阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織中自噬及血管新生的影響*

王金蘭，樂　婷，閆瑩瑩，劉海燕

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州450014

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阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織中自噬及血管新生的影響*

王金蘭，樂婷#，閆瑩瑩，劉海燕

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州450014

關(guān)鍵詞阿托伐他??；局灶性腦缺血；大鼠；自噬；肌醇酶1；LC3-Ⅱ；血管新生

摘要目的：觀察阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織中自噬及血管新生的影響。方法：雄性SD大鼠63只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、他汀組，每組21只。模型組和他汀組采用大腦中動脈栓塞法造模，假手術(shù)組不栓塞。術(shù)前1周，他汀組給予阿托伐他汀鈣片4 mg/(kg·d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后24 h處死大鼠，TTC染色觀察腦梗死面積，免疫組化法檢測腦組織中CD105、IRE1的表達(dá)，RT-PCR檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF) mRNA， Western blot法檢測自噬蛋白LC3-Ⅱ。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組及他汀組腦組織皮層及皮層下有明顯梗死灶，缺血半暗帶區(qū)CD105、IRE1、VEGF mRNA、LC3-Ⅱ表達(dá)升高(P<0.05)；他汀組上述變化較模型組更顯著(P<0.05)。模型組、他汀組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ表達(dá)有明顯線性正相關(guān)關(guān)系(r=0.837、0.850，P均<0.05)。結(jié)論：阿托伐他汀可通過增強自噬，促進(jìn)局灶性腦缺血血管新生。

AbstractAim: To observe the effect of atorvastatin on autophagy and angiogenesis in brain tissue of focal cerebral ischemia rats.Methods: A total of 63 male SD rats were randomly allocated into sham operation group, model group and treatment group, and each group contained 21 rats.One week before surgery, the treatment group received a gavage of atorvastatin at 4 mg/(kg·d), and the other 2 groups were given the same amount of normal saline. All rats were killed 24 h after operation. The area of cerebral infarction was measured by TTC staining. The expressions of CD105 and IRE1 protein in brain tissue were detected by immunohistochemistry. The expression of VEGF mRNA was detected by RT-PCR. The expression of LC3-Ⅱprotein was detected by Western blot.Results: Compared with those of sham operation group, the cortex and subcortical brain tissue of model group and treatment group showed obvious infarction.The expressions of CD105,IRE1,VEGF mRNA and LC3-Ⅱ in ischemic penumbra area in model group and treatment group were higher. Compared with those of the model group,the indexes mentioned above in treatment group were much higher(P<0.05). In model group and treatment group, the expression of LC3-Ⅱ and that of VEGF mRNA had positive linear relationship (r=0.837,0.850,P<0.05).Conclusion: Atorvastatin can promote angiogenesis in focal cerebral ischemia tissue by enhancing autophagy.

治療缺血性腦卒中的第一要務(wù)是盡早恢復(fù)缺血區(qū)血供，搶救缺血半暗帶,但對于錯過溶栓窗口期及其他原因不適合溶栓的患者，恢復(fù)缺血區(qū)血供主要依靠缺血組織的代償性血管新生。自噬(autophagy)是一種利用溶酶體將胞內(nèi)已衰老、過剩或嚴(yán)重受損的生物大分子(如蛋白質(zhì))及細(xì)胞器清除、降解和回收利用的過程。研究[1]表明3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(他汀)可通過上調(diào)NO水平促進(jìn)血管新生。在缺血心肌細(xì)胞、癌細(xì)胞、結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞、冠狀動脈管壁肌細(xì)胞中，他汀類藥物與自噬的關(guān)系復(fù)雜[2-5]；而無論是在整體水平還是在細(xì)胞水平，自噬均參與了缺血后血管新生的過程[6]。而他汀類藥物對缺血后腦組織內(nèi)血管新生有何影響，其是否可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、增強自噬起作用而促血管新生，目前尚不清楚。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞最具特異性的生長因子，在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)血管新生；CD105是新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，常用于測定微血管密度。肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)是哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上感應(yīng)和傳遞未折疊蛋白反應(yīng)的感應(yīng)蛋白之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后可通過IRE1信號通路調(diào)節(jié)自噬，所以IRE1可反映體內(nèi)自噬激活水平；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)可與自噬體膜結(jié)合，LC3-Ⅱ水平可反映自噬體的數(shù)量[7]。作者擬觀察阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織IRE1、LC3-Ⅱ表達(dá)及血管新生的影響，探討他汀類藥物、自噬與血管新生的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑雄性SD大鼠63只，體重(300±20) g，購自河南省實驗動物中心，合格證號SCXK(豫)2010-0002。兔抗鼠CD105抗體、兔抗鼠IRE1抗體、兔抗鼠LC3-Ⅱ抗體、羊抗兔SP二抗試劑盒、羊抗兔IgG抗體均購自美國Santa Cruz公司， RT-PCR試劑盒、Trans DNA Marker Ⅰ購自北京Transgene公司。阿托伐他汀鈣片由北京嘉林藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號H19990258。

