細(xì)粒棘球絳蟲銅鋅超氧化物歧化酶基因的表達(dá)與特征分析

宋星桔，胡丹丹，鐘秀琴，陽愛國，郭　莉，毛光瓊，王　凝，閆　敏，汪　濤，古小彬，楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

?

細(xì)粒棘球絳蟲銅鋅超氧化物歧化酶基因的表達(dá)與特征分析

宋星桔1，胡丹丹1，鐘秀琴1，陽愛國2，郭莉2，毛光瓊2，王凝1，閆敏1，汪濤1，古小彬1，楊光友1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

摘要：旨在探討Eg-SOD基因的特征及其在細(xì)粒棘球絳蟲上的抗氧化作用。通過原核表達(dá)得到重組Eg-SOD，對(duì)其進(jìn)行酶活性測定、免疫印跡、ELISA以及免疫熒光定位分析。經(jīng)原核表達(dá)出的重組Eg-SOD蛋白為可溶性蛋白，以羥胺法測定其酶學(xué)活性，可達(dá)(464.55±19.99)U·mg-1。免疫印跡結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)能夠被實(shí)驗(yàn)室人工感染細(xì)粒棘球蚴的小鼠陽性血清所識(shí)別，具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性；ELISA分析顯示，重組Eg-SOD對(duì)人工感染細(xì)粒棘球蚴的小鼠血清和自然感染包蟲病的綿羊血清檢出率均為100%，而對(duì)細(xì)頸囊尾蚴的交叉反應(yīng)為37.5%，提示該蛋白質(zhì)可以作為潛在的診斷候選分子。免疫熒光定位顯示該蛋白質(zhì)廣泛分布于成蟲和原頭蚴的組織間隙，以及少量分布于表皮。本研究對(duì)Eg-SOD的特點(diǎn)進(jìn)行了初步的探討，并揭示該蛋白質(zhì)與蟲體的抗氧化損傷有著密切的聯(lián)系。

關(guān)鍵詞：細(xì)粒棘球絳蟲；銅鋅超氧化物歧化酶；熒光定位

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲(細(xì)粒棘球蚴)寄生于人和動(dòng)物的肝和肺等器官內(nèi)，引起人和動(dòng)物的細(xì)粒棘球蚴病(又稱為囊型包蟲病)。在中國，有25個(gè)省、市、自治區(qū)有包蟲病病例的報(bào)道，其中以西部牧區(qū)發(fā)病最為嚴(yán)重[1-2]。該病給我國畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也為人類帶來了諸多公共衛(wèi)生安全問題。

目前已有多種寄生蟲的Cu/Zn SOD已被深入研究。研究者以曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)Cu/Zn SOD DNA疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)該疫苗對(duì)曼氏血吸蟲感染有顯著的抵抗作用[11]。此外，在大片吸蟲(Fasciolagigantica)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)和盤尾絲蟲(Onchocercavolvulus)等蟲種的研究表明，Cu/Zn SOD具有較強(qiáng)的免疫原性[12-15]。在Cu/Zn SOD酶活性的研究上，發(fā)現(xiàn)多種抗寄生蟲藥物，如苯并咪唑類藥物，能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生特異性的抑制作用，而不傷害宿主Cu/Zn SOD的活性[16-17]。然而，在細(xì)粒棘球絳蟲上，對(duì)Cu/Zn SOD的研究還非常有限[18]。因此，本研究擬對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲Cu/Zn SOD(Eg-SOD)的抗氧化作用，免疫原性以及它在各時(shí)期蟲體中的分布情況進(jìn)行研究，期望通過了解Eg-SOD的這些基本特征，為該蛋白質(zhì)的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)，并為包蟲病的防控提供基礎(chǔ)參考資料。

1材料與方法

1.1蟲體

細(xì)粒棘球蚴包囊采自青海省西寧市屠宰場的綿羊肝或肺，在實(shí)驗(yàn)室無菌條件下進(jìn)行手術(shù)分離。用一次性注射器對(duì)囊液進(jìn)行反復(fù)抽送后吸出囊液，并分離生發(fā)層。囊液經(jīng)3 000 r ·min-1離心5 min，取沉淀用滅菌生理鹽水洗滌3次即得細(xì)粒棘球蚴原頭蚴。

