門靜脈輸注胰島至大鼠肝臟去細胞支架的結(jié)果考察

鄭祥韜，傅紅興，邱凱燕，何云強，張偉，高歌，王麗芳(.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，浙江溫州5000；.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州505；.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，浙江寧波5000)

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門靜脈輸注胰島至大鼠肝臟去細胞支架的結(jié)果考察

鄭祥韜1，傅紅興2，邱凱燕2，何云強2，張偉3，高歌2，王麗芳2
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，浙江溫州325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035；3.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，浙江寧波315000)

[摘 要]目的 考察經(jīng)門靜脈移植后的胰島細胞團在肝臟血管中停留的位置及栓塞部位細胞團的相關(guān)情況。方法 取成年SD大鼠，從門靜脈在體灌注去污劑十二烷基硫酸鈉溶液使肝臟去細胞化，再輸注經(jīng)二苯基硫卡巴腙染色后的大鼠胰島，在體視顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察去細胞后的肝臟內(nèi)部的血管和胰島在肝臟內(nèi)的栓塞情況。結(jié)果 大鼠肝臟在體去細胞后，可得到完全透明、清晰的肝臟支架，肝內(nèi)血管分支豐富，經(jīng)灌注(800±250)IEQ胰島細胞團后，胰島主要栓塞在大鼠肝臟邊緣血管末梢，有時一個血管末梢栓塞有多個細胞團。結(jié)論 本方法模擬大鼠門靜脈內(nèi)胰島移植，呈現(xiàn)了胰島在肝臟內(nèi)血管的駐留情況，有利于進一步研究改進胰島在肝內(nèi)移植后的存活和功能發(fā)揮。

[關(guān)鍵詞]大鼠；肝去細胞支架；門靜脈；胰島移植

The investigation of islet infused into the rat decellularized liver bioscaffold in the body through portal vein

ZHENG Xiang-tao1, FU Hong-xing2, QIU Kai-yan2, HE Yun-qiang2, ZHANG Wei3, GAO Ge2, WANG Li-fang2.1Department of General Surgery, The First Af■liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325000, China;2School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325035, China;3Department of Pharmacy, Af■liated Hospital ofMedical School, Ningbo University, Ningbo, Zhejiang 315000, China

Abstract ObjectiveTo investigate the position and the circumstances of the islets transplanted in liver blood vessels by islets infusion through portal vein of rat.MethodsSD rats were chosen in this experiment, detergent sodium dodecyl sulfate was perfused into the liver from the portal vein to decellular the cells in the body.Then the rat islets stained by two diphenylthiocarbazone was also infused into the portal vein.The positions embolized by islets in the liver blood vessels were investigated from look inside the decellularized liver bioscaffold under stereomicroscope and inverted microscope.ResultsA completely transparent, clear liver bioscaffold was available after decellularization, which were rich in intrahepatic vascular branches in the body.After the infusion of 800±250 IEQ, the majority of rat islets were embolized in the microvascular in the peripheral edge of the liver.Some branches were even embolized by more than one islets.ConclusionClearly showing of the blood microvasculars in the liver and the station of the islets transplanted into the liver from the rat portal vein can be available by this method, which makes a good foundation for the further study on how to improve the islet survival and the function transplanted in the liver.

Key words rats； decellularized liver bioscaffold； portal vein； islet transplantation

胰島移植作為一種臨床有效的治療胰島素絕對缺乏糖尿病的手段，因其微創(chuàng)和安全性好，已越來越被國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界推崇[1-2]，五年的臨床移植后結(jié)果也已與全胰腺移植無差異[3]。肝臟是臨床和實驗研究中胰島移植的常用部位，但胰島細胞團經(jīng)門靜脈移植進入肝臟后的去向、具體栓塞位置和栓塞情況，即使在影像學(xué)發(fā)達的今天，在文獻中也鮮有清晰、直觀的展示，往往只能以示意圖或活檢染色來觀察[4-5]，成為困擾胰島移植研究者的一個問題。

