上海市肉鴿沙門氏菌的分離鑒定及流行血清型和耐藥性分析

梁德媚，許學(xué)斌，王偉芳，詹澤強(qiáng)，任行星，林嘉特，廖 明，張建民＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州510642；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海200336；3.廣州市白云區(qū)江高鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣州510450）

上海市肉鴿沙門氏菌的分離鑒定及流行血清型和耐藥性分析

梁德媚1，許學(xué)斌2，王偉芳3，詹澤強(qiáng)1，任行星1，林嘉特1，廖 明1，張建民1＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州510642；2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海200336；3.廣州市白云區(qū)江高鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣州510450）

摘 要：為了解上海市農(nóng)貿(mào)市場肉鴿群體中沙門氏菌流行血清型和耐藥情況，本試驗于2011—2014年間從上海市各區(qū)農(nóng)貿(mào)市場采集肉鴿新鮮糞便樣本92份，用XLD平板和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基分離疑似沙門氏菌，革蘭氏染色鏡檢并進(jìn)行生化試驗，共獲得沙門氏菌24株，分離率為26.1%。采用Kauffmann－White法和K－B紙片法對24株沙門氏菌進(jìn)行血清型鑒定和16種抗生素的藥敏試驗。血清型鑒定顯示，24株沙門氏菌可分為鼠傷寒（66.7%）、阿貢納（25.0%）和科瓦利斯（8.3%）3種血清型。藥敏試驗結(jié)果顯示，有75.0%（18株）的分離株表現(xiàn)出不同程度耐藥，其中分離株對四環(huán)素和磺胺異?唑耐藥率最高，均達(dá)到62.5%，其次為鏈霉素（58.3%）、萘啶酸（50.0%）、氨芐西林（20.8%）。多重耐藥菌株15株（62.5%），耐4種抗菌藥物的菌株最多，占16.7%（7株）。另外，分離菌株對頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢噻甲羧肟、亞胺培南、氧氟沙星等5種藥物的敏感率為100.0%，對奧格門丁和環(huán)丙沙星有12.5%的中介敏感率。本研究結(jié)果表明，上海市肉鴿中沙門氏菌的攜帶率較高，且菌株多重耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重，這為食品中沙門氏菌的防控工作帶來較大的挑戰(zhàn)和風(fēng)險，肉鴿沙門氏菌的流行和耐藥情況應(yīng)值得密切關(guān)注。

關(guān)鍵詞：肉鴿；沙門氏菌；血清型；耐藥性

沙門氏菌是一種重要的人獸共患病原菌，其對人、家畜、家禽及其他動物均有致病性。據(jù)數(shù)據(jù)顯示，沙門氏菌每年可造成8×103～1.65×104萬人感染，60萬人死亡，給人類健康和社會經(jīng)濟(jì)帶來巨大威脅［1］。在公共衛(wèi)生學(xué)意義上，沙門氏菌也是導(dǎo)致人類食物中毒的主要食菌之一，其分布廣泛，污染途徑也較多，動物肉制品、蔬菜水果及飲水都可通過食物鏈直接或間接引起人類感染。世界各國的各類細(xì)菌性食物中毒的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，由沙門氏菌引起的食物中毒在英國和中國內(nèi)陸地區(qū)排第1位，在美國則為第2位。在中國，由沙門氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的70%～80%，其中沙門氏菌污染最為嚴(yán)重的是動物源性食品［2］。隨著人們生活水平的提高，人類的肉類消費(fèi)習(xí)慣呈現(xiàn)多樣化，鴿子作為一種食物出現(xiàn)在餐桌上的頻率也逐漸增多。沙門氏菌作為鴿子的一種常見病原體，其引起沙門氏菌的風(fēng)險也在隨著肉鴿消費(fèi)量的升高而逐漸增大。國外相關(guān)研究［3］表明，鴿子是沙門氏菌的重要儲存宿主之一，病原體污染食物后通過食物鏈傳播給人類，有危及公共健康的風(fēng)險。然而，目前國內(nèi)關(guān)于鴿源沙門氏菌的流行血清型和耐藥情況的研究較少，大多局限于沙門氏菌的臨床鑒定和治療。因此，及時了解和掌握肉鴿食品中沙門氏菌的流行及耐藥情況，才能更好地應(yīng)對其對人類食品安全帶來的挑戰(zhàn)和風(fēng)險，這在獸醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生學(xué)上均具有重要意義。本研究通過分析了解2011—2014年上海市肉鴿沙門氏菌的流行血清型和耐藥特征，為預(yù)防肉鴿沙門氏菌感染的發(fā)生及公共衛(wèi)生意義上的抗生素使用策略提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