為了獲取細(xì)粒棘球絳蟲成蟲，對(duì)兩只來自非棘球蚴病疫區(qū)的犬(約5月齡，雌性)提前1周投喂吡喹酮(praziquantel)和阿苯達(dá)唑(albendazole)。在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下，分別將約20 000個(gè)原頭蚴飼喂犬，35 d后剖殺犬只，取其小腸部分，置于37 ℃溫?zé)岬纳睇}水中，并用木片輕輕刮取其黏膜表面，自然沉降得到殘?jiān)梅糯箸R從中挑取成蟲。

1.2血清

對(duì)12只6～8周齡雌性ICR小鼠進(jìn)行腹腔接種，每只接種200 μL含有約2 000個(gè)原頭蚴的PBS混懸液(含100 U·mL-1青霉素和 100 μg·mL-1鏈霉素)。9個(gè)月后，對(duì)小鼠進(jìn)行斷尾采血，并剖殺小鼠，在其腹腔中發(fā)現(xiàn)了棘球蚴包囊的小鼠血清視為陽性血清；陰性血清為未接種原頭蚴的小鼠血清。14份自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊血清以及健康綿羊血清采自新疆某屠宰場；8份感染細(xì)頸囊尾蚴的綿羊血清來自四川某屠宰場。

1.3生物信息學(xué)分析

從細(xì)粒棘球絳蟲基因組數(shù)據(jù)庫中下載得到細(xì)粒棘球絳蟲Eg-SOD基因全序列，以DNAStar軟件推測其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。以在線軟件SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、Transmembrane Prediction server(http：//www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)和TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分別對(duì)其信號(hào)肽、跨膜區(qū)以及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。以推導(dǎo)出的氨基酸序列找出同源基因，并以Clustal W2在線軟件(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。以DNAMAN比較同源基因之間的相似性。最后用MEGA 5.05軟件以鄰接法構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4Eg-SOD的表達(dá)、純化與酶活性測定

取約2 000個(gè)原頭蚴，以動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(Tiangen，China)提取總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的PCR引物(上游：5′-CGGGGTACCATGAAGGCTGTCTGTGTTA-TGC-3′，下劃線為KpnⅠ酶切位點(diǎn)；下游：5′-CCG-CTCGAGGCTTTTAGCGATTCCGATGA-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，從cDNA中擴(kuò)增出Eg-SOD基因全長CDs區(qū)域。經(jīng)TA克隆后，將擴(kuò)增產(chǎn)物以酶切鏈接的方式導(dǎo)入pET32a載體中；經(jīng)測序驗(yàn)證連接正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。超聲裂解重組菌后，取裂解產(chǎn)物上清，以Ni2+親和層析的方法進(jìn)行純化。按超氧化物歧化酶分型測試試劑盒(羥胺法)(南京建成生物工程研究所)的操作步驟對(duì)重組Eg-SOD蛋白的酶活性進(jìn)行測定。

1.5重組蛋白質(zhì)多克隆抗體的制備

以重組蛋白質(zhì)對(duì)2只約15周齡的雄性新西蘭大白兔進(jìn)行3次皮下免疫，每次免疫間隔2周。首次免疫為50 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)與等體積弗氏完全佐劑混合，加強(qiáng)免疫為50 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)與等體積弗氏不完全佐劑混合。免疫結(jié)束后第2周，對(duì)大白兔進(jìn)行采血，并分離血清。將分離后的血清在Protein A親和層析柱(Bio-Rad，USA)中進(jìn)行純化，得到血清中的多克隆抗體。對(duì)照組大白兔即把重組蛋白質(zhì)替換為等體積的PBS，抗體制備過程與試驗(yàn)組相同。

