]中發(fā)現(xiàn)部分未滿足Milan標(biāo)準(zhǔn)的肝移植患者外周血中CTC7.5 mL陽性率及數(shù)目甚至比一些滿足Milan標(biāo)準(zhǔn)的肝移植患者還要高，并對7例行肝移植患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，術(shù)后一年3例CTC陰性的患者均未復(fù)發(fā)，而在其他4例CTC陽性的患者中有3例術(shù)后6個月即出現(xiàn)復(fù)發(fā)[22]，鑒于納入患者數(shù)目過少無法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及進(jìn)一步的研究[22]。

4.2肝癌CTC與TACE、放療的關(guān)系

而針對肝癌行TACE術(shù)后會不會引起腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶逸出，進(jìn)入脈管系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致外周血中CTC增多，說法不一[36，40]。Fang等[36]研究表明TACE術(shù)后外周血及右心房中的EpCAM+CTC無明顯改變，因此認(rèn)為TACE不會誘發(fā)原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞的逃逸，進(jìn)而影響患者的疾病進(jìn)展時間及生存期。但在Huang等[40]研究中，卻得到相反的結(jié)論，Huang等將171位患者分為TACE組及對照組，用CSS檢測患者術(shù)前及術(shù)后外周血中CTC，發(fā)現(xiàn)兩者具有顯著差異；且AFP高低，肝硬化有無是患者外周血CTC數(shù)目的獨(dú)立影響因素。兩種結(jié)果的差異可能是由于分選腫瘤細(xì)胞方法不一致所引起的。Guo等[30]用負(fù)性富集和qRT-PCR結(jié)合的方法即EpCAMmRNA+CTC，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)接受TACE術(shù)治療的患者CTC數(shù)目下降，術(shù)前后CTC數(shù)目改變具有統(tǒng)計學(xué)意義；但是在接受放射治療的患者體內(nèi)該差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但治療前EpCAMmRNA+CTC數(shù)目是接受TACE及放射治療的肝癌患者無疾病進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)測因素，且在BCLC B和C期肝癌患者體內(nèi)，治療前EpCAMmRNA+CTC存在者相對于比EpCAMmRNA-CTC的患者疾病進(jìn)展快及復(fù)發(fā)率高，這僅僅局限于單中心、小樣本，仍需要大數(shù)據(jù)、多中心研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。此外除了單純檢測EpCAM+CTC，Nel等[11]通過檢測出EpCAM+CTC里特異性基因表達(dá)如IGFBP1、AFP、HGFAC、Hif1a、TGFb、KRT19等來監(jiān)測HCC患者個體化治療療效及預(yù)后，研究表明AFPmRNA預(yù)測疾病進(jìn)展具有75%的敏感性及71%的特異性，而低表達(dá)的IGFBP1敏感性為80%、特異性為80%。由此認(rèn)為EpCAM+CTC內(nèi)特異性的分子表達(dá)可用于監(jiān)測患者預(yù)后。

5　總結(jié)與展望

總的來是，外周血標(biāo)本是臨床上理想的標(biāo)本來源，便于采集，創(chuàng)傷性小，且患者依從性強(qiáng)。CTC作為監(jiān)測患者預(yù)后及表征的重要生物學(xué)標(biāo)記，具有很好的研究意義。目前肝癌CTC研究取得了一系列進(jìn)展，但現(xiàn)狀仍不容樂觀。一方面，由于缺乏特異性的CTC表面標(biāo)記物，富集出的CTC數(shù)目有限；雖然各種富集分析技術(shù)研發(fā)有一定的進(jìn)展，但僅局限于小樣本研究，且仍存在各種不足，還需要進(jìn)一步探索。另一方面，多中心小樣本研究表明CTC數(shù)目及表面標(biāo)記物表達(dá)有利于患者個體化治療及監(jiān)測患者預(yù)后，但是表面標(biāo)記物代表的是腫瘤某一階段特性，惡性腫瘤是一個動態(tài)變化過程，隨著各種治療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生基因改變，喪失部分標(biāo)記物的表達(dá)，進(jìn)而喪失對治療療效的監(jiān)測作用。因此建議研究人員能夠動態(tài)去觀察患者外周血CTC數(shù)目及表面標(biāo)記物變化，找出CTC變化規(guī)律，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。隨著肝癌CTC表面特異標(biāo)記物的不斷發(fā)現(xiàn)及檢測手段靈敏性及特異性的提高，CTC可成為一種新興的液體活檢，無創(chuàng)且比血清學(xué)及影像學(xué)檢查更客觀性；并有望在分子生物學(xué)水平進(jìn)一步闡述腫瘤發(fā)展機(jī)制，從而為肝癌患者臨床分期，預(yù)后判斷及個體化診治帶來新的希望。

參考文獻(xiàn):

[1]BOSETTI C, TURATI F, L A VECCHIA C.Hepatocellular carcinoma epidemiology[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2014； 28(5):753-770.

