大通牦牛胎盤與胎兒組織線粒體SDH基因分析

李　莉，柳夢(mèng)琪，胡佩瑩，張勤文，俞紅賢，荊海霞

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016)

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大通牦牛胎盤與胎兒組織線粒體SDH基因分析

李莉，柳夢(mèng)琪，胡佩瑩，張勤文，俞紅賢*，荊海霞

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016)

摘要：旨在探討高原低氧環(huán)境下大通牦牛發(fā)育早期線粒體標(biāo)志酶-琥珀酸脫氫酶(SDH)在不同組織中的表達(dá)模式。本研究以大通牦牛妊娠4月齡牦牛及出生1日齡犢牦牛為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)牦牛胎盤組織，4月齡胎兒和出生1日齡犢牦牛的心肌、骨骼肌、肝和大腦組織中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基mRNA定量表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，研究不同組織線粒體中SDHmRNA表達(dá)量與其組織器官能量代謝的相關(guān)性。結(jié)果顯示：出生1日齡犢牦牛心肌組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基mRNA表達(dá)量均顯著高于4月齡胎兒；4月齡胎兒大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基mRNA表達(dá)量均顯著高于出生1日齡犢牦牛。綜上表明：SDH基因表達(dá)模式表現(xiàn)為4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡犢牦牛心肌組織中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，表明4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡犢牦牛心肌組織能量代謝調(diào)控活動(dòng)旺盛。

關(guān)鍵詞：大通牦牛；線粒體；SDH；mRNA表達(dá)模式

大通牦牛是利用青海省特有野牦牛遺傳資源培育成功的第一個(gè)國(guó)家級(jí)牦牛新品種，具有生長(zhǎng)發(fā)育速度快、生產(chǎn)性能高、繁殖性能好、遺傳性能穩(wěn)定和抗逆性能較強(qiáng)等特點(diǎn)，突出表現(xiàn)為越冬死亡率低[1]。動(dòng)物在胎兒早期的發(fā)育中就可受到環(huán)境因素的影響，此時(shí)胎兒會(huì)采取“預(yù)測(cè)適應(yīng)反應(yīng)”(Predictive adaptive responses)。胎兒對(duì)其將來(lái)生存環(huán)境的預(yù)測(cè)正確與否，決定健康與否或疾病的發(fā)生[2]。環(huán)境對(duì)胎兒期造成的影響直接影響著生物體將來(lái)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，因此，對(duì)牦牛發(fā)育早期適應(yīng)高原低氧機(jī)制進(jìn)行研究顯得尤為重要。線粒體是細(xì)胞呼吸和產(chǎn)生ATP 的主要部位，在維持細(xì)胞正常能量代謝結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用。琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)是線粒體內(nèi)膜的標(biāo)志酶，與黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)共價(jià)結(jié)合的復(fù)合酶，是三羧酸循環(huán)與電子傳遞鏈的功能性成分，由SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基構(gòu)成[3]。SDH的活性和線粒體數(shù)目平行升降，與能量的生成有著密切的關(guān)系，并可間接反映線粒體功能和組織的供氧情況[4]。本試驗(yàn)對(duì)大通牦牛母體胎盤、妊娠4月齡胎兒和出生1日齡犢牦牛心肌、骨骼肌、肝及大腦組織線粒體中SDHmRNA進(jìn)行定量表達(dá)測(cè)定，分析其基因SDHA、SDHB、SDHC和SDHD的mRNA表達(dá)量與其組織器官發(fā)育能量代謝調(diào)控活動(dòng)的關(guān)系，為探討大通牦牛高原低氧環(huán)境適應(yīng)的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源及處理

由青海省大通種牛場(chǎng)(海拔3 600 m左右)繁育中心提供臨床健康牦牛(妊娠4月齡)和犢牦牛(出生1日齡)各5頭份，屠宰后迅速采集牦牛胎盤組織，胎兒和犢牦牛的心肌、骨骼肌、肝和大腦組織，樣品液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器和試劑

UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD)，紫外凝膠成像儀(Bio-Rad Gel Doc XR+)，iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(BIO-RAD)。Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)，pMDTM19-TVector Cloning Kit，Quick CutTMEcoR I和SYBR Green PremixTaq酶(TaKaRa公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，Solarbio瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(索萊寶公司)。

1.3方法

1.3.1熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)合成根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查詢得到牛(Bostaurus)線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD基因的mRNA序列(4個(gè)亞基基因登錄號(hào)依次為NM_174178.2、 NM_001040483.1、NM_175814.3和NM_174179.2)，利用primer 5.0和DNAMAN在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，交由上海生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成(表1)。