1.6免疫印跡

將重組蛋白質(zhì)和原頭蚴裂解液分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，再將凝膠分別轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別以綿羊和小鼠棘球蚴陽性、陰性血清(均為1∶200稀釋)對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育；以重組蛋白質(zhì)高免血清和對(duì)照血清(均為1∶1 000稀釋)對(duì)原頭蚴裂解液進(jìn)行孵育。經(jīng)洗滌后，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔抗綿羊二抗對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育；再以HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗對(duì)原頭蚴裂解產(chǎn)物進(jìn)行孵育。最后在顯色底物作用下進(jìn)行顯色觀察。

1.7ELISA

向96孔板中加入100 μL含有2 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)的包被液(0.1 mol·L-1碳酸鈉溶液pH 9.6)，4 ℃包被過夜。經(jīng)5%脫脂牛奶包被后，向孔中分別加入12份小鼠棘球蚴陽性血清和陰性血清(1∶200稀釋)進(jìn)行孵育；然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗進(jìn)行孵育；洗滌后以可溶性TMB顯色底物進(jìn)行顯色，并以2 mol·L-1H2SO4終止顯色。在酶標(biāo)儀紫外波長450 nm處測定吸光度值。以相同的抗原和血清反應(yīng)濃度分別對(duì)14份細(xì)粒棘球蚴綿羊陽性和陰性血清以及8份細(xì)頸囊尾蚴綿羊血清進(jìn)行孵育，再以HRP標(biāo)記的兔抗綿羊二抗孵育，并進(jìn)行顯色，測定OD值。

1.8免疫熒光定位

取新鮮蟲體樣品(包括原頭蚴、生發(fā)層和成蟲)于4%多聚甲醛溶液中固定36 h；樣本經(jīng)一系列的脫水、透明處理后包埋入石蠟內(nèi)，并以切片機(jī)切片備用。經(jīng)脫蠟和水化處理后，將切片用3% H2O2處理10 min，然后置于約95 ℃的0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液中5～10 min，進(jìn)行熱修復(fù)抗原；經(jīng)洗滌后，分別以多克隆抗體和健康兔IgG對(duì)切片進(jìn)行4 ℃孵育過夜；隨后，反復(fù)洗滌切片，以FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(Bethyl Laboratories)對(duì)蟲體進(jìn)行顯色，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2結(jié)果

2.1Eg-SOD基因的生物信息學(xué)分析

細(xì)粒棘球絳蟲基因組中Cu/ZnSOD基因全長2 356 bp，含兩個(gè)較長的內(nèi)含子和三個(gè)外顯子，與其他帶科絳蟲或蠕蟲的基因結(jié)構(gòu)相似。該基因CDs序列含459個(gè)堿基，編碼152個(gè)氨基酸，與其他物種SOD氨基酸序列之間的保守性較高，與帶科絳蟲之間的相似性達(dá)到92.76%～98.68%，與其寄生宿主(哺乳動(dòng)物)之間的相似性為57.89%～59.21%(圖1)。經(jīng)氨基酸序列預(yù)測，SOD蛋白沒有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為15.6 ku，等電點(diǎn)為5.95，分布于細(xì)胞周質(zhì)之中。Eg-SOD二級(jí)結(jié)構(gòu)具有典型的Cu/Zn SOD酶活性區(qū)域，八個(gè)折疊區(qū)以及兩個(gè)二硫鍵形成位點(diǎn)可供形成二聚體。基于動(dòng)物界Cu/ZnSOD基因氨基酸序列的進(jìn)化分析顯示，所有序列主要?dú)w為四大分支，即蠕蟲分支、昆蟲分支、線蟲分支以及脊椎動(dòng)物分支，Eg-SOD歸為蠕蟲分支(圖2)。

2.2重組Eg-SOD的表達(dá)及其識(shí)別

經(jīng)凝膠電泳顯示，由特異性引物PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為一條459 bp左右的條帶，與基因組數(shù)據(jù)中的Eg-SOD基因大小一致。經(jīng)測序得到的序列與基因組中的序列相似性達(dá)到100%，即表明該片段為Eg-SOD基因CDs全序列。

