GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的影響

王曉紅，宋林林，李亮亮，袁傳奇，姜　博，周恩民*，穆　楊*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)陜西省科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，楊凌 712100)

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GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的影響

王曉紅1，2，宋林林1，2，李亮亮1，2，袁傳奇1，2，姜博1，2，周恩民1，2*，穆楊1，2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)陜西省科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，楊凌 712100)

摘要：為探討豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5的第二胞外區(qū)在病毒復(fù)制中的作用及機(jī)制，利用PiggyBac Transposon System Vectors構(gòu)建了表達(dá)刪除84—119氨基酸殘基的截短型GP5的重組質(zhì)粒(pPB-GP5Δ84-119)，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞通過(guò)嘌呤霉素抗性篩選和3次亞克隆，篩選穩(wěn)定表達(dá)GP5Δ84-119的Marc-145細(xì)胞系，并利用cck-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；用PRRSV SD16株感染篩選的細(xì)胞，通過(guò)病毒基因拷貝數(shù)和病毒滴度檢測(cè)GP5Δ84-119表達(dá)對(duì)PRRSV復(fù)制影響；通過(guò)Real-time PCR和ELISA檢測(cè)病毒感染前后細(xì)胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表達(dá)情況。經(jīng)RT-PCR、Western blot和IFA檢測(cè)，GP5Δ84-119在Marc-145細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)，將此細(xì)胞命名為Marc-145-GP5Δ84-119；細(xì)胞增殖曲線顯示GP5Δ84-119的表達(dá)不影響細(xì)胞的增殖；對(duì)病毒基因拷貝數(shù)和病毒滴度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GP5Δ84-119的表達(dá)可以抑制PRRSV的復(fù)制，這種抑制作用可能是通過(guò)上調(diào)IFN特別是IFN-β的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。研究表明GP5第二胞外區(qū)在PRRSV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；GP5Δ84-119；穩(wěn)定表達(dá)；復(fù)制；干擾素

The Effect of GP5Δ84-119Stable Expression on the Replication of

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又名豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)感染所致的一種高度接觸性傳染病。該病以繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染為主要特征，是當(dāng)今世界對(duì)養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)影響最重要的疾病之一。PRRS于1987年首先在北美洲被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，隨后該病在加拿大、德國(guó)、荷蘭等國(guó)家及地區(qū)相繼暴發(fā)，目前已呈全球性分布。S.J.Tousignant等對(duì)2009—2013年4 年間美國(guó)14 個(gè)豬場(chǎng)371個(gè)豬群PRRS發(fā)病率和時(shí)空動(dòng)態(tài)分析顯示，PRRSV在美國(guó)的危害仍持續(xù)存在[1]。1996年郭寶清等首次分離到PRRSV中國(guó)株CH-1a[2]。之后該病在我國(guó)的流行和分布日益廣泛，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，特別是2006年主要由高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)變異株引起的高致病性PRRS (HP-PRRS)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的打擊幾乎是毀滅性的[3-6]。鑒于該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的巨大危害，農(nóng)業(yè)部現(xiàn)已將其列為一類動(dòng)物疫病。由于PRRSV的嗜巨噬細(xì)胞性、抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody-dependent effect，ADE)和持續(xù)性感染等特征，目前對(duì)該病的致病機(jī)制和免疫機(jī)制仍不完全清楚，現(xiàn)有疫苗防控PRRSV感染的效果也不理想。

PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒基因組長(zhǎng)度約為15 kb，由9個(gè)相互重疊的開放閱讀框(open reading frame，ORF)組成，其5′末端有帽子狀引導(dǎo)序列，3′末端有Poly(A)尾序列，從5′端到3′端依次為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[7]。ORF1 由ORF1a 和ORF1b 組成，位于基因組的5′端，約占整個(gè)基因組的80%，主要編碼病毒RNA復(fù)制酶和聚合酶。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5依次編碼糖基化的囊膜蛋白GP2a、E、GP3、GP4和GP5[8]，ORF6和ORF7分別編碼膜基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)[9]。ORF5編碼的GP5是PRRSV的一種糖基化囊膜蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為25 ku，具有高度變異性，美洲型毒株和歐洲型毒株的GP5分別由200和201個(gè)氨基酸殘基組成。成熟的GP5由氨基端信號(hào)肽(1-31 aa)、胞外區(qū)、三次跨膜的疏水區(qū)和位于胞質(zhì)中的親水性羧基端組成[8，10-12]。GP5在病毒的組裝、入侵和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用。三次跨膜的GP5 在病毒囊膜上形成兩個(gè)胞外區(qū)，美洲型毒株位于第一胞外區(qū)氨基端的44和51 位(在LV是46和53位)的糖基化位點(diǎn)在不同毒株間高度保守。在LV毒株，46位天冬酰胺(Asn)的糖基化對(duì)病毒的組裝和感染性是必要的，但Asn 53的糖基化似乎并不重要。有關(guān)第二胞外區(qū)與病毒復(fù)制的關(guān)系，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)缺失84-119氨基酸殘基(第二個(gè)胞外區(qū))的截短型GP5的Marc-145細(xì)胞系，研究GP5Δ84-119表達(dá)對(duì)PRRSV復(fù)制的影響及機(jī)制，為進(jìn)一步研究GP5的功能及PRRSV的致病機(jī)制積累資料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病毒、質(zhì)粒、載體和細(xì)胞PRRSV SD16株(GenBank Access No.JX087437.1)、Marc-145細(xì)胞系由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T-GP5、pMD18-T-N質(zhì)粒，Marc-145-GP5、Marc-145-GFP細(xì)胞系由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、鑒定并保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；PiggyBac transposon vector system為SBI公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒、膠純化試劑盒為北京全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品，RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real time)、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、ExTaqVersion 2.0 plus dye為TaKaRa公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶、BamHⅠ、EcoRⅠ為NEB公司產(chǎn)品，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master為Roche公司產(chǎn)品，PageRuler Prestained Protein ladder、BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒為Thermo Scientific公司產(chǎn)品，X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent為Roche公司產(chǎn)品，嘌呤霉素(puromycin)為Merck公司產(chǎn)品，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG、TRITC-conjugated Affinipure Goat Anti-swine IgG為Jackson ImmunoResearch公司產(chǎn)品，Cell counting kit-8(cck-8)為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品，抗α-tubulin單克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品，抗PRRSV GP5小鼠血清、抗PRRSV N蛋白單克隆抗體6D10、抗PRRSV豬陽(yáng)性血清由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；Monkey Interferon α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ ELISA kit (Catalog# CSB-E10040Mo、CSB-E17829Mk、CSB-E110049Mo) 為CUSABIO公司產(chǎn)品。

1.2引物設(shè)計(jì)合成與重組質(zhì)粒構(gòu)建

參照PRRSV SD16株GP5編碼序列利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。采用PCR方法從pMD18-T-GP5質(zhì)粒上分別用引物GP51-83-F與GP51-83-R、GP5120-201-F與GP5120-201-R擴(kuò)增編碼GP5 1—83和120—201氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的基因序列片段，膠回收PCR產(chǎn)物，再采用Overlap PCR方法以編碼GP5 1—83和120—201氨基酸殘基的基因序列片段為模板，用引物GP5-F和GP5-R擴(kuò)增編碼GP5Δ84-119(刪除84—119氨基酸殘基的GP5)的序列片段。膠回收目的片段，將目的片段與PB transposon plasmid用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后回收、連接、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、培養(yǎng)挑取單克隆，將菌液PCR和雙酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pPB-GP5Δ84-119(圖1)。

表1引物信息

Table 1The information of primers

下劃線部分為EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)序列

The underlined areEcoRⅠ andBamHⅠ restriction enzyme sequences

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與細(xì)胞篩選

將狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%左右融合度時(shí)用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 將donor plasmid (pPB-GP5Δ84-119或PB Transposon vector)和helper plasmid(PiggyBac Transposase vector)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)僅轉(zhuǎn)染PB Transposon vector的對(duì)照。轉(zhuǎn)染后24～48 h觀察。若僅轉(zhuǎn)染PB Transposon vector的孔無(wú)熒光，而其他孔均有熒光，則更換新鮮培養(yǎng)液并向培養(yǎng)液中加入終質(zhì)量濃度為10 ng·μL-1的嘌呤霉素開始進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每2 d更換一次含嘌呤霉素的培養(yǎng)液，大約10 d左右在熒光顯微鏡下看到帶綠色熒光的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時(shí)連續(xù)進(jìn)行3次亞克隆，將獲得的表達(dá)綠色熒光的單克隆細(xì)胞及時(shí)進(jìn)行凍存。然后更換為無(wú)嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)并進(jìn)行外源基因表達(dá)檢測(cè)。

