sirt2基因高表達對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的抑制作用*

馬珊珊，崔淵博，姚　寧，邢　衢，韓　康，宋及時，張彥婷，關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450007　3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州450052

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sirt2基因高表達對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的抑制作用*

馬珊珊1)，崔淵博2)，姚寧1)，邢衢1)，韓康1)，宋及時1)，張彥婷1)，關(guān)方霞1,3)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 鄭州 4500073)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州450052

關(guān)鍵詞sirt2；腺病毒；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；衰老

摘要目的：觀察sirt2基因高表達對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)衰老的影響。方法：擴增人sirt2 ORF序列，利用腺病毒載體構(gòu)建sirt2基因高表達的重組腺病毒(pAd-sirt2)，空斑法測定病毒滴度；感染hUC-MSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況；實驗分為P3組(第3代hUC-MSCs)、P15組(第15代hUC-MSCs)和感染組(用pAd-sirt2腺病毒感染第15代hUC-MSCs)，CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化，β-半乳糖苷酶染色后檢測陽性細(xì)胞率。結(jié)果：成功制備pAd-sirt2重組腺病毒，病毒滴度為1.8×1011pfu/L；熒光觀察證實Sirt2蛋白在hUC-MSCs中有效表達；與P15組相比，sirt2高表達可促進hUC-MSCs增殖，并將細(xì)胞周期阻滯在S期，β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率降低(P均<0.05)。結(jié)論：sirt2基因高表達可促進hUC-MSCs增殖，延長細(xì)胞周期，并有效抑制hUC-MSCs的衰老。

AbstractAim: To construct a recombinant adenovirus containing sirt2 gene and to explore the impact of sirt2 overexpression on the aging of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs). Methods: Human sirt2 ORF was generated by RT-PCR and the recombinant adenovirus(pAd-sirt2) was constructed.The viral titer was determined by air-dilution method.After being transfected into hUC-MSCs, the green fluorescence was observed under fluorescence microscope. hUC-MSCs were allocated into P3 group(P3 hUC-MSCs), P15 group(P15 hUC-MSCs) and transfected group(transfected hUC-MSCs by pAd-sirt2). CCK-8 assay was performed to detect the proliferation of hUC-MSCs and flow cytometry, to analyze the cell cycle. SA-β-Gal was used to detect the cell senescence. Results: The recombinant adenovirus was constructed and the titer was 1.8×1011pfu/L. After infection by pAd-sirt2, P15 hUC-MSCs expressed green fluorescence protein clearly under the fluorescence microscope. Compared with P15 group, sirt2 overexpression could promote the cell proliferation, induced more cells at S phase,and decrease the positive rate of SA-β-Gal(P<0.05). Conclusion: sirt2 overexpression could promote hUC-MSCs proliferation,extend cell cycle,and inhibit cell senescence.

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有自我更新和多向分化潛能，為脊髓損傷、腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來希望[1-2]。但是體外培養(yǎng)的hUC-MSCs同正常細(xì)胞一樣，也會呈現(xiàn)衰老變化，從而限制干細(xì)胞的使用[3]。研究發(fā)現(xiàn)sirt2參與調(diào)控微管蛋白、P53、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的乙?；痆4-5]，進而延緩細(xì)胞和機體的衰老[6]。但是sirt2在干細(xì)胞衰老中的作用和機制還不清楚。課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)衰老的hUC-MSCs中sirt2的表達降低。因此，該實驗構(gòu)建含有人sirt2基因的重組腺病毒，觀察sirt2高表達對hUC-MSCs增殖和細(xì)胞周期的影響，初步探討sirt2對hUC-MSCs的抗衰老作用。

1材料與方法

1.1材料和試劑CCK-8、β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；引物設(shè)計和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。hUC-MSCs為作者所在的實驗室前期分離、鑒定和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。

1.3重組腺病毒的擴增吸取5 μL包裝好的腺病毒，感染80%融合的HEK293 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng) 3～5 d，當(dāng) HEK293細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時，收集細(xì)胞，于液氮、37 ℃反復(fù)凍融4次，每次10～15 min，12 000 r/min離心1 min后取上清，即得到在HEK293細(xì)胞中擴增的腺病毒，反復(fù)感染HEK293細(xì)胞即可獲得大量腺病毒。

1.4重組腺病毒的滴度測定采用空斑法測定病毒滴度。pAd-sirt2腺病毒原液用DMEM/高糖培養(yǎng)基以10倍梯度依次稀釋，取20 μL各濃度病毒感染80%融合的HEK293細(xì)胞，每組3個復(fù)孔，使病毒稀釋液與細(xì)胞充分接觸，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入1 mL瓊脂培養(yǎng)基使其均勻覆蓋細(xì)胞，待瓊脂培養(yǎng)基凝固后將板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育；每天定時觀察各孔中空斑形成情況并計數(shù)1次，待空斑數(shù)目穩(wěn)定不變(7～10 d)時停止；根據(jù)發(fā)生細(xì)胞完全病變的孔中的細(xì)胞數(shù)量計算腺病毒滴度。

1.5pAd-sirt2感染hUC-MSCs取第15代hUC-MSCs，用MOI為10 的pAd-sirt2感染第15代hUC-MSCs作為感染組，以正常培養(yǎng)的第15代hUC-MSCs為對照組(P15組)，每組3個復(fù)孔。將2組細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化和熒光表達情況。

1.6Western blot檢測Sirt2蛋白的表達收集上述感染組和P15組細(xì)胞，用RAPI裂解獲得總蛋白，BCA法測量蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后切取目的蛋白條帶，以200 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h后于50 g/L脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，Sirt2一抗(11 000稀釋)、內(nèi)參β-actin一抗(1500稀釋)4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次,每次15 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影成像。