經(jīng)親和層析后的重組蛋白質(zhì)在SDS-PAGE下顯示為單一條帶，大小約為35 ku，符合預(yù)期大小(加上pET32a載體上的Trx標(biāo)簽約20 ku)。通過與小鼠和綿羊棘球蚴陽性血清進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)重組Eg-SOD能夠被陽性血清特異性的識(shí)別(圖3)，說明Eg-SOD具有較好的反應(yīng)原性。以羥胺法針對(duì)Cu/Zn SOD酶活性進(jìn)行測試，顯示rEg-SOD具有較強(qiáng)的酶活性，經(jīng)NaN3處理后活性依然不減，達(dá)到(464.55±19.99)U·mg-1(表1)，說明rEg-SOD不是Mn SOD而是Cu/Zn SOD。

2.3ELISA

表1重組Eg-SOD酶活性的測定

Table 1Enzyme activity analysis of recombinant Eg-SOD

酶活力計(jì)算公式為：酶活力(U·mg-1)=(對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)÷對(duì)照組OD值÷50%×反應(yīng)稀釋倍數(shù)÷蛋白質(zhì)濃度Computational formula：Enzyme activity (U·mg-1) =[OD value (Con)-OD value (Exp)]÷OD value (Con)÷50%×Dilution ratio÷Protein concentration

2.4Eg-SOD在細(xì)粒棘球絳蟲各生活史階段的定位

免疫熒光定位所用多克隆血清經(jīng)Western blot驗(yàn)證，能夠特異性的識(shí)別蟲體中的Eg-SOD蛋白(圖3)，故可以用作下一步試驗(yàn)。經(jīng)熒光免疫定位試驗(yàn)顯示，Eg-SOD大量且廣泛地存在于蟲體的各個(gè)生活時(shí)期，在原頭蚴皮層下部、整個(gè)生發(fā)層和蟲卵卵殼外層有大量表達(dá)；在原頭蚴皮層外部、成蟲皮層外部有少量表達(dá)(圖5)。

3討論

銅鋅超氧化物歧化酶作為超氧自由基清除劑，廣泛地分布于各種生物器官之中，清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，避免其形成對(duì)機(jī)體有毒害作用的氧自由基(如過氧化氫，次氯酸鹽以及過氧亞硝酸鹽等)，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞[19]。正常情況下，在機(jī)體有氧代謝過程中即會(huì)產(chǎn)生少量的ROS，它們會(huì)被自身的SOD酶及時(shí)地還原。在微生物感染過程中，宿主往往通過中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或者嗜堿性粒細(xì)胞等通過NADPH氧化酶等產(chǎn)生氧自由基來對(duì)病原微生物進(jìn)行殺傷[20]。在寄生蟲的寄生過程中，它們能夠成功地逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，有一部分原因就是因?yàn)樗鼈冏陨砭哂邪l(fā)達(dá)的抗氧化酶系統(tǒng)(如：SOD、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、硫氧還原蛋白等)[9]。在此體系中SOD具有重要的作用，它能將超氧自由基歧化為水和過氧化氫，后者在過氧化氫酶等的作用下進(jìn)一步分解為對(duì)機(jī)體無害的水，從而化解氧化壓力。

在本研究中，作者對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲的Cu/ZnSOD基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性進(jìn)行了分析。Eg-SOD基因與其他絳蟲的基因在結(jié)構(gòu)和序列上相似度較高，Cu2+和Zn2+離子結(jié)合位點(diǎn)、二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)、以及超氧自由基結(jié)合位點(diǎn)與其它動(dòng)物Cu/Zn SOD完全保守，提示Eg-SOD基因是一個(gè)非常保守的基因。對(duì)其他寄生蟲Cu/Zn SOD的研究表明，阿苯達(dá)唑和噻苯達(dá)唑等苯并咪唑類抗寄生蟲藥物能夠特異性地抑制寄生蟲SOD酶活性，而不損害宿主SOD酶活性[16]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，絳蟲Cu/ZnSOD基因能夠與其哺乳動(dòng)物宿主基因明顯地區(qū)分開來，說明了它們之間存在著較大的差異，這使得寄生蟲Cu/Zn SOD作為藥物靶點(diǎn)成為可能。