表1熒光定量PCR引物序列

Table 1Primer sequences for fluorescent quantitative PCR

1.3.2總RNA的提取及cDNA第一鏈合成用Trizol 法抽提總RNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度及純度，并用變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。參照Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit指導(dǎo)說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

1.3.3常規(guī)PCR獲取目的基因序列以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。25 μL反應(yīng)體系：模板1.0 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1.0 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1.0 μL，滅菌ddH2O 9.5 μL，PremixTaq酶12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃3 min；98 ℃10 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.4重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒制備按照Solarbio瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的操作說明，對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，將純化產(chǎn)物與pMDTM19-T在 16 ℃條件下連接1 h。后經(jīng)42 ℃熱擊及冰浴等反應(yīng)與E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行連接，將菌液均勻涂布于Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12 h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h。利用PMD?19-T vector通用引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR初步鑒定后，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序以進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3.5Real-time PCR將標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，參照SYBR Green Premix Taq試劑指導(dǎo)說明，在專用的 PCR板(96孔)中加樣體系：SYBR Premix TaqII 12.5 μL 上、下游引物各1.0 μL 模板2.0 μL ddH2O 8.5 μL。在Real-time PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，78 ℃ 1 s。首先將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA上機(jī)后進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。其中待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6數(shù)據(jù)處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0 版Duncan’s多重比較 (P=0.05)。所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±SD)”表示。

2結(jié)果

2.1RT-PCR獲得目的基因片段

通過RT-PCR獲得目的基因片段，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得大約100～300 bp的目的條帶，序列測(cè)定結(jié)果驗(yàn)證獲得的目的條帶同原始序列的同源性。如圖1、圖2、圖3和圖4分別是SDHA、SDHB、SDHC和SDHD基因擴(kuò)增條帶。

2.2熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2結(jié)果顯示，SDHA重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.396 8x+51.543，相關(guān)系數(shù)R2=99.96%，SDHB重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.225 7x+47.546，相關(guān)系數(shù)R2=99.83%。SDHC重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.357 4x+49.138，相關(guān)系數(shù)R2=99.57%，SDHD重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.352 3x+53.440，相關(guān)系數(shù)R2=99.96%。說明產(chǎn)物特異性擴(kuò)增的重復(fù)性較好。

表2重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

Table 2The standard curve and the correlation coefficient of recombinant plasmid

2.3大通牦牛組織線粒體中SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達(dá)量分析

妊娠4月齡母體胎盤組織、4月齡胎兒和出生1日齡犢牦牛骨骼肌、心肌、肝和大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達(dá)量分析結(jié)果見表3。妊娠4月齡胎盤組織線粒體SDH4個(gè)亞基mRNA表達(dá)量由高到低依次為SDHA、SDHB、SDHC和SDHD；4月齡胎兒大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達(dá)量均顯著高于出生1日齡犢牦牛；出生1日齡犢牦牛心肌線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達(dá)量均顯著高于4月齡胎兒。

3討論

實(shí)時(shí)定量PCR是快速定量mRNA轉(zhuǎn)錄水平的可靠方法。為了準(zhǔn)確比較不同樣本mRNA轉(zhuǎn)錄水平，在不同樣本之間一般用內(nèi)參基因調(diào)整mRNA水平，比較牛在不同發(fā)育階段不同基因在不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，不同組織的合適內(nèi)參基因不同[5-7]，因此制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)比較大通牦牛不同組織SDH基因表達(dá)情況。

SDH是三羧酸循環(huán)與電子傳遞鏈的功能性成分，是有氧代謝的標(biāo)志酶，對(duì)于研究低氧環(huán)境下動(dòng)物適應(yīng)性氧化呼吸代謝等具有重要意義。其結(jié)構(gòu)亞基SDHC和SDHD將催化亞基SDHA和SDHB錨定在線粒體內(nèi)膜上，催化琥珀酸氧化為延胡索酸。胎盤在低氧環(huán)境下會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)變化[8-9]，牛可以通過多種方式影響胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)功能，如在妊娠中期牛子宮阜DNA含量保持相對(duì)平衡，胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)血液的供應(yīng)[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示妊娠4月齡胎盤組織線粒體SDH4個(gè)亞基mRNA表達(dá)量由高到低依次為SDHA、SDHB、SDHC和SDHD。