1.4篩選細(xì)胞的鑒定

1.4.1RT-PCR鑒定收獲正常培養(yǎng)的篩選細(xì)胞，用RNAiso plus提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA 用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以獲得的cDNA為模板用GP51-83-F和GP5120-201-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.4.2Western blot鑒定收集1×106個(gè)正常培養(yǎng)的篩選細(xì)胞，按NP40裂解液說(shuō)明裂解細(xì)胞準(zhǔn)備樣品進(jìn)行12%分離膠 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗膜后將膜轉(zhuǎn)入抗PRRSV GP5小鼠血清(0.5 ng·μL-1)或抗α-tubulin單克隆抗體(0.25 ng·μL-1)中4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后將膜放入HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(0.08 ng·μL-1)中，室溫孵育1 h，洗膜后用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(TianGen)顯色并記錄結(jié)果。同時(shí)設(shè)Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對(duì)照。

1.4.3激光共聚焦顯微鏡分析將篩選細(xì)胞與Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP按1×104·孔-1分別接種于鋪有爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，冷PBS洗3次后用含0.3%Triton X-100、1% BSA的PBS室溫透膜3 min，洗滌后用含5% BSA的PBS室溫封閉1 h，洗滌后以抗PRRSV 陽(yáng)性豬血清(1∶300稀釋)為一抗室溫孵育細(xì)胞2 h，洗滌，以TRITC-conjugated Affinipure Goat Anti-swine IgG(70 ng·μL-1)為二抗室溫孵育1 h，PBS洗1次，然后用DAPI染細(xì)胞核2 min，PBS洗3次，雙蒸水洗1次，F(xiàn)luorescence mounting medium(Dakota，CA，USA)封片，激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R，Japan)觀察，同時(shí)設(shè)Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對(duì)照。

將RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微鏡分析均為陽(yáng)性的細(xì)胞命名為Marc-145-GP5Δ84-119。

1.5細(xì)胞增殖曲線測(cè)定

用培養(yǎng)液調(diào)整Marc-145-GP5Δ84-119濃度，每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種96孔板培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的24、48、72、96、120、144和168 h在每個(gè)測(cè)定點(diǎn)前2 h，每孔加入10 μL cck-8溶液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對(duì)照。

1.6PRRSV GP5Δ84-119表達(dá)對(duì)病毒復(fù)制影響檢測(cè)

將Marc-145-GP5Δ84-119按5×104·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80% 時(shí)，按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，37 ℃吸附1 h 后換成3% FBS的DMEM維持液，接毒后12、24、36、48、60 h分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。用RNAiso plus提取細(xì)胞總RNA，取500 ng RNA用PrimeScriptTMRT reagent kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以pMD18-T-N為標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Real-time PCR對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品中N基因的拷貝數(shù)。將收集的培養(yǎng)液上清用不含血清DMEM作10倍稀釋，按Reed-Muench法用Marc-145細(xì)胞測(cè)定培養(yǎng)液上清中的病毒滴度(TCID50mL-1)，同時(shí)設(shè)Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對(duì)照。

1.7IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達(dá)檢測(cè)

1.7.1Real-time RT-PCR檢測(cè)IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA水平將Marc-145-GP5Δ84-119按5×104·孔-1接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80% 時(shí)，按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，37 ℃吸附1 h 后換成3% FBS的DMEM維持液，接毒后12、24、36、48 h分別收集細(xì)胞，通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)各樣品中IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，同時(shí)設(shè)Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP對(duì)照。

1.7.2IFN蛋白表達(dá)檢測(cè)將Marc-145-GP5Δ84-119細(xì)胞按1×104·孔-1接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別收集培養(yǎng)24和48 h的培養(yǎng)液上清，同時(shí)待細(xì)胞達(dá)80%融合度時(shí)按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，37 ℃ 吸附1 h，更換為含3% FBS的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。收集接毒后24和48 h的培養(yǎng)液上清，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。用Monkey IFN-α、IFN-β和 IFN-γ ELISA 試劑盒檢測(cè)收集的培養(yǎng)液上清中各IFN蛋白的表達(dá)。

1.8數(shù)據(jù)處理

用GraphPad prism 5 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，P<0.05表示有顯著差異，P<0.001表示有極顯著差異。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建

以pMD18-T-GP5質(zhì)粒為模板，先分別擴(kuò)增編碼PRRSV GP5 1—83氨基酸殘基和120—200氨基酸殘基的基因片段，再以回收的目的片段為模板通過(guò) Overlap PCR方法擴(kuò)增編碼刪除84—119氨基酸殘基的GP5基因片段(圖2A)，回收目的片段與PB Transposon vector連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過(guò)菌液PCR和EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定(圖2B)后測(cè)序結(jié)果顯示，編碼刪除84—119氨基酸殘基的截短型GP5基因片段被正確插入PB Transposon vector中(圖2C)。