G.Salinas等[18]曾對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲各時(shí)期蟲體及組分中SOD酶活性進(jìn)行了分析，顯示大部分的酶活性來自于Cu/Zn SOD，而Mn SOD只有少部分組織中才有，且活性較低，說明Cu/Zn SOD在細(xì)粒棘球絳蟲抗氧化系統(tǒng)中的重要地位。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法也發(fā)現(xiàn)Cu/Zn SOD酶在細(xì)粒棘球絳蟲各時(shí)期蟲體和組織中廣泛分布，并且在原頭蚴和蟲卵中的含量也相對(duì)較高。G.Salinas等的研究也曾指出在原頭蚴中的Cu/Zn SOD酶活性最高。結(jié)合本研究結(jié)果，推測當(dāng)細(xì)粒棘球蚴在寄生于中間宿主體內(nèi)時(shí)經(jīng)受的氧化壓力最強(qiáng)，當(dāng)某些包囊中的原頭蚴不能再承受這種壓力以后，就可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡等過程而被殺死，從而產(chǎn)生了不育包囊。

免疫印跡和ELISA結(jié)果顯示rEg-SOD具有良好的反應(yīng)原性，對(duì)小鼠陽性血清以及自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊血清識(shí)別率均為100%，提示其可作為一個(gè)候選的診斷抗原。但是，由于陽性血清的種類和數(shù)量還比較欠缺，還需要來自更多患病動(dòng)物或人類的陽性血清對(duì)其敏感性進(jìn)行分析；同時(shí)還需要其他動(dòng)物寄生蟲病(如腦多頭蚴病等)陽性血清對(duì)其特異性進(jìn)行分析。本研究通過原核表達(dá)純化出具有較高酶活性和反應(yīng)原性的重組蛋白質(zhì)，為后續(xù)將rEg-SOD作為人和動(dòng)物包蟲病診斷抗原的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]WANG Z，WANG X，LIU X.Echinococcosis in China，a review of the epidemiology ofEchinococcusspp[J].Ecohealth，2008，5(2)：115-126.

[2]YANG Y R，SUN T，LI Z，et al. Community surveys and risk factor analysis of human alveolar and cystic echinococcosis in Ningxia Hui Autonomous Region，China[J].BullWorldHealthOrgan，2006，84(9)：714-721.

[3]MORO P，SCHANTZ P M.Echinococcosis：a review[J].IntJInfectDis，2009，13(2)：125-133.

[4]McMANUS D P，GRAY D J，ZHANG W， et al. Diagnosis，treatment，and management of echinococcosis[J].BMJ，2012，344：e3866.

[5]AMRI M，AISSA S A，BELGUENDOUZ H， et al.Invitroantihydatic action of IFN-γ is dependent on the nitric oxide pathway[J].JInterferonCytokineRes，2007，27(9)：781-787.

[6]CARDONI R L，ANTUNEZ M I，MORALES C，et al. Release of reactive oxygen species by phagocytic cells in response to live parasites in mice infected withTrypanosomacruzi[J].AmJTropMedHyg，1997，56(3)：329-334.

[7]STEERS N J，ROGAN M T，HEATH S.In-vitrosusceptibility of hydatid cysts ofEchinococcusgranulosusto nitric oxide and the effect of the laminated layer on nitric oxide production[J].ParasiteImmunol，2001，23(8)：411-417.

[8]HAHN U K，BENDER R C，BAYNE C J.Killing ofSchistosomamansonisporocysts by hemocytes from resistantBiomphalariaglabrata：role of reactive oxygen species[J].JParasitol，2001，87(2)：292-299.

[9]CHIUMIENTO L，BRUSCHI F.Enzymatic antioxidant systems in helminth parasites[J].ParasitolRes，2009，105(3)：593-603.

[10]SALINAS G.An update on redox biology of parasites[J].AntioxidRedoxSignal，2013，19(7)：661-664.

[11]CARVALHO-QUEIROZ C，COOK R，WANG C C，et al. Cross-reactivity ofSchistosomamansonicytosolic superoxide dismutase，a protective vaccine candidate，with host superoxide dismutase and identification of parasite-specific B epitopes[J].InfectImmun，2004，72(5)：2635-2647.