1.2實驗分組及模型建立方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、他汀組，每組21只。采用大腦中動脈栓塞法制備局灶性腦缺血模型。大鼠經(jīng)水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部備皮、消毒，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉CCA及ICA，剪斷ECA，沿ECA殘端向ICA插入魚線，進(jìn)入長度達(dá)17.5～18.5 mm時，可感阻力，停止插線，ECA殘端結(jié)扎并固定魚線。清理切口，逐層縫合。術(shù)后白熾燈直接照射，保持肛溫在37 ℃。模型組和他汀組按上述方法造模。假手術(shù)組只分離，不結(jié)扎，不插線。術(shù)前1周，他汀組給予阿托伐他汀4 mg/(kg·d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3標(biāo)本采集及保存所有大鼠術(shù)后24 h處死。每組隨機(jī)選取1只用于紅四氮唑(TTC)染色。隨機(jī)選取10只大鼠，經(jīng)心臟灌注多聚甲醛后取腦，多聚甲醛固定24 h后，選取視交叉后6 mm組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。參考文獻(xiàn)[8]的方法，在距額葉前端3 mm和9 mm處進(jìn)行冠狀切片；取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫右側(cè)約2 mm處，從上至下切去右側(cè)半球的正中結(jié)構(gòu)，余下的左側(cè)腦塊再沿矢狀切面旁開2 mm處、并與矢狀切面呈30°斜切，其中外側(cè)皮層為缺血核心區(qū)，內(nèi)側(cè)皮層為缺血半暗區(qū)，常規(guī)制備石蠟切片，厚度5 μm。其余10只斷頭處死、新鮮取腦，選取左側(cè)大腦半球視交叉后6 mm組織液氮迅速冷凍，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.4TTC染色斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，將大腦從前向后冠狀切5刀分為6片，TTC染色。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1腦組織CD105和IRE1蛋白的檢測采用免疫組化SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，高壓抗原修復(fù)5 min，自然冷卻，滴加體積分?jǐn)?shù)8%山羊血清封閉，加兔抗鼠CD105多克隆一抗(130稀釋)50 μL，室溫下孵育60 min；加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1100稀釋)50 μL/片，室溫孵育60 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明及封片。100倍鏡下選取5個不重復(fù)視野，400倍鏡下進(jìn)行平均光密度(LOD)測定。同樣方法檢測IRE1蛋白，一抗1150稀釋，二抗1100稀釋。

1.5.2腦組織VEGF mRNA的檢測采用RT-PCR法。Trizol一步法提取總RNA，用紫外分光光度計定量，取少量進(jìn)行RNA含量及純度測定?？俁NA用RNase H處理后，進(jìn)行cDNA 的合成及PCR反應(yīng)。VEGF引物序列為5’-GCTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3’和5’-CACGCACTCCAGGGCTTCAT-3’，GAPDH引物序列為5’-AAGTTCAACGGCACAGT CAA-3’和5’-CGCCACAGCTTTCCAGAGGG-3’。PCR共進(jìn)行35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min)，72 ℃總延伸6 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外線投射儀下拍照，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，目的基因mRNA的表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.5.3腦組織LC3-Ⅱ蛋白的檢測采用Western blot法。把左側(cè)大腦半球視交叉后6 mm新鮮組織剪切成小塊，按5～10 μL/mg加入蛋白裂解液，14 000 r/min離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，每孔上樣30 μL，樣品分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，100 V恒壓80 min，硝酸纖維素封閉。按11 000稀釋兔抗鼠LC3-Ⅱ一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，按14 000稀釋羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育45 min，TBS洗膜、蒸餾水漂洗后，ECL顯影，暗室壓片。以GAPDH為內(nèi)對照。將膠片掃描后用Bandscan 5.0進(jìn)行灰度分析。目的蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法,計量資料相關(guān)分析采用Pearson積矩相關(guān)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1TTC染色假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死灶，呈均勻一致紅色；模型組和他汀組大鼠左側(cè)大腦半球皮層和皮層下可見明顯白色梗死灶，右側(cè)大腦半球腦組織正常呈紅色，且他汀組各層面梗死面積均小于模型組，見圖1。

2.23組腦組織CD105和IRE1蛋白的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果見圖2。假手術(shù)組可見少量散在的CD105陽性細(xì)胞，呈棕黃色；極少量IRE1陽性細(xì)胞。模型組可見中等量CD105陽性細(xì)胞，且可見少量新生血管，呈管腔樣；IRE1陽性細(xì)胞增多。他汀組可見大量CD105陽性細(xì)胞，且管腔樣新生血管增多；可見大量IRE1陽性細(xì)胞。他汀組、模型組CD105和IRE1蛋白表達(dá)較假手術(shù)組升高，他汀組較模型組升高(表1)。