2.2穩(wěn)定表達(dá)GP5Δ84-119細(xì)胞的篩選與鑒定

將pPB-GP5Δ84-119或PB Transposon vector 和PiggyBac Transposase vector共轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h觀察到微弱的綠色熒光，48 h綠色熒光已比較明亮，72 h開始用含嘌呤霉素的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)，10 d左右時(shí)觀察到帶熒光的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)3次亞克隆后獲得全部表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆(圖3A)。采用RT-PCR方法可以從篩選的細(xì)胞中擴(kuò)增到495 bp的目的條帶，從Marc-145-GP5細(xì)胞中擴(kuò)增到603 bp的GP5 基因片段，而Marc-145和Marc-145-GFP均無(wú)擴(kuò)增條帶(圖3B)。Western blot結(jié)果顯示，篩選細(xì)胞的泳道有20 ku左右的印跡條帶，Marc-145-GP5細(xì)胞的泳道有25 ku左右的印跡條帶，而Marc-145和Marc-145-GFP細(xì)胞的泳道均無(wú)條帶(圖3C)。激光共聚焦顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，與GP5一樣，GP5Δ84-119主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中(圖4)。

篩選的細(xì)胞在無(wú)嘌呤霉素的培養(yǎng)液中連續(xù)傳50代以上檢測(cè)，目的基因的表達(dá)依然穩(wěn)定。以上結(jié)果表明獲得了穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP5Δ84-119的Marc-145細(xì)胞系Marc-145-GP5Δ84-119。

2.3Marc-145-GP5Δ84-119增殖測(cè)定

采用cck-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況，結(jié)果顯示，與Marc-145和Marc-145-GFP相比，穩(wěn)定表達(dá)GP5Δ84-119對(duì)Marc-145細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，從細(xì)胞接種到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，Marc-145-GP5Δ84-119的增殖與Marc-145和Marc-145-GFP無(wú)差異，僅培養(yǎng)到120 h以后，Marc-145-GP5Δ84-119比Marc-145和Marc-145-GFP早進(jìn)入平臺(tái)期(圖5)。

2.4GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)對(duì)PRRSV復(fù)制的影響

接種PRRSV SD16株后12、24、36、48和60 h分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清。提取細(xì)胞總RNA，以pMD18-T-N質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)絕對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)PRRSVN基因拷貝數(shù)。PRRSV感染后12 h，Marc-145-GP5和Marc-145-GP5Δ84-119細(xì)胞中N基因拷貝數(shù)略有增加，且與Marc-145細(xì)胞相比差異顯著，但從感染后24 h直到檢測(cè)的60 h，Marc-145-GP5Δ84-119細(xì)胞中N基因拷貝數(shù)顯著低于Marc-145細(xì)胞中的 (P<0.05或P<0.01)(圖6A)，培養(yǎng)液上清中的病毒滴度從感染后24 h也持續(xù)低于Marc-145和Marc-145-GFP細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度(P<0.05)(圖6B)。表明GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)可以抑制病毒的復(fù)制。

2.5IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達(dá)檢測(cè)

為了探究GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)抑制PRRSV SD16株復(fù)制的可能原因，在病毒感染后12、24、36和48 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各樣品中IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄情況，并采用ELISA試劑盒檢測(cè)病毒感染后24和48 h培養(yǎng)液中IFN-α、 IFN-β和 IFN-γ蛋白的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Marc-145細(xì)胞相比，病毒感染Marc-145-GP5Δ84-119后12 h，IFN-α、IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄有所下降，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄變化不明顯，到24和36 h，IFN-α(4.09倍和4.98倍)和IFN-β(10.18倍和10.02倍) mRNA轉(zhuǎn)錄均出現(xiàn)了大幅度升高，特別是36 h，IFN-γ(5.72倍)mRNA的轉(zhuǎn)錄也出現(xiàn)上調(diào)，但到48 h，僅檢測(cè)到IFN-β(1.82倍)mRNA轉(zhuǎn)錄仍然處于上調(diào)狀態(tài)(圖7A)。檢測(cè)IFN-α、IFN-β和 IFN-γ蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與Marc-145細(xì)胞相比，正常培養(yǎng)48 h的 Marc-145-GP5Δ84-119細(xì)胞中，IFN-β蛋白水平升高明顯，IFN-α和 IFN-γ在正常培養(yǎng)24和48 h都出現(xiàn)了不同程度的變化，但變化幅度較IFN-β均比較小；病毒感染后24和48 h，與Marc-145細(xì)胞和Marc-145-GFP細(xì)胞上清中IFN-β表達(dá)相比，Marc-145-GP5Δ84-119細(xì)胞上清中IFN-β蛋白表達(dá)一直維持在較高水平，由此推測(cè)IFN-β表達(dá)上調(diào)可能是GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)抑制PRRSV復(fù)制的原因之一，是否還有其他因素導(dǎo)致GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)抑制病毒復(fù)制，有待進(jìn)一步研究。