[2]SANGRO B.Chemoembolization and radioembolization[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2014； 28(5):909-919.

[3]滕飛, 傅志仁, 等.肝細(xì)胞肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究進(jìn)展及其在肝移植中的應(yīng)用前景.中華移植雜志[J].2013, 7(3):29 -33.

[4]PANTEL K, BRAKENHOFF R H, BRANDT B, et al.Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells[J].Nat Rev Cancer, 2008, 8(5):329-340.

[5]WONG K F, XU Z, CHEN J, et al.Circulating markers for prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Expert Opin Med Diagn, 2013, 7(4):319-329.

[6]HESKETH R L, ZHU A X, OKLU R, et al.Hepatocellular Carcinoma:Can Circulating Tumor Cells and Radiogenomics Delive Personalized Care?[J].Am J Clin Oncol, 2015, 38(4):431-436.

[7]ASHWORTH A B.A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death[J].Aust Med J, 1869, 14:146-149.

[8]BEVILACQUA S, GALLO M, FRANCO R, et al.A ＂live＂ biopsy in a small-cell lung cancer patient by detection of circulating tumor cells[J].Lung Cancer, 2009, 65(1):123-125.

[9]PAPAVASILIOU P, FISHER T, KUHN J, et al.Circulating tumor cells in patients undergoing surgery for hepatic metastases from colorectal cancer[J].Proc (Bayl Univ Med Cent), 2010, 23(1):11-14.

[10]LIU S, LI N, YU X, et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 by hepatocellular carcinoma stem cells and circulating tumor cells[J].Gastroenterology, 2013, 144(5):1031-1041.

[11]NEL I, BABA H A, WEBER F, et al.IGFBP1 in epithelial circulating tumor cells as a potential response marker to selective internal radiation therapy in hepatocellular carcinoma[J].Biomark Med, 2014, 8(5):687-698.

[12]SMIRNOV D A, ZWEITZIG D R, FOULK B W, et al.Global gene expression pro■ling of circulating tumor cells[J].Cancer Res, 2005, 65(12):4993-4997.

[13]YANG Z F, HO D W, NG M N, et al.Signi■cance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer[J].Cancer Cell, 2008, 13(2):153-166.

[14]LIU S, LI N, YU X, et al.Expression of intercellular adhesion molecule 1 by hepatocellular carcinoma stem cells and circulating tumor cells[J].Gastroenterology, 2013, 144(5):1031-1041.

[15]SCHULZE K, GASCH C, STAUFER K, et al.Presence of EpCAMpositive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int J Cancer, 2013, 133(9):2165-2171.

[16]CHEN S, CHEN J, XI W, et al.Clinical therapeutic effect and biological monitoring of p53 gene in advanced hepatocellular carcinoma[J].Am J Clin Oncol, 2014, 37(1):24-29.

[17]ROSS J S, FLETCHER J A, LINETTE G P, et al.The Her-2/ neu gene and protein in breast cancer 2003:biomarker and target of therapy[J].Oncologist, 2003, 8(4):307-325.

[18]BACAKSIZ A, SAHIN F I, BILEZIKCI B, et al.Determination of HER-2/Neu status in hepatocellular carcinoma cases[J].Genet Test, 2008, 12(2):211-214.

[19]NEO S Y, LEOW C K, VEGA V B, et al.Identi■cation of discriminators of hepatoma by gene expression pro■ling using a minimal dataset approach[J].Hepatology, 2004, 39(4):944-953.

[20]LIU J, AHIEKPOR A, LI L, et al.Increased expression of ErbB-2 in liver is associated with hepatitis B x antigen and shorter survival in patients with liver cancer[J].Int J Cancer, 2009, 125(8):1894-1901.

[21]KAISER J.Medicine.Cancer＇s circulation problem[J].Science, 2010, 327(5969):1072-1074.

