進(jìn)出口動物中新霉素ELISA檢測方法的建立

孫明君，邱 芳，張金玲，鄭小龍＊

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，青島266002；2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，濰坊261000）

進(jìn)出口動物中新霉素ELISA檢測方法的建立

孫明君1，邱 芳1，張金玲2，鄭小龍1＊

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，青島266002；2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，濰坊261000）

摘 要：應(yīng)用碳二亞胺法合成人工抗原得到卵清蛋白偶聯(lián)新霉素，通過方陣試驗(yàn)確定最佳抗原包被濃度與抗體稀釋倍數(shù)，以新霉素質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)、抗體抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了進(jìn)出口食用動物中新霉素ELISA快速檢測技術(shù)，并對建立的方法進(jìn)行了回收率和特異性試驗(yàn)。結(jié)果表明，建立的檢測方法包被人工合成抗原的最適稀釋度為1∶200，抗體的最佳稀釋度為1∶2 000，半數(shù)抑制濃度（IC50）為6.99ng／mL；該方法的最低檢測限達(dá)40ng／mL，與慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、托普霉素、阿米卡星、雙氫鏈霉素的交叉反應(yīng)率均小于0.1%，平均加標(biāo)回收率83.77%。標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.5～40ng／mL范圍內(nèi)是線性的，相關(guān)系數(shù)為0.987，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝－37.66x＋94.592；與常規(guī)液相檢測方法相比操作簡單、快速。本研究建立了一種快速、高效、特異的新霉素ELISA檢測方法。

關(guān)鍵詞：進(jìn)出口食用動物；新霉素；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；檢測方法

新霉素是氨基糖苷類抗生素，對革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑殺作用。在畜牧和水產(chǎn)中，該類抗生素不但被廣泛用于防制各種動物疾病，而且常常添加到飼料中［1］，用于促進(jìn)動物生長發(fā)育。氨基糖苷類抗生素的作用機(jī)理主要是抑制蛋白質(zhì)的合成，其在動物性食品中殘留可能會引起過敏，長期使用可能還會引起耳和腎臟毒性等比較嚴(yán)重的毒副作用。中國長期存在濫用、不合理使用抗生素飼料添加劑的情況，動物性食品中抗生素殘留問題十分嚴(yán)重，不僅給消費(fèi)者帶來健康上的損害，而且阻礙中國動物產(chǎn)品的出口。近幾年，中國不斷加強(qiáng)食用動物中抗生素使用的監(jiān)督管理，除了制定、修訂法律法規(guī)，還不斷對殘留的限量做出規(guī)定，以最大限度地減少食品安全對人類健康的威脅。

目前國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測新霉素殘留的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜－質(zhì)譜法（LC－MS）和高效快速的免疫方法［2］。一般先用ELISA方法進(jìn)行篩選，對可疑樣品再用質(zhì)譜法進(jìn)行確認(rèn)。商艷紅等［3］用ELISA檢測方法測定了雞肉組織中新霉素殘留，與其他6種氨基糖苷類抗生素均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，雞肉組織樣本的添加回收率均在71.8%～97.8%。Wang等［4］用ELISA檢測動物源食品中的新霉素，豬肉、雞肉、魚和牛奶中的檢測限是5μg／kg，腎臟中是10μg／kg，雞蛋中是20μg／kg；回收率為75%～105%，對其他氨基糖苷類抗生素均沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。Jin等［5］用單克隆抗體直接競爭ELISA方法測定動物牛奶和血漿中的新霉素，沒有對其他氨基糖苷類抗生素發(fā)生交叉反應(yīng)，說明抗體具有較高的特異性，在血漿和牛奶中的檢測限分別是3.61、2.73ng／mL，50～200ng／mL水平的加標(biāo)回收率是87%～108%。黃耀凌等［6］建立了牛奶中鏈霉素殘留的快速篩選檢測方法，檢測限可達(dá)20μg／mL，200μg／mL質(zhì)量濃度的空白奶樣添加回收率為60%～110%?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中基本是動物屠殺后組織中藥物殘留的檢測，單純靠動物屠宰后的殘留檢測并不能滿足進(jìn)口活體動物中藥物殘留的檢測，而藥物經(jīng)動物體內(nèi)代謝后會在血液和尿液中殘留，所以亟待建立一種針對活體動物血液和尿液中藥物殘留的檢測方法。因此，本試驗(yàn)在以往試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立針對進(jìn)出口活體動物的血液和尿液中新霉素殘留的檢測方法，以期有效解決中國進(jìn)出口食用動物中新霉素的快速檢測等問題。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自Dr.Ehrenstorfer公司；碳二亞胺購自Aldrich公司；卵清蛋白（OVA）購自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Amresco公司；新霉素多抗（綿羊源）購自Abnova公司；驢抗綿羊HRP酶標(biāo)二抗購自Abbkine公司；透析袋；吐溫－20、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀均為國產(chǎn)分析純；Millipore純水儀（Milli－Q）、96孔酶標(biāo)板（Biofil）、酶標(biāo)儀（infinite M200）、洗板機(jī)（BioRAD1575）、8道微量移液器（Eppendorf）、離心機(jī)（Eppendorf5810）、渦旋混勻器（IKA－MS2）、pH計(jì)（Mettler Toledo）均由山東省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動檢實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2溶液