去細胞支架制備技術(shù)是近年來生物材料領(lǐng)域發(fā)展較為熱門的技術(shù)[6-7]，該技術(shù)可完整保留器官的膠原、結(jié)締組織，保留完整的血管系統(tǒng)，但能去除組織中的細胞。本研究采用大鼠肝臟在體去細胞技術(shù)制備完整的大鼠肝臟去細胞支架，并分離其他大鼠的胰島，經(jīng)DTZ染色后進行門靜脈內(nèi)輸注，模擬大鼠肝內(nèi)胰島移植過程，并在顯微鏡下觀察胰島細胞團在肝內(nèi)的分布位置和相關(guān)栓塞情況，為進一步研究改進胰島在肝內(nèi)移植后的存活和功能發(fā)揮奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物:SD大鼠10只，雌雄不限，體重250～300 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑和實驗器材:十二烷基硫酸鈉(SDS)(蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院，中國)；膠原酶V(Sigma公司，美國)；雙硫腙(上海試劑三廠)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；CMRL1066培養(yǎng)基、Ficoll-1077 和Ficoll-1119(溫州市怡康細胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司，中國)；24 G靜脈留置針(B.Braun Melsungen公司，德國)；Hanks液、PBS自制；其余試劑為分析純。DKZ-450B電熱恒溫振蕩水槽(上海森信實驗儀器有限公司)；離心機(L500，上海利鑫堅離心機有限公司)；蠕動泵(BT600-2J，保定蘭格恒流泵有限公司，中國)；倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-U/B/S-100，NIKON，日本)；體視顯微鏡(SDT-TL2，上海光泉光科儀器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1 大鼠肝臟在體去細胞支架的制備:采用文獻[8]方法并略做改進，將大鼠用異氟烷吸入麻醉后，沿腹白線小心打開腹腔，勿使肝臟破損；打開胸腔，用眼科剪剪開右心耳后對大鼠全身灌注含肝素鈉(20 U/mL)的生理鹽水約500 mL，去除全身血液。分離和結(jié)扎大鼠膽總管、肝動脈，用動脈夾夾閉上腔靜脈；沿門靜脈小心插入靜脈留置針并結(jié)扎固定，開放下腔靜脈。采用0.25%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液為去細胞液，經(jīng)蠕動泵和門靜脈留置針灌注至大鼠肝臟，灌注速度6 r/min，灌注時間約70 min，制備肝臟去細胞支架，再灌注PBS溶液300 mL去除SDS溶液。以HE染色鑒定大鼠肝臟支架是否去細胞完全。

1.2.2 大鼠胰島的分離:結(jié)合本實驗室前期研究基礎(chǔ)[9-10]，SD大鼠持續(xù)異氟烷吸入麻醉，常規(guī)消毒手術(shù)野，從大鼠生殖部位起在腹部開U型形切口，暴露膽總管，在膽總管入十二指腸處用動脈夾閉，開胸破心處死大鼠。于膽總管左右肝管分叉處用24 G套管針插入膽總管，成功后固定和結(jié)扎針頭，逆行胰管灌注膠原酶V溶液8～10 mL(濃度2 mg/mL，Hanks液為溶劑)。迅速將充盈的胰腺組織仔細分離后整塊取下，剪碎后放入預(yù)先加入5 mL膠原酶V溶液(濃度同上)的50 mL離心管中，在(37±0.5)℃恒溫水浴中振搖消化，不斷觀察胰腺組織是否消化至乳糜和泥沙狀。約13～15 min后，加入35 mL 4 ℃ Hanks液中止消化；將組織混合液輕搖混合后離心，當(dāng)速度到達2 000 r/min時停止離心，棄去上清夜，相同方法洗滌組織兩次。在沉淀組織中加入10 mL Ficoll-1119，渦旋混合，上層仔細加入5 mL的Ficoll-1077液，再在上層加入5 mL Hank’s液，2 000 r/min離心5 min。關(guān)閉制動閥，等機器完全停止轉(zhuǎn)動后，將全部上層清夜倒至另一新的50 mL離心管中，即為初步純化后的胰島。Hank’s液洗滌3遍后，組織全部倒至自制的黑底玻璃培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用200 μL移液槍手工挑選；純化得到的胰島用CMRL1066(內(nèi)含10%胎牛血清和青鏈霉素)，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6 h。

1.2.3 胰島的計數(shù)和當(dāng)量(IEQ)計算:將手工挑選純化后的胰島隨培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至底部帶小格子的培養(yǎng)皿中，于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)每格中胰島數(shù)量；胰島當(dāng)量計算參考Lembert等制定的方法[11]，對鏡檢計數(shù)的胰島細胞團分別用標尺測量其直徑，并根據(jù)IEQ表換算為直徑相當(dāng)于150 μmol/L胰島的總IEQ。

1.2.4 胰島的染色和門靜脈輸注

(1)DTZ溶液配制:稱取5 mg DTZ，用1 mL DMSO溶解DTZ，再用Hanks溶液稀釋至20 mL，0.22 μm濾膜過濾后使用，4 ℃避光保存。

(2)胰島的染色及門靜脈輸注:0.5 mL胰島溶液，加2 mL DTZ溶液。將染色后的胰島液用Hank’s液調(diào)整至適當(dāng)濃度，吸收至1 mL注射器針筒中；打開大鼠肝臟去細胞支架的上腔靜脈動脈夾，經(jīng)門靜脈留置針緩慢推注染色后的胰島至去細胞肝臟支架中，輸注的胰島量為(800±250)IEQ，再經(jīng)蠕動泵輸注100 mL PBS去除多余的DTZ溶液。