3討論

病毒感染敏感細(xì)胞包括吸附、侵入、脫殼、病毒成分合成、病毒粒子組裝和釋放等步驟。PRRSV感染 PAM 開始于與巨噬細(xì)胞膜上硫酸乙酰肝素(heparin sulphates，HS)、黏多糖(Glycosaminoglycans，GAGs)的結(jié)合，隨后病毒通過(guò) M/GP5 復(fù)合物與唾液酸黏附素(sialoadhesin，Sn)的氨基端結(jié)合，繼而病毒受體復(fù)合物經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被內(nèi)化，然后病毒基因組從早期內(nèi)體釋放于細(xì)胞質(zhì)并開始病毒的復(fù)制[13]。GP5、M 和 N 蛋白對(duì)病毒粒子的組裝和釋放是絕對(duì)必須的，但共表達(dá) PRRSV 同科的馬動(dòng)脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)的 GP5、M 和 N 蛋白并不能在培養(yǎng)液中形成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)，說(shuō)明其他非結(jié)構(gòu)蛋白或宿主蛋白對(duì)病毒粒子的形成和釋放是必須的[14]。缺少次要囊膜蛋白雖然可以形成病毒粒子，但形成的病毒粒子沒(méi)有感染性[15]。GP5是一種糖基化囊膜蛋白，具有高度變異性，美洲型毒株和歐洲型毒株的GP5分別由200和201個(gè)氨基酸殘基組成。成熟的GP5由氨基端信號(hào)肽(1—31 aa)、胞外區(qū)、三次跨膜的疏水區(qū)和位于細(xì)胞質(zhì)中的親水性羧基端組成[8，10-12]。位于美洲型毒株第一胞外區(qū)的44和51 位(在LV是46和53位)的糖基化位點(diǎn)在不同毒株間高度保守。46位天冬酰胺(Asn)的糖基化對(duì)LV毒株的組裝和感染性是絕對(duì)必須的，但Asn 53的糖基化似乎并不重要[16]。對(duì)于GP5第二胞外區(qū)在病毒復(fù)制中的作用目前卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究在預(yù)測(cè)PRRSV SD16 株GP5跨膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上(圖1)，構(gòu)建表達(dá)刪除GP5第二個(gè)跨膜區(qū)(aa 84-119)的重組質(zhì)粒，在構(gòu)建重組載體時(shí)，作者選擇了PiggyBacTMTransposon Vector System，利用此載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)的目的蛋白質(zhì)與標(biāo)簽蛋白是分離的[17]，在分析目的蛋白質(zhì)的功能時(shí)，不會(huì)受到標(biāo)簽蛋白的影響。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞通過(guò)嘌呤霉素抗性篩選和3次亞克隆獲得了穩(wěn)定表達(dá)GP5Δ84-119的細(xì)胞系Marc-145-GP5Δ84-119，通過(guò)RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，GP5Δ84-119在Marc-145細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá)。篩選的細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下與其祖代細(xì)胞Marc-145細(xì)胞形態(tài)相似(圖3A)，Western blot檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)兩條印記條帶，這與報(bào)道的GP5蛋白存在不同的糖基化形式相一致[18-19]。 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)表明，表達(dá)的GP5Δ84-119主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖4)。利用Cell Counting Kit-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況表明，GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)不影響Marc-145細(xì)胞的增殖(圖5)。