[22]XU W, CAO L, CHEN L, et al.Isolation of circulating tumor cells in patients with hepatocellular carcinoma using a novel cell separation strategy[J].Clin Cancer Res, 2011, 17(11):3783-3793.

[23]XIAN Z H, ZHANG S H, CONG W M, et al.Overexpression/ amplification of HER-2/neu is uncommon in hepatocellular carcinoma[J].J Clin Pathol, 2005, 58(5):500-503.

[24]WU L J, PAN Y D, PEI X Y, et al.Capturing circulating tumor cells of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett, 2012, 326 (1):17-22.

[25]LIN H K, ZHENG S, WILLIAMS A J, et al.Portable ■lterbased microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells[J].Clin Cancer Res, 2010, 16(20):5011-5018.

[26]DESITTER I, GUERROUAHEN B S, BENALI-FURET N, et al.A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells[J].Anticancer Res, 2011, 31(2):427-441.

[27]BALIC M, DANDACHI N, HOFMANN G, et al.Comparison of two methods for enumerating circulating tumor cells in carcinoma patients[J].Cytometry B Clin Cytom, 2005, 68(1):25-30.

[28]GUO J, YAO F, LOU Y, et al.Detecting carcinoma cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma by immunomagnetic beads and rt-PCR[J].J Clin Gastroenterol, 2007, 41(8):783-788.

[29]LI J, CHEN L, ZHANG X, et al.Detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma using antibodies against asialoglycoprotein receptor, carbamoyl phosphate synthetase 1 and pan-cytokeratin[J].PLos One, 2014, 9(4):e96185.

[30]GUO W, YANG X R, SUN Y F, et al.Clinical signi■cance of EpCAM mRNA-positive circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma by an optimized negative enrichment and qRT-PCR-based platform[J].Clin Cancer Res, 2014, 20(18):4794-4805.

[31]ZHENG F, CHENG Y, WANG J, et al.Aptamer-functionalized barcode particles for the capture and detection of multiple types of circulating tumor cells[J].Adv Mater, 2014, 26(43):7333-7338.

[32]MITSUNOBU M, TOYOSAKA A, ORIYAMA T, et al.Intrahepatic metastases in hepatocellular carcinoma:the role of the portal vein as an efferent vessel[J].Clin Exp Metastasis, 1996, 14(6):520-529.

[33]XIA F, LAU W Y, XU Y, et al.Does hepatic ischemia-reperfusion injury induced by hepatic pedicle clamping affect survival after partial hepatectomy for hepatocellular carcinoma[J].World J Surg, 2013, 37(1):192-201.

[34]SUN Y F, XU Y, YANG X R, et al.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection[J].Hepatology, 2013, 57(4):1458-1468.

[35]VONA G, ESTEPA L, BEROUD C, et al.Impact of cytomorphological detection of circulating tumor cells in patients with liver cancer[J].Hepatology, 2004, 39(3):792-797.

[36]FANG Z T, ZHANG W, WANG G Z, et al.Circulating tumor cells in the central and peripheral venous compartment-assessing hematogenous dissemination after transarterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma[J].Onco Targets Ther, 2014, 7:1311-1318.

[37]MAIDA M, ORLANDO E, CAMMA C, et al.Staging systems of hepatocellular carcinoma:a review of literature[J].World J Gastroenterol, 2014, 20(15):4141-4150.

[38]ZHOU L, RUI J A, YE D X, et al.Edmondson-Steiner grading increases the predictive efficiency of TNM staging for longterm survival of patients with hepatocellular carcinoma after curative resection[J].World J Surg, 2008, 32(8):1748-1756.

[39]FAN Z C, YAN J, LIU G D, et al.Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo ■ow cytometry assesses resection on metastasis[J].Cancer Res, 2012, 72(10):2683-2691.

[40]HUANG J W, LIU B, HU B S, et al.Clinical value of circulating tumor cells for the prognosis of postoperative transarterial chemoembolization therapy[J].Med Oncol, 2014, 31(9):175.

(本文編輯:魯翠濤)

[通訊作者簡介]嚴(yán)以群，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，ehbhyyq@163.com。

作者簡介][第一龍建云(1991-)，女，江西吉安人，在讀碩士。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81441063)；第二軍醫(yī)大學(xué)干細(xì)胞與醫(yī)學(xué)研究中心研究生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)課題(SCMRC1406)。

[收稿日期]2015-08-02

[中圖分類號]R604； R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.021