高海拔低氧對(duì)線粒體的影響已有研究[12]，短期處于高海拔低氧環(huán)境降低參與三羧酸(TCA)循環(huán)的酶濃度，但不影響骨骼肌線粒體功能的完整程度[13]，而永久低氧刺激的高海拔人群(藏族和克丘亞族)中已經(jīng)形成了大量有效的進(jìn)化性適應(yīng)[14-16]。李莉等[17]研究表明：隨著海拔梯度的升高，高海拔地區(qū)牦牛心肌、骨骼肌中SDH 酶活性明顯升高，表明牦牛肌組織線粒體中SDH 的增加加速了細(xì)胞三羧酸循環(huán)的速度以適應(yīng)低氧環(huán)境中的有氧代謝及能量供應(yīng)，肌組織有氧代謝能力均增強(qiáng)。林偉山等[18]對(duì)大通牦牛胎盤-胎兒組織線粒體SDH、CCO 和ATP 酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示，牦牛在發(fā)育早期組織線粒體中SDH活性保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。4月齡胎兒生長(zhǎng)發(fā)育到出生1日齡犢牦牛階段，外界的生存環(huán)境對(duì)心肌是重要的刺激因素，本試驗(yàn)結(jié)果表明：出生1日齡犢牦牛心肌組織線粒體SDH4個(gè)亞基mRNA表達(dá)量均顯著高于4月齡胎兒，這可能與出生后氧應(yīng)激對(duì)心肌組織的供氧供能作用有關(guān)。4月齡胎兒大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基mRNA表達(dá)量均顯著高于出生1日齡牦牛，表明妊娠4月齡胎兒大腦能量代謝調(diào)控活動(dòng)旺盛。

表3大通牦牛胎盤與胎兒組織cDNA樣品中SDHA、SDHB、SDHC、SDHD基因表達(dá)量

Table 3SDHA，SDHB，SDHCandSDHDgenes expression quantity in Datong yak placenta and fetus tissue cDNA samples

上標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，小寫字母代表大通牦牛處于同一時(shí)期不同組織基因表達(dá)量比較，大寫字母代表大通牦牛不同時(shí)期相同組織基因表達(dá)量比較(P<0.05)，同時(shí)有兩個(gè)相同字母表示差異極顯著(P<0.01)

Different letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)，Different capital letter are represented expression quantity of the same tissue in different stages(P<0.05).Writing 2 same letters to represent treatments are extremely remarkable(P<0.01)

4結(jié)論

在高原低氧環(huán)境下，大通牦牛在不同發(fā)育階段不同組織線粒體SDH亞基mRNA轉(zhuǎn)錄水平不同，SDH基因模式表現(xiàn)為4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡心肌組織中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個(gè)亞基轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，表明4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡犢牦牛心肌組織能量代謝調(diào)控活動(dòng)旺盛。

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(編輯程金華)

The Succinate Dehydrogenase Genetic Analysis of Placenta and Fetus Tissue Mitochondria in Datong Yak

LI Li，LIU Meng-qi，HU Pei-ying，ZHANG Qin-wen，YU Hong-xian*，JING Hai-xia

(AgricultureandAnimalHusbandryCollegeofQinghaiUniversity，Xining810016，China)

Key words:Datong yak；mitochondria；SDH；mRNA expression pattern

Abstract:The expression patterns of mitochondrial marker-succinate dehydrogenase(SDH) in different tissues of Datong yak at early development stage were investigated under the plateau hypoxia environment.Pregnant yaks at 4-month-old and yaks at 1-day-old were sampled，genetic mRNA expression quantities (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) of placental tissues，cardiac muscle，skeletal muscle，liver and brain tissues of fetuses at 4-month-old and yaks at 1-day-old were determined using qRT-PCR，the correlation between mitochondrialSDHmRNA expression qualities and energy metabolism in different organs and tissues were researched.The results showed that cardiac muscle mitochondrial genetic mRNA expression quantities (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) of yaks at 1-day-old were significantly higher than those of fetuses at 4-month-old，cerebral mitochondrial genetic mRNA expression quantities (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) of fetuses at 4-month-old were significantly higher than those of yaks at 1-day-old.SDHgene expression patterns suggested that gene (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) transcription levels were up-regulated expression between the brain of fetus at 4-month-old and cardiac muscle of yak at 1-day-old，which was reflected on exuberant energy metabolism regulation activities between the brain of fetus at 4-month-old and cardiac muscle of yak at 1-day-old.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.010

收稿日期：2015-06-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(31160489；31460643)；青海省科技廳項(xiàng)目資助(2013-Z-712)

作者簡(jiǎn)介：李莉(1969-)，女，青海西寧人，教授，碩士，主要從事高原動(dòng)物低氧適應(yīng)性研究，E-mail：llqhdx@163.com *通信作者：俞紅賢，E-mail：yhx@qhu.edu.cn

中圖分類號(hào)：S823.8+5.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0284-06