包被緩沖液：0.05mol／L的碳酸鹽緩沖液（CBS）（pH 9.6）；洗滌緩沖液：含0.05%Tween－20的0.1mol／L的PBS緩沖液（pH 7.6）；稀釋緩沖液：含0.1mol／L的PBS緩沖液（pH 7.6）；封閉緩沖液：含2%的BSA溶液；底物液：0.3%過氧化氫；顯色劑液：用pH 5.0的乙酸鈉－檸檬酸緩沖液配制0.2g／L的四甲基聯(lián)苯胺溶液；終止液：2mol／L的H2SO4溶液。

1.3人工抗原的合成

卵清蛋白偶聯(lián)新霉素（OVA－NEO）：稱取20mg NEO和20mg OVA溶于PBS溶液（0.01mol／L，pH 7.4），攪拌均勻（20min），稱70mg EDC加入到上述混合液中，攪拌反應(yīng)4h，然后進(jìn)行透析（20℃條件下用0.01mol／L PBS透析3d，12h換一次透析液），透析結(jié)束之后，4℃保存。

SDS－PAGE鑒定：5%濃縮膠、10%分離膠、濃縮膠電壓70V、分離膠電壓85V、上樣量20μL，考馬斯亮藍(lán)染色5～6h后，置洗脫液中過夜脫色［7－8］。

1.4樣品的制備與保存

用一次性無菌注射器采集靜脈血10mL置于抗凝血試管中；直接采集食用動物排泄的尿液于50mL離心管中。所采集食用動物的血液、尿液置于4℃下保存?zhèn)溆?，長期存放置于－18℃。

1.5測定步驟

取50μL血液或尿液樣品，加1.2mL PBS緩沖液，混勻；4 000r／min離心5min；每孔取50μL上清來檢測［9－10］。ELISA測定根據(jù)待測樣品數(shù)量和標(biāo)準(zhǔn)樣品（每個樣品2個平行），決定微孔的使用量；每孔100μL含有OVA偶聯(lián)新霉素抗原包被板4℃過夜；將微孔內(nèi)液體垂直倒掉，加入250μL洗滌緩沖液，輕輕晃動后垂直倒掉，再重復(fù)洗滌微孔3次，在濾紙上用力垂直磕掉殘留在壁上的液體；每孔加250μL 2%BSA，37℃封閉2h；洗板；每孔中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液；在每孔中加入50μL辣根酶標(biāo)記物和50μL抗體，混勻；室溫（22.5±2.5）℃避光孵育30min；洗板；每孔加入50μL底物和50μL顯色劑液，充分混合并在室溫（22.5±2.5）℃下暗處孵育15min；加入100μL的終止液終止反應(yīng)，充分混合后30min內(nèi)于450nm處測量吸光度值［11］。