[12]KIM T S，JUNG Y，NA B K， et al. Molecular cloning and expression of Cu/Zn-containing superoxide dismutase fromFasciolahepatica[J].InfectImmun，2000，68(7)：3941-3948.

[13]VACA-PANIAGUA F，TORRES-RIVERA A，PARRA-UNDA R，et al.Taeniasolium：antioxidant metabolism enzymes as targets for cestocidal drugs and vaccines[J].CurrTopMedChem，2008，8(5)：393-399.

[14]AJONINA-EKOTI I，NDJONKA D，TANYI M K，et al. Functional characterization and immune recognition of the extracellular superoxide dismutase from the human pathogenic parasiteOnchocercavolvulus(OvEC-SOD)[J].ActaTrop，2012，124(1)：15-26.

[15]KHAWSAK P，KANJANAVAS P，KIATSOMCHAI P，et al. Expression and characterization of Cu/Zn superoxide dismutase fromWuchereriabancrofti[J].ParasitolRes，2012，110(2)：629-636.

[17]SANCHEZ-MORENO M，ENTRALA E，JANSSEN D，et al. Inhibition of superoxide dismutase fromAscarissuumby benzimidazoles and synthesized pyrimidine and glycine derivatives[J].Pharmacology，1996，52(1)：61-68.

[18]SALINAS G，CARDOZO S.Echinococcusgranulosus：Heterogeneity and differential expression of superoxide dismutases[J].ExpParasitol，2000，94(1)：56-59.

[19]VAN RAAMSDONK J M，HEKIMI S.Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan[J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(15)：5785-5790.

[20]BEAMAN L，BEAMAN B L.The role of oxygen and its derivatives in microbial pathogenesis and host defense[J].AnnuRevMicrobiol，1984，38：27-48.

(編輯白永平)

Prokaryotic Expression and Characterization of Cu/Zn Superoxide Dismutase ofEchinococcusgranulosus

SONG Xing-ju1，HU Dan-dan1，ZHONG Xiu-qin1，YANG Ai-guo2，GUO Li2，MAO Guang-qiong2，WANG Ning1，YAN Min1，WANG Tao1，GU Xiao-bin1，YANG Guang-you1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.SichuanCentersforAnimalDiseaseControlandPreventive，Chengdu610041，China)

Key words:Echinococcusgranulosus；Cu/Zn superoxide dismutase；immunolocalization

Abstract:The aim of this study was to characterise the Cu/Zn superoxide dismutase ofEchinococcusgranulosus(Eg-SOD)，and analyze its role in the parasite antioxidant system.The recombinant Eg-SOD was expressed inE.coli，and the enzymatic activity was measured，and analyses including western blotting，ELISA and immunofluorescence localization were also performed.The recombinant Eg-SOD was expressed as soluble protein，and its activity was up to (464.55 ±19.99) U·mg-1measured by hydroxylamine method.As showed by the result of western blot，the recombinant Eg-SOD could be recognized by the serum of mice secondary experimentally infected withE.granulosusprotoscolexes，and showed a high immunogenicity；ELISA tests showed that recombinant Eg-SOD could recognize all the sera from mice experimentally infected with protoscolexs and from sheep naturally infected withE.granulosus，and have 37.5% cross-reactions with sera from sheep infected withCysticercustenuicollis，which indicates Eg-SOD might be a potential diagnose antigen.The immunolocalization of Eg-SOD showed a wide extent of distribution，mostly in the tissue clearance of adult worms and protoscolexes，and fewer on the tegument.These results provide the fundamental understanding of Eg-SOD，and revealed its capable of antioxidation effect.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.018

收稿日期：2015-06-03

基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015NZ0041)

作者簡介：宋星桔(1991-)，女，四川資陽人，碩士，主要從事動(dòng)物寄生蟲病學(xué)研究，E-mail：18728153735@163.com *通信作者：楊光友，教授，博導(dǎo)，從事動(dòng)物寄生蟲病學(xué)研究，E-mail：guangyou1963@aliyun.com

中圖分類號(hào)：S852.734

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0346-08