龍葵堿對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖和血管形成能力的影響及對(duì)AKT-mTOR通路的調(diào)節(jié)作用

楊嘹嘹，劉樂(lè)偉，謝建亮，陳旭鵬，黃智銘(.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂(lè)清醫(yī)院消化科，浙江樂(lè)清35600；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江溫州35000)

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龍葵堿對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖和血管形成能力的影響及對(duì)AKT-mTOR通路的調(diào)節(jié)作用

楊嘹嘹1，劉樂(lè)偉1，謝建亮1，陳旭鵬1，黃智銘2
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂(lè)清醫(yī)院消化科，浙江樂(lè)清325600；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江溫州325000)

[摘 要]目的 探討龍葵堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1的增殖和血管形成能力的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和藥物組，藥物組分別采用濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L的龍葵堿對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，軟瓊脂克隆試驗(yàn)觀察龍葵堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1非貼壁依賴性增殖能力的影響；脈管形成實(shí)驗(yàn)觀察龍葵堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1血管形成能力的影響；蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)Panc-1細(xì)胞總蛋白中蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)變化。結(jié)果 龍葵堿可明顯抑制Panc-1細(xì)胞非貼壁依賴性增殖能力，且呈劑量依賴性[100% vs (42.1±9.6)%，(24.3±8.5)%，(14.4±1.7)%；P＜0.05]；龍葵堿亦可抑制VEGF蛋白表達(dá)[100% vs (74.9±5.5)%，(31.9±6.8)%，(16.5±7.5)%，P＜0.05]，并且抑制脈管形成[100% vs (82.3±9.5)%，(76.9±8.9)%，(56.0±12.1)%，P＜0.05]；龍葵堿可下調(diào)Panc-1細(xì)胞AKT、mTOR磷酸化蛋白表達(dá)[100% vs (72.4±0.8)%，(59.4±1.3)%，(40.7±2.9)%；100% vs (96.7±0.4)%，(77.5±3.4)%，(34.1±7.6)%，P＜0.05]。結(jié)論 龍葵堿可能通過(guò)抑制AKT-mTOR細(xì)胞信號(hào)通路而抑制Panc-1細(xì)胞的增殖及血管形成能力。

[關(guān)鍵詞]龍葵堿；胰腺癌；增殖；血管形成；AKT-mTOR通路

Effects of Solanine on cell proliferation and angiogenesis of PANC-1 and its regulation on AKT-mTOR pathway YANG Liao-liao1, LIU Le-wei1, XIE Jian-liang1, CHEN Xu-peng1, HUANG Zhi-ming2.1Department of Gastroenterology Yueqing Hospital Af■liated to Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325600, China;2Department of Gastroenterology, the First Af■liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

Abstract ObjectiveTo investigate the effects of Solanine on proliferation and angiogenesis in pancreatic cancer cell line Panc-1 and explore its possible mechanisms.MethodsThe experiment was divided into two groups, Control group and Solanine group.In Solanine group the Panc-1 cells were treated with various concentrations of Solanine (3.5, 7.0 and 10.5 μmol/L).Cell proliferation and angiogenesis were detected with colony assay and tube formation assay.The protein expressions of VEGF (vascular endothelial growth factor), AKT (protein kinase B) -mTOR (target of rapamycin) were evaluated by Western blotting.ResultsSolanine inhibited proliferation of Panc-1 cells in a dose-dependent manner[100% vs (42.1±9.6)%, (24.3±8.5)%, (14.4±1.7)%；P＜0.05], as well as tube formation[100% vs (82.3±9.5)%, (76.9±8.9)%, (56.0±12.1)%； P＜0.05].The proein expression of VEGF was depressed by Solanine[100% vs (74.9±5.5)%, (31.9±6.8)%, (16.5±7.5)%； P＜0.05], decreased phosphorylation of AKT and mTOR were also found[100% vs (72.4±0.8)%, (59.4±1.3)%, (40.7±2.9)%；100% vs (96.7±0.4)%, (77.5±3.4)%, (34.1±7.6)%； P＜0.05].ConclusionThis study indicates that Solanine inhibits proliferation and angiogenesis via AKT-mTOR signaling pathways in Panc-1 cells.