1.6抗原包被濃度與抗體量的確定

方陣試驗(yàn)確定包被抗原最適包板量和新霉素抗體的最適稀釋倍數(shù)，即用包被液對合成抗原按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000稀釋，每個稀釋度1行，每孔加100μL，包被板于4℃過夜后，每孔加入300μL洗液洗板3次，拍干，然后加2%BSA 250μL，封膜，37℃培養(yǎng)箱中封閉2h。將新霉素多抗用PBS按照1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶50 000、1∶100 000、1∶200 000稀釋，按順序每個稀釋度加1列（最后一列為PBS空白對照孔），每孔加100μL，室溫放置30min。倒掉孔中液體，用洗液每孔300μL洗板3次，拍干。然后每孔加入1∶2 000PBS稀釋的HRP偶聯(lián)物，每孔100μL，室溫放置30min；倒掉孔中液體，用洗液每孔300μL洗板3次，拍干。每孔加入底物100μL，室溫避光反應(yīng)15min后，每孔加入100μL終止液，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)［12］。

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限的確定

采用競爭ELISA法，以上述方陣法確定的適宜包被濃度和抗體稀釋度為基礎(chǔ)，將新霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同質(zhì)量濃度（0、1.5、3.0、6.0、12.0、36.0ng／mL），每孔點(diǎn)樣50μL做競爭ELISA，以新霉素質(zhì)量濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，抗體的抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定其檢測限［13］。

1.8抗體特異性的考察

分別配制相應(yīng)濃度慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、托普霉素、阿米卡星、雙氫鏈霉素，每孔分別加50μL，與等量的抗體稀釋液進(jìn)行競爭反應(yīng)，以新霉素的IC50與類似物IC50濃度之比計(jì)算交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率愈低說明抗體的特異性愈高［14－15］。

1.9回收率與方法準(zhǔn)確性

分別對綿羊血和豬尿液進(jìn)行添加，添加濃度為37.50、125.00、250.00、375.00、500.00、750.00ng／mL。人工添加NEO到PBS空白液中，使其在PBS中的終濃度為10、20ng／mL，以板內(nèi)誤差及板間誤差來表示該方法的準(zhǔn)確度。

1.10方法的不確定度

參照J(rèn)JF 1059－1999測量不確定度評定與表示、CANS－GL06化學(xué)分析中不確定度的評估指南，ELISA檢測進(jìn)出口食用動物中新霉素含量過程中不確定度的來源，主要包括測量重復(fù)性、樣品吸取體積、樣品前處理加樣體積、ELISA檢測過程中標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。

1.11不同方法的比較

分別用本方法、試劑盒方法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS）方法對同一批新霉素的添加樣品進(jìn)行測定并對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1人工合成抗原的鑒定

OVA和BSA分子質(zhì)量分別為66.5、45.0ku，相比NEO 908u分子質(zhì)量很大，因此偶聯(lián)成功時并不能有很明顯的分開條帶，偶聯(lián)成功后僅增加幾百道爾頓，只能呈現(xiàn)出拖尾現(xiàn)象，因此通過SDS－PAGE圖若能夠觀察到拖尾現(xiàn)象就能夠說明偶聯(lián)成功。由圖1可知，OVA－NEO偶聯(lián)物有明顯的拖尾現(xiàn)象，表明OVA－NEO的分子質(zhì)量大于OVA，證明NEO與OVA已成功偶聯(lián)［16－17］。

圖1　合成抗原蛋白電泳結(jié)果Fig.1 Results of synthetic antigen protein electrophoresis

2.2新霉素包被抗原及抗體稀釋度的確定

方陣滴定選擇D值在1.0左右的包被抗原濃度及抗體稀釋度作為最佳工作濃度［18］，結(jié)果見表1。由表1可知，包被抗原的最佳稀釋度為1∶200，新霉素抗體的最佳稀釋度為1∶2 000。

表1　方陣法確定試劑的最佳工作濃度Table 1 Square method to determine the best working concentration reagent