2.33組腦組織VEGF mRNA和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)見圖3、圖4和表2。他汀組、模型組腦組織VEGF mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較假手術(shù)組升高，他汀組較模型組升高。

1:假手術(shù)組 2:模型組 3:他汀組。圖1　腦組織TTC染色

2.43組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的相關(guān)分析假手術(shù)組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)不存在線性相關(guān)(r=-0.263,P=0.462),而模型組和他汀組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)之間存在線性正相關(guān)(r=0.837,P=0.003；r=0.850,P=0.002)。

表1　3組間CD105和IRE1蛋白表達(dá)的比較

*:與假手術(shù)組比較，P<0.05；#:與模型組比較，P<0.05。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:他汀組。圖2　3組腦組織CD105(1)和IRE1(2)蛋白表達(dá)(SP,×400)

1:假手術(shù)組;2:模型組;3:他汀組。圖3　3組腦組織VEGF mRNA的表達(dá)

1:假手術(shù)組;2:模型組;3:他汀組。圖4　3組腦組織LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

表2　3組腦組織

*:與假手術(shù)組比較，P<0.05；#:與模型組比較，P<0.05。

3討論

近年來研究[7]表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且主要通過IRE1通路，同時自噬也可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強，但過度的自噬同樣可以導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡。LC3是自噬標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平可反映自噬體的數(shù)量。

該研究結(jié)果顯示：模型組腦組織中CD105及VEGF mRNA表達(dá)較假手術(shù)組增加，說明局灶性腦缺血后缺血半暗帶區(qū)存在血管新生現(xiàn)象，這與以往學(xué)者研究[8]結(jié)論相吻合。他汀組腦組織中CD105及VEGF mRNA表達(dá)較模型組增加，說明阿托伐他汀通過上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)了缺血半暗帶區(qū)的血管新生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腦組織中僅少量表達(dá)IRE1和LC3-Ⅱ,模型組IRE1和LC3-Ⅱ的表達(dá)高于假手術(shù)組，說明腦缺血可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬；他汀組腦組織中IRE1和LC3-Ⅱ表達(dá)高于模型組，說明阿托伐他汀可增強腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬效應(yīng)。 作者還發(fā)現(xiàn)，在模型組和他汀組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ的表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，提示血管新生與自噬有關(guān)。

該研究中阿托伐他汀上調(diào)自噬的現(xiàn)象與張圣雪等[9]研究結(jié)果相悖，后者認(rèn)為阿托伐他汀通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬,從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。也有研究[2]認(rèn)為他汀可以抑制腫瘤組織的轉(zhuǎn)移，此效應(yīng)與其增強自噬有關(guān)。而Sabe等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在患有代謝綜合征的奧斯薩巴豬體內(nèi)，阿托伐他汀可促進(jìn)非缺血區(qū)心肌細(xì)胞自噬，抑制缺血區(qū)心肌細(xì)胞自噬。以往研究對他汀和自噬關(guān)系的看法不盡相同，但都未明確損傷因素作用時間，也就是自噬發(fā)生時間。自噬是一把雙刃劍，一方面可維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，另一方面則可導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡，而利弊的關(guān)鍵取決于自噬的發(fā)生時間。有研究[10]表明損傷因素作用后24 h內(nèi)，自噬多為保護(hù)性因素，而24 h以后，自噬則轉(zhuǎn)化為損傷性因素，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。張圣雪等用Hanks液替代培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，盡管時間在24 h之內(nèi)，但其細(xì)胞直接暴露于無培養(yǎng)液的Hanks液中，短時間內(nèi)足以導(dǎo)致自噬性死亡。而此次研究是在整體水平上的研究，機(jī)體可有一定代償機(jī)制，所以并不能否認(rèn)阿托伐他汀可通過IRE1途徑上調(diào)自噬蛋白LC3-Ⅱ，進(jìn)而促進(jìn)局灶性腦缺血組織血管新生。

綜上所述，作者認(rèn)為阿托伐他汀可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中IRE1通路上調(diào)自噬，促進(jìn)血管新生。但該研究僅對VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白做了相關(guān)分析，對于判定二者的因果關(guān)系仍有不足，可以在今后研究中給予相應(yīng)激活劑和阻滯劑，進(jìn)一步明確阿托伐他汀促進(jìn)血管新生的機(jī)制。

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*鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)基金資助(2015年)

Effect of atorvastatin on autophagy and angiogenesis in brain tissue of focal cerebral ischemia rats

WANGJinlan，YUETing,YANYingying,LIUHaiyan

DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordsatorvastatin;focal cerebral ischemia;rat;autophagy;inositol-requiring enzyme 1;LC3-Ⅱ;angiogenesis

中圖分類號R743

通信作者#，女，1987年2月生，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病，E-mail:563556741@qq.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.030