1.2.5 胰島輸注后在肝內(nèi)分布和栓塞情況的觀察:小心完整取下含胰島細胞團的大鼠肝臟去細胞支架，置于黑色的玻璃皿中，在體視顯微鏡下觀察肝內(nèi)胰島的分布情況；再轉(zhuǎn)移至無色透明的玻璃皿中，在倒置顯微鏡下觀察胰島在肝內(nèi)血管中的栓塞情況。

圖1　大鼠肝臟去細胞支架

圖2　Hoechst 33258染色圖片(×100)

2　結(jié)果

2.1大鼠肝臟去細胞支架的結(jié)果

門靜脈灌注SDS溶液后，肝臟內(nèi)部逐步呈現(xiàn)透明狀態(tài)，無色的SDS通過肝臟后呈淡棕色含肝細胞組織的液體從下腔靜脈流出，約70 min后即可得到完全透明的大鼠在體肝臟去細胞支架(如下圖1A所示)，大鼠肝內(nèi)的主要血管和分支清晰可見。取該去細胞支架組織經(jīng)HE染色(如下圖1B所示)，可見組織中已無正常細胞組織。

2.2大鼠胰島的分離和染色結(jié)果

采用本方法我們得到了純度＞90%的大鼠胰島，胰島細胞團形狀呈圓形、橢圓形和不規(guī)則形，直徑大小在50～450 μm之間，經(jīng)DTZ染色后胰島細胞團呈猩紅色，與前期實驗結(jié)果相似[9-10]。

2.3胰島經(jīng)門靜脈輸注后的結(jié)果

將計數(shù)和DTZ染色后的胰島約600 IEQ經(jīng)門靜脈緩慢輸注至上述肝臟去細胞支架后，得到胰島在肝臟中的分布結(jié)果如下圖2所示。

由圖2A結(jié)果可見，肝內(nèi)血管及血管分支在去細胞支架中清晰可見，被DTZ染成紅色的胰島細胞大部分分布在肝臟邊緣的血管末梢(如圖1A中黑色箭頭所示)，且各葉肝臟中均有胰島細胞分布，少量胰島分布在肝臟近中心小血管或血管末梢中；由圖2B(白色箭頭代表肝臟邊緣)結(jié)果可見，胰島細胞團是緊密栓塞在肝內(nèi)的血管中，尤其在肝臟邊緣的小血管或其分支內(nèi)，有時甚至一條分支血管中有多個胰島細胞團駐留(如圖2C中所示)。

3　討論

胰島細胞團在肝臟內(nèi)的栓塞位置和相關(guān)情況對于我們理解和掌握胰島在肝內(nèi)移植和功能發(fā)揮有重要意義。由本實驗結(jié)果可見，(1)胰島經(jīng)門靜脈輸注后，大部分運行和緊密栓塞至肝臟邊緣小血管或其分支中，被栓塞的血管粗細與進入該血管的胰島細胞團的大小有關(guān)，甚至可能會有多個細胞團栓塞至同一血管中的現(xiàn)象；(2)栓塞的胰島細胞團同時也阻止了血液通過該血管，由此會造成局部血流不暢，對該部分胰島的營養(yǎng)供應(yīng)、細胞存活和對血糖的應(yīng)答功能產(chǎn)生影響，尤其對一條血管中同時栓塞多個胰島時，局部血流不暢可影響內(nèi)部多個胰島細胞團的活性和功能發(fā)揮。由此進一步證實，在經(jīng)門靜脈胰島移植中，除了抗免疫排斥治療外，胰島的純度、輸注的組織量、抗凝治療和促移植物血管的生長，都將對胰島細胞團在肝內(nèi)存活和功能的發(fā)揮產(chǎn)生重要影響[12-15]。

本方法采用大鼠在體肝臟去細胞支架技術(shù)結(jié)合門靜脈胰島輸注，該方法清晰、直觀地再現(xiàn)了胰島細胞團在肝內(nèi)移植過程和分布、栓塞結(jié)果，加深了我們對胰島細胞在肝內(nèi)移植過程的理解，為進一步研究如何改進胰島細胞團在肝內(nèi)移植后的存活和功能發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯:魯翠濤)

作者簡介][第一鄭祥韜(1980-)，男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，博士。

[基金項目]溫州市科技局科技計劃項目(Y20140147)；寧波市科技計劃項目(2013A610270)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃(2015R13011)。

[收稿日期]2015-08-20

[中圖分類號]R318.15

[文獻標識碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.015