Key words Solanine； pancreatic cancer； proliferation； angiogenesis； AKT-mTOR pathway

胰腺癌是一種惡性程度高、侵襲性強(qiáng)的癌癥，其五年生存率不足5%。由于早期診斷困難、藥物治療耐藥性高，預(yù)后不良，在世界癌癥死亡率中排名第4位[1]，在中國(guó)排名第6位[2]。手術(shù)治療是胰腺癌的主要手段，但存在術(shù)后并發(fā)癥重、生存期短的難題。目前，中草藥抗腫瘤藥物是腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新突破口。龍葵堿(solanine)又名茄堿，是馬鈴薯中一種主要的甾體類生物堿[3]。龍葵堿在抑制人肝癌(HepG2)、胃癌(AGS)等細(xì)胞的增殖已有報(bào)道[4]。本研究主要通過(guò)應(yīng)用龍葵堿體外處理胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1，觀察其對(duì)Panc-1增殖能力及血管形成的影響，AKT-mTOR通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中被廣泛研究的熱門(mén)通路，該通路在腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，本文中將探討AKT-mTOR通路對(duì)Panc-1增殖能力及血管形成的相關(guān)影響作用。

圖1　不同濃度龍葵堿處理后Panc-1的非貼壁依賴性增殖表現(xiàn)(×400)

1　材料和方法

1.1藥品和試劑

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；龍葵堿購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，用二甲亞砜(DMSO，Sigma)溶解至50 μg·mL-1，用培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM為Gibco公司產(chǎn)品；軟瓊脂克隆試劑盒購(gòu)自GENMED(美國(guó))；血管形成模型微板購(gòu)自IBIDI(德國(guó))；AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、VEGF等兔抗購(gòu)自ABCAM(美國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自bioworld公司(美國(guó))；其余試劑均有為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2分組

人胰腺癌細(xì)胞Panc-1用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究，分為對(duì)照組(不用藥物處理)和藥物組(加入龍葵堿，使終濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞軟瓊脂克隆試驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖能力:快速移入1.5 mL瓊脂(每個(gè)1.5 mL)到12孔板孔里，冷卻至固體后，每孔加入1.5 mL含有2 500個(gè)細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)液，室溫冷卻至凝固，然后每孔再加入500 μL含不同濃度龍葵堿的培養(yǎng)基，放進(jìn)37 ℃培養(yǎng)箱。2周后，觀察待測(cè)細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小等。1.3.2 脈管形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞血管形成能力:用50 mg/L Matrigel 1:8稀釋液10 μL包被ibidi血管形成模型微板，置于37℃培養(yǎng)箱2 h。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(不用藥物處理)和藥物組(加入龍葵堿使終濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L)，藥物處理PANC-1胰腺癌細(xì)胞24 h后收集各組上清液離心備用。制備臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液50 μL加入微板各個(gè)孔中，每組5個(gè)平行孔。置于37 ℃培養(yǎng)箱4 h。觀察脈管成環(huán)數(shù)，計(jì)算成環(huán)長(zhǎng)度。1.3.3 Western blotting檢測(cè)目的蛋白表達(dá):細(xì)胞經(jīng)不同濃度龍葵堿處理后，冷PBS洗3次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、VEGF等抗體(1:1 000)4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌后與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床1 h，ECL顯色。用quantity one軟件分析灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1軟瓊脂克隆法觀察龍葵堿對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比，3.5、7和10.5 μmol/L龍葵堿組細(xì)胞集落數(shù)目及大小均減少[100% vs (42.1±9.6)%，(24.3±8.5)%，(14.4±1.7)%；P＜0.05]。見(jiàn)圖1。

2.2龍葵堿對(duì)Panc-1血管形成能力的影響

我們發(fā)現(xiàn)用培養(yǎng)過(guò)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的培養(yǎng)液處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，可以促進(jìn)其脈管的形成，而用龍葵堿處理的PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液可以抑制HUVEC的脈管形成，且呈劑量依賴性。同時(shí)，龍葵堿可以抑制PANC-1細(xì)胞促血管形成因子VEGF的表達(dá)，且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖2和表1。

圖2　龍葵堿對(duì)脈管形成及VEGF蛋白表達(dá)影響

圖3　龍葵堿對(duì)p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)影響

表1　Panc-1細(xì)胞脈管長(zhǎng)度百分率及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)值

表2　p-AKT、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)率(%)

2.3龍葵堿對(duì)AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，龍葵堿可抑制AKT、mTOR蛋白的磷酸化表達(dá)，細(xì)胞總蛋白中藥物組p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)圖3和表2。