2011—2014年從上海市各區(qū)農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)采集肉鴿新鮮糞便樣本92份；法國科瑪嘉沙門顯色培養(yǎng)基、XLD瓊脂粉均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液購自江蘇寶萊生物科技有限公司；腸桿菌科細(xì)菌GYZ－15e生化編碼鑒定管、M－H瓊脂購自上海星科生物科技有限公司；沙門氏菌診斷血清O抗原和H抗原均購自S＆A公司；16種藥敏紙片：四環(huán)素（TET，30μg／片）、氯霉素（C，30μg／片）、氨芐西林（AMP，25μg／片）、亞胺培南（IMP，10μg／片）、奧格門丁（AMC，30μg／片）、頭孢吡肟（FEP，30μg／片）、頭孢噻肟（CTX，30μg／片）、頭孢噻甲羧肟（CAZ，30μg／片）、慶大霉素（CN，30μg／片）、鏈霉素（S，25μg／片）、環(huán)丙沙星（CIP，10μg／片）、氧氟沙星（OFX，5μg／片）、奈啶酸（NA，30μg／片）、復(fù)方新諾明（SXT，25μg／片）、磺胺異惡唑（SF，300μg／片）、甲氧芐胺嘧啶（W，5μg／片）均購自O(shè)xoid公司；生物顯微鏡（型號CX12）購自北京瑞科中儀科技有限公司；質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病教研室保存。

1.2細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集肉鴿新鮮糞便置于無菌容器中及時送檢。將92份肉鴿糞便樣本無菌劃線接種于XLD瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，然后取培養(yǎng)皿上的典型菌落（無色半透明有黑色中心或幾乎全為黑色）接種于法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，37℃增菌培養(yǎng)18～24h。大腸埃希菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌。

1.3細(xì)菌染色鏡檢

挑取上述顯色培養(yǎng)基上的圓形、光滑、淡紫色的可疑菌落，在潔凈玻片上滴一滴無菌水，涂片固定制成菌膜后，再按結(jié)晶紫初染1min，碘液媒染1min，酒精脫碘30s，蕃紅復(fù)染1min的步驟依次進(jìn)行革蘭氏染色操作，待玻片干燥，在顯微鏡鏡下觀察分離菌株的形態(tài)特征。若為革蘭氏陰性（染成紅色），兩端鈍圓的較細(xì)長短桿菌，則將其所在的培養(yǎng)皿單個菌落無菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)物。

1.4細(xì)菌生化鑒定

取上述分離細(xì)菌純培養(yǎng)物分別接種腸桿菌科細(xì)菌GYZ－15e生化編碼鑒定管，進(jìn)行硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗）、葡萄糖磷酸鹽胨水（MR）、西蒙氏檸檬酸鹽、尿素、半固體瓊脂、三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖15項生化試驗，37℃培養(yǎng)24h，根據(jù)細(xì)菌的生化特征確定沙門氏菌株。

1.5血清型鑒定

用上述分離株進(jìn)行血清型鑒定。分離株的血清型鑒定按照沙門氏菌血清型凝集試驗說明書進(jìn)行，參照White－Kauffmann－Le Minor（WKLM）抗原表，確定每株沙門氏菌分離株的血清型。

1.6藥物敏感試驗

選用16種臨床常用抗菌藥物，采用WHO推薦的藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby－Baue法）測定分離菌株對抗菌藥物的敏感性。最后測量藥敏試驗抑菌環(huán)直徑，嚴(yán)格依照美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI／NCCLS）制定的標(biāo)準(zhǔn)［4］判定敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。