1.7CCK-8法檢測pAd-sirt2對hUC-MSCs增殖的影響實驗分為3組，分別為P3組(正常培養(yǎng)的第3代hUC-MSCs)、P15組(正常培養(yǎng)的第15代hUC-MSCs)和感染組(pAd-sirt2感染第15代hUC-MSCs)，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔各接種約2 500個細(xì)胞，每組3個復(fù)孔。分別于第1、2、3、4、5天避光下每孔加10 μL CCK-8溶液并繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值，繪制各組細(xì)胞的生長曲線。

1.8PI染色法檢測pAd-sirt2對hUC-MSCs細(xì)胞周期的影響細(xì)胞分組及處理同1.7。取1 mL、2×106mL-1的各組細(xì)胞懸液，離心去上清，PBS清洗后加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定過夜。預(yù)冷PBS清洗加入0.5 mL PI染色液,37 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.9衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞分組及處理同1.7。棄各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，4 ℃固定30 min；PBS洗滌3次后每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育過夜。100倍鏡下選取5個視野觀察藍(lán)染細(xì)胞，即陽性的衰老細(xì)胞，并計算陽性細(xì)胞率。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1重組腺病毒pAd-sirt2的構(gòu)建所提的RNA具有清晰的28S和18S條帶，滿足實驗要求(圖1左)。RT-PCR擴增出大小為1 200 bp的特異性條帶(圖1中)，測序驗證為人sirt2 ORF序列。pAdTrack-CMV-sirt2質(zhì)粒與pAdEasy1在BJ5183菌體內(nèi)同源重組后，PacⅠ酶切得到1條大于23 000 bp的片段和1條4 500 bp的片段(圖1右)。

左：P3組和P15組hUC-MSCs總RNA提取結(jié)果;中:RT-PCR擴增人sirt2 ORF序列;右:pAd-sirt2質(zhì)粒電泳圖。M：Marker；1：pAd-sirt2同源重組質(zhì)粒；2：PacⅠ酶切重組質(zhì)粒。 圖1　重組腺病毒pAd-sirt2的構(gòu)建

2.2pAd-sirt2的滴度測定結(jié)果見圖2。利用空斑法測定pAd-sirt2的滴度為1.8×1011pfu/L。

A：正常培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞；B:轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察；C：轉(zhuǎn)染48 h后。圖2　pAd-sirt2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(×100)

2.3pAd-sirt2感染hUC-MSCs結(jié)果見圖3，說明pAd-sirt2腺病毒已經(jīng)進入hUC-MSCs并在細(xì)胞中成功表達。

A：感染組可見光下觀察結(jié)果(×100)；B：感染組熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(×100)；C：Western blot檢測Sirt2蛋白的表達。圖3　pAd-sirt2感染hUC-MSCs 48 h后檢測結(jié)果

2.4pAd-sirt2對hUC-MSCs增殖的影響結(jié)果見圖4。

圖4　各組細(xì)胞生長曲線

2.5hUC-MSCs感染pAd-sirt2后細(xì)胞周期的變化結(jié)果見表1。由表1可知，pAd-sirt2感染hUC-MSCs后將細(xì)胞周期阻滯在S期。

2.6各組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色結(jié)果見圖5、表2。

表1　各組細(xì)胞周期的變化　%

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

A:P3組；B:P15組；C：感染組。圖5　各組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色結(jié)果(×100)

表2　各組細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率比較　%

F=913.570，P<0.001；*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

3討論

干細(xì)胞衰老學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)外的干細(xì)胞隨著傳代次數(shù)或者年齡的增加，其增殖和分化能力降低，相關(guān)基因表達發(fā)生改變[8-9]，呈現(xiàn)衰老特征。Sirt2 是哺乳動物沉默信息調(diào)節(jié)因子家族成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞周期、衰老等過程。實驗室前期研究[7]發(fā)現(xiàn)sirt2與hUC-MSCs的衰老有關(guān)。因此，該研究采用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建pAd-sirt2重組腺病毒，研究sirt2高表達對hUC-MSCs衰老的影響。與普通質(zhì)粒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，腺病毒載體通過包裝腺病毒以感染的方式實現(xiàn)轉(zhuǎn)染，具有自帶熒光標(biāo)簽方便檢測、重組效率高、宿主范圍廣泛、轉(zhuǎn)染效率高等特點[10]。pAd-sirt2感染P15 hUC-MSCs 48 h后即可觀察到明顯的熒光，且Sirt2蛋白表達明顯升高，說明腺病毒感染hUC-MSCs的效率非常高。另外作者發(fā)現(xiàn)，pAd-sirt2能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在S期，延長細(xì)胞分裂期，促進增殖，衰老特異的β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率明顯降低。該結(jié)果與以往研究[11-12]發(fā)現(xiàn)的sirt2激活細(xì)胞周期檢測點激酶進而延長壽命的結(jié)果具有一致性。

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)sirt2高表達可以抑制hUC-MSCs的衰老，為進一步探索細(xì)胞衰老的機制和尋求有效延緩干細(xì)胞衰老的方法及途徑奠定了基礎(chǔ)。

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*國家自然科學(xué)基金資助項目U1404313，81471306；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊基金資助項目15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計劃基金

資助項目154200510008

Inhibition of sirt2 overexpression on aging of human umbilical cord mesenchymal stem cells

MAShanshan1),CUIYuanbo2),YAONing1),XINGQu1),HANKang1),SONGJishi1),ZHANGYanting1),GUANFangxia1,3)

1)StemCellLaboratory,CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)TranslationalMedicineCenter,theAffiliatedZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007

3)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordssirt2;adenovirus;human umbilical cord mesenchymal stem cell;aging

中圖分類號Q291

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫(yī)學(xué)，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.003