2.3競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將6個濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、1.5、3、6、12、36ng／mL）按限量法測定步驟測得相應(yīng)的D值。以0濃度的吸光度D值為分母，其他標(biāo)準(zhǔn)濃度的D值為分子的比值，再乘以100%，獲得吸光度的百分比。以此吸光度百分比為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的5個新霉素標(biāo)準(zhǔn)濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。該定標(biāo)模型在1.5～40ng／mL范圍內(nèi)是線性的，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得待測溶液中新霉素含量。標(biāo)準(zhǔn)品檢測范圍為1.5～36ng／mL，擬合方程為y＝－37.66x＋94.592，R2＝0.987，IC50為6.99ng／mL，IC15可達(dá)2.97ng／mL，最低檢測限為40ng／mL，靈敏度較高［19］。

圖2　新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standarding curve of neomycin

2.4特異性

通過競爭試驗(yàn)觀察新霉素與6種類似物交叉反應(yīng)率。由表2可知，抗體與類似物慶大霉素、那卡霉素、鏈霉素、托普霉素、阿米卡星和雙氫鏈霉素的交叉反應(yīng)率均＜0.1%，表明試驗(yàn)獲得抗體的特異性比較高。

表2　方法的特異性Table 2 The specificity of the method

2.5加標(biāo)回收率與方法準(zhǔn)確性

2.5.1加標(biāo)回收率 對樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，分為綿羊血和豬尿液兩組基質(zhì)，每種基質(zhì)分別做樣本空白、37.50、125.00、250.00、375.00、500.00、 750.00ng／mL的新霉素添加，每個樣本3個平行，兩組基質(zhì)各做一個試劑空白，結(jié)果見表3。由表3可知，該方法測得樣品中新霉素的平均回收率為83.77%，實(shí)際檢測濃度與添加濃度接近。

表3　不同樣品基質(zhì)中新霉素添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Samples of different matrix of neomycin add recoveries and relative standard deviation

2.5.2方法準(zhǔn)確性 板內(nèi)測定為同一酶標(biāo)板上同一樣本若干孔的平均值，板間測定為不同酶標(biāo)板上幾次測定結(jié)果的平均值，本試驗(yàn)中，板內(nèi)誤差和板間誤差均取3次測定的平均值，結(jié)果見表4。由表4可知，NEO添加濃度為10ng／mL時，3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為0.50%，板間變異系數(shù)為5.23%；NEO添加濃度為20ng／mL時，3次重復(fù)測定的板內(nèi)變異系數(shù)為1.36%，板間變異系數(shù)為3.72%；說明該方法的穩(wěn)定性較好。其中B／B0為樣品吸光度值與空白吸光度值的百分比，也就是抑制濃度百分比。

表4　方法準(zhǔn)確性考查Table 4 The accuracy test of the method

2.6不確定度分析

以豬尿液作為樣品基質(zhì)，分別將重復(fù)性測量、樣品吸取、前處理過程加樣體積、ELISA檢測過程中標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合作為不確定度分量進(jìn)行考查，并將不確定度分量合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：0.4826ng／mL；置信水平為95%，包含因子k＝2，ELISA檢測豬尿液中新霉素的擴(kuò)展不確定度為0.9496ng／mL［20］。ELISA檢測豬尿液中新霉素的不確定度分析結(jié)果見表5。

表5　ELISA檢測豬尿中新霉素的不確定度分析Table 5 The uncertainty analysis of ELISA to detect neomycin in pig urine

2.7不同方法比較

選取豬尿液和綿羊血作為樣品基質(zhì)，分別添加100、200、500ng／mL新霉素標(biāo)準(zhǔn)品，編號1～3為尿液基質(zhì)，編號4～6為血液基質(zhì)，添加濃度按編號順序由小到大，所測定的數(shù)值見表6。由表6可知，3種方法中LC－MS方法得到的數(shù)值與添加值最接近，雖然LC－MS方法在定量方面更準(zhǔn)確，但是在大規(guī)模篩查方面本方法與試劑盒方法在操作和用時上顯然優(yōu)于LC－MS方法。而本方法得到的數(shù)值雖然與試劑盒方法相近，但測定相同樣品的RSD小于試劑盒方法，表明所得數(shù)值分布更加均勻穩(wěn)定，因此本方法在大規(guī)模篩查中有一定優(yōu)勢。