作為 PRRSV 最主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，GP5 在病毒的侵入、組裝和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用[15，20]。在課題組前期構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)GP5全長(zhǎng)的細(xì)胞系Marc-145-GP5上，GP5穩(wěn)定表達(dá)在病毒感染早期可以通過(guò)下調(diào) IFN(特別是IFN-β)的表達(dá)促進(jìn)病毒的復(fù)制。在Marc-145-GP5Δ84-119上接種PRRSV SD16株后不同時(shí)間分別收集培養(yǎng)液上清和細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中的病毒基因拷貝數(shù)和上清中的病毒滴度，發(fā)現(xiàn)除接毒后12 h病毒復(fù)制稍有增加外，一直到接毒后60 h，病毒的復(fù)制被明顯抑制，細(xì)胞中PRRSVN基因拷貝數(shù)和上清中PRRSV滴度均顯著低于Marc-145細(xì)胞和空載體對(duì)照Marc-145-GFP細(xì)胞的(圖6)。研究報(bào)道，IFN-α、IFN-β和IFN-γ 具有抗PRRS病毒的效應(yīng)[21-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Marc-145細(xì)胞相比，PRRSV感染 Marc-145-GP5Δ84-119后，IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄在24和48 h均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，IFN-β蛋白表達(dá)也顯著升高(圖7)，由此推測(cè)干擾素特別是IFN-β表達(dá)的上調(diào)可能是GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)抑制PRRSV復(fù)制的原因之一。Z.Wei等指出GP5蛋白胞外區(qū)存在的N連接的糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒在體內(nèi)的復(fù)制至關(guān)重要[25]。aa 84-119 包括了GP5蛋白的第二個(gè)胞外區(qū)和部分胞內(nèi)區(qū) (圖1)。穩(wěn)定表達(dá)刪除此區(qū)域的截短型GP5，PRRSV在此細(xì)胞上的復(fù)制被顯著抑制，此區(qū)域是否也存在一些關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)在病毒的復(fù)制中發(fā)揮重要作用以及是否還有其他因素發(fā)揮了GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)抑制PRRSV復(fù)制的作用，還有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

構(gòu)建了表達(dá)刪除84—119氨基酸殘基的 PRRSV GP5(GP5Δ84-119)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞篩選到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Marc-145-GP5Δ84-119，GP5Δ84-119在Marc-145細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)可以抑制PRRSV SD16株的復(fù)制，IFN表達(dá)的上調(diào)可能是GP5Δ84-119穩(wěn)定表達(dá)抑制病毒復(fù)制的原因之一。

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(編輯白永平)

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

WANG Xiao-hong1，2，SONG Lin-lin1，2，LI Liang-liang1，2，YUAN Chuan-qi1，2，JIANG Bo1，2，ZHOU En-min1，2*，MU Yang1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.ScientificObservingandExperimentalStationofVeterinaryPharmacologyandVeterinaryBiotechnology，MinistryofAgriculture，Yangling712100，China)

Key words:porcine reproductive and respiratory syndrome virus；GP5Δ84-119；stable expression；replication；interferon

Abstract:This experiment was conducted to study the role of the second extracellular domain of glycoprotein 5，one major structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)，on PRRSV replication and approach to its mechanism in Marc-145 cells.A recombinant plasmid (named as pPB-GP5Δ84-119) expressing truncated GP5 was constructed using PiggyBac Transposon System Vectors and transfected to Marc-145 cells.Marc-145 cell line stably expressing GP5Δ84-119was obtained by puromycin resistance screening and triple subcloning and the selected cells proliferation was detected using cck-8 kit.The effect of GP5Δ84-119stable expression on PRRSV replication were determined thought detection of virus gene copy number in the infected cells and virus titers in the supernatant of infected cells.What’s more，the mRNA and protein expression levels of IFN-α，IFN-β，IFN-γ in the cells before and after PRRSV infection were also analyzed using Real-time PCR and ELISA.The results of RT-PCR，Western blot and IFA confirmed that GP5Δ84-119was stablely expressed in Marc-145 cells and the cells were named as Marc-145-GP5Δ84-119.The result of cell proliferation assay confirmed that the expression of GP5Δ84-119did not affect the proliferation of Marc-145 cells.It was found that GP5Δ84-119expression inhibited the replication of highly pathogenic PRRSV in Marc-145 cells through upregulating IFN level，especially IFN-β.These findings suggest that the second extracellular domain of GP5 plays an important role in PRRSV replication.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.014

收稿日期：2015-06-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31201883)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(2014YB010；2452015318)

作者簡(jiǎn)介：王曉紅(1988-)，女，陜西寶雞人，碩士生，主要從事重大動(dòng)物疫病發(fā)病機(jī)制研究，Tel：029-87091117，E-mail：13152427862@163.com *通信作者：周恩民，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn；穆楊，E-mail：muyang@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0315-10