3　討論

龍葵堿又稱茄堿，是一種茄科植物產(chǎn)生的甾體生物堿，如馬鈴薯、番茄及茄子等[5]。龍葵堿被證明在Jurkat細(xì)胞和LPS刺激的原始巨噬細(xì)胞中能減少細(xì)胞因子和一氧化氮產(chǎn)生[6]，也可以通過(guò)抑制MAPK通路傳導(dǎo)而減少小鼠腹腔巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的產(chǎn)生[7]。最近的研究表明，龍葵堿有抗腫瘤功效，如抑制癌細(xì)胞系的增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，減少胃癌細(xì)胞系p53的突變[4，8-9]。本研究中，我們通過(guò)軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)觀察到龍葵堿對(duì)Panc-1細(xì)胞非貼壁依賴性增殖的抑制作用，且呈劑量依賴性[100% vs (42.1±9.6)%，(24.3±8.5)%，(14.4±1.7)%；P＜0.05]。

血管生成是腫瘤的起始、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵部分。多種促血管生成因子的分泌，如PDGF，bFGF，eNOS 和VEGF這些已被確認(rèn)為最重要促血管生成因素[10]，是血管生成的初始步驟。VEGF的下調(diào)表達(dá)可以減緩Panc-1裸鼠移植瘤的增長(zhǎng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，龍葵堿明顯減少HUVEC脈管的形成[100% vs(82.3±9.5)%，(76.9±8.9)%，(56.0±12.1)%，P＜0.05]，脈管形成是最初的血管生成的事件之一。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在龍葵堿處理PANC-1細(xì)胞后，VEGF的表達(dá)下降[100% vs(74.9±5.5)%，(31.9±6.8)%，(16.5±7.5)%，P ＜0.05]。因此，我們猜測(cè)，龍葵堿通過(guò)抑制VEGF表達(dá)抑制腫瘤血管生成。

PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程如細(xì)胞增殖、凋亡、血管形成等方面其關(guān)鍵作用。最近研究證實(shí)，AKT-mTOR通路對(duì)胰腺腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用[12-13]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于蛋白激酶C激酶超家族。研究認(rèn)為，AKT 308位點(diǎn)蘇氨酸被PI3K-PDK1磷酸化，進(jìn)一步引起473位點(diǎn)絲氨酸的自主磷酸化。這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)別磷酸化是AKT激活的必要條件?；罨腁KT可以直接磷酸化其底物mTOR，亦可使結(jié)節(jié)性硬性復(fù)合物1/2(TSC1/2)失活，解除其對(duì)Rheb(一種Ras相關(guān)的小GTP酶)的抑制，激活mTOR。mTOR是一個(gè)重要的絲蘇氨酸蛋白激酶，是AKT的重要底物之一。在外界刺激條件下，mTOR可激活下游靶蛋白pS6K(ribosomal S6-kinase，RSK)和4E-BP1(eukaryotic initiation factor 4E-binding protein)。它們都可激活蛋白質(zhì)的翻譯合成，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝。最近研究表明，PI3K-AKT-mTOR的過(guò)度活化引起細(xì)胞過(guò)度增殖、細(xì)胞抗凋亡、促血管形成及細(xì)胞分化異常[14-16]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該信號(hào)通路是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，龍葵堿可以明顯下調(diào)Panc-1蛋白中AKT、mTOR的磷酸化表達(dá)水平[100% vs (72.4±0.8)%，(59.4±1.3)%，(40.7±2.9)%；100% vs (96.7±0.4)%，(77.5±3.4)%，(34.1±7.6)%，P ＜0.05]，提示龍葵堿可能通過(guò)抑制AKT-mTOR信號(hào)通路的異常激活，阻斷下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，抑制VEGF表達(dá)，發(fā)揮其抗腫瘤增殖能力及血管形成能力。

總之，龍葵堿作為一種生物堿，其抗腫瘤功效不可輕視，然其生物毒性亦不容忽視，協(xié)調(diào)好兩者關(guān)系以及后續(xù)藥動(dòng)學(xué)研究是以后藥物開(kāi)發(fā)的一大關(guān)鍵。同時(shí)，龍葵堿在胰腺腫瘤發(fā)展過(guò)程中更具體的分子調(diào)控亟待進(jìn)一步研究，以發(fā)現(xiàn)其在分子靶向治療這一當(dāng)前研究熱點(diǎn)中是否具有功效。

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(本文編輯:張和)

·論著 基礎(chǔ)研究·

[通訊作者簡(jiǎn)介]黃智銘，主任醫(yī)師，E-mail:wyyhzhiming@126.com。

作者簡(jiǎn)介][第一楊嘹嘹(1984-)，男，浙江樂(lè)清人，主治醫(yī)師。

[收稿日期]2015-06-30

[中圖分類號(hào)]R329.2+6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.014