表6　3種方法檢測樣品中不同添加濃度的NEOTable 6 Detection of NEO in the samples with different added concentrations by three kinds of method

3 討 論

試驗(yàn)建立了快速檢測進(jìn)出口食用動物中新霉素殘留的競爭ELISA方法。成功合成抗原并確定了新霉素包被抗原及抗體最佳工作濃度，試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測方法的最低檢測限可達(dá)40ng／mL，檢測范圍為1.5～36.0ng／mL，與6種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)小，抗體特異性較好，樣品平均加標(biāo)回收率為83.77%，板間、板內(nèi)變異系數(shù)均小于5%。多次試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好且具有ELISA檢測法微量、高效、經(jīng)濟(jì)和方便的特點(diǎn)，可用于進(jìn)出口食用動物中新霉素殘留的大批量、快速檢測。

由于氨基糖苷類抗生素具有毒副作用，各國對氨基糖苷類等各種抗生素的殘留限量作了很嚴(yán)格的規(guī)定。要發(fā)展對外貿(mào)易，就必須加大對抗生素殘留的檢測。液相色譜作為目前主要的檢測方法，發(fā)揮著重要的作用，但動物樣品基質(zhì)中含有大量的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)等多種復(fù)雜的成分，往往會降低樣品的檢測限和回收率等。高效快速的免疫方法，其檢測的準(zhǔn)確性對于進(jìn)出口食用動物中抗生素的快速檢測十分重要，相信今后ELISA法能夠更好地應(yīng)用于氨基糖苷類的定量分析。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了測定進(jìn)出口食用動物中新霉素殘留量的ELISA法，對綿羊血、豬尿液中新霉素檢測限達(dá)到40ng／mL；特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對其他氨基糖苷類無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。綜上所述，本試驗(yàn)建立了靈敏、快速、特異的新霉素ELISA檢測方法，該方法在進(jìn)出口動物檢驗(yàn)檢疫中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 秦 彤）

中圖分類號：S859.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3163－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.012

收稿日期：2016－05－11

基金項(xiàng)目：CNCA檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃項(xiàng)目（2014B369）

作者簡介：孫明君（1986－），男，遼寧鐵嶺人，碩士生，獸醫(yī)師，研究方向：食品農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，E－mail：522302003＠qq.com

通信作者：＊鄭小龍（1979－），男，山東平邑人，碩士，高級獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病檢測，E－mail：zhengxl612＠163.com

Establishment of ELISA Detection Method for Neomycin in Import and Export Animal

SUN Ming－jun1，QIU Fang1，ZHANG Jin－ling2，ZHENG Xiao－long1＊
（1.InspectionandQuarantineTechnologyCenterofShandongEntry－exitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266002，China；2.WeifangEntry－exitInspectionandQuarantineBureau，Weifang261000，China）

Abstract：This experiment used carbodiimide get egg albumin synthesis of artificial antigens coupling neomycin，through square test to determine the best antigen packaged concentration and antibody dilution ratio，mass concentration logarithm of neomycin as abscissa，inhibition rate of antibody as the ordinate drawing standard curve，established ELISA fast detection techniques of neomycin in edible animal for import and export.Methods of recovery and specific test had been done in further research.Results showed that the test dilution ratio of optimum synthetic antigen was 1∶200，the best dilution multiple of antibodies was 1∶2 000，half inhibitory concentration（IC50）was 6.99ng／mL；The minimum detection limit of the method was 40ng／mL，and cross reaction rate of gentamicin，kanamycin，streptomycin，tobramycin，amikacin and dihydrostreptomycin were less than 0.1%，the average of recovery rate was 83.77%.The range of standarding curve in 1.5～40ng／mL was linear，the correlation coefficient was 0.987，the equation of standarding curve was y＝－37.66x＋94.592；Compared with HPLC method，the operation was simple and fast.The test results showed that the enzyme－linked immunosorbent method of detecting neomycin was rapid，efficient and specific.

Key words：import and export food animals；neomycin；enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）；detection method