2 結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

初步分離出的疑似沙門氏菌菌株在XLD培養(yǎng)基呈邊緣光滑、圓形、大的帶光澤的黑色菌落形態(tài)（圖1），在法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基呈圓形、邊緣光滑、淡紫色菌落形態(tài)（圖2）。

圖1　XLD平板上的疑似沙門氏菌菌落Fig.1 Suspected colonies from XLD plates

圖2　沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基上的疑似菌落Fig.2 Suspected colonies fromSalmonellachromogenic medium

2.2染色鏡檢結(jié)果

革蘭氏染色后顯微鏡觀察純化培養(yǎng)物的染色特性，為革蘭氏陰性、兩端鈍圓短桿菌（圖3）。

圖3　革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（125×）Fig.3 Gram stain microscopy image（125×）

2.3生化鑒定結(jié)果

對分離出來的疑似沙門氏菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1。結(jié)合選擇培養(yǎng)基分離及染色鏡檢結(jié)果，根據(jù)生化鑒定結(jié)果判斷，從92份肉鴿糞便樣本中共分離得到24株沙門氏菌，分離率為26.1%。

表1　生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical test results

2.4沙門氏菌血清型分析

由圖4可知，對24株分離株進(jìn)行沙門氏菌抗原血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，24株分離株可分為3個血清型，其中鼠傷寒沙門氏菌16株（66.7%），阿貢納沙門氏菌6株（25.0%），科瓦利斯沙門氏菌2株（8.3%）。

圖4　沙門氏菌血清型鑒定結(jié)果Fig.4 Identification result ofSalmonellaserotype

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，24株沙門氏菌株中有18株（75.0%）表現(xiàn)不同程度的耐藥，其中鼠傷寒沙門氏菌13株（72.2%）、阿貢納沙門氏菌3株（16.7%）、科瓦利斯沙門氏菌2株（11.1%）。沙門氏菌分離株對四環(huán)素和磺胺異唑耐藥率最高，均為62.5%；對頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢噻甲羧肟及奧格門丁、亞胺培南、氧氟沙星、環(huán)丙沙星7種藥物則均未表現(xiàn)明顯耐藥；對奧格門丁和環(huán)丙沙星兩者中度敏感比例均達(dá)12.5%。耐鏈霉素、萘啶酸、氨芐西林、慶大霉素的分離菌株分別占58.3%、50.0%、20.8%和8.3%；耐氯霉素、復(fù)方新諾明、甲氧芐胺嘧啶的菌株則均占12.5%?？傮w看來，分離株對第3代、第4代頭孢菌素最為敏感，抑菌率均高達(dá)100.0%（表2）。

表2　藥敏試驗結(jié)果（%）Table 2 Results of drug susceptibility test

多重耐藥菌株（耐3種及3種抗生素）的耐藥譜見表3。由表3可知，多重耐藥菌株有15株，占菌株總數(shù)的62.5%，其中有2株鼠傷寒沙門氏菌最高耐受7種抗生素。最常見的耐藥譜是四環(huán)素（TET）／萘啶酸（NA）／磺胺異惡唑（SF）／鏈霉素（S）。鼠傷寒沙門氏菌、阿貢納沙門氏菌和科瓦利斯沙門氏菌分別有4、2、2種不同的耐藥譜，總體來看，不同血清型的耐藥譜雖有差異但相似度較高。

表3　多重耐藥沙門氏菌的耐藥譜分析Table 3 Resistance spectrum analysis of multi－drug resistantSalmonella

3 討 論

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原體，血清型復(fù)雜，有2 500多種，據(jù)報道，中國目前存在的血清型有292種［5］，其中多種血清型可交叉感染人和動物，在畜禽中出現(xiàn)較多的鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌及豬霍亂沙門氏菌等可引起人類發(fā)生傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病。沙門氏菌病常通過攝入被沙門氏菌污染的各種畜禽產(chǎn)品、水果、蔬菜而感染，尤其是被污染的動物及其制品［6］。沙門氏菌是鴿子的一種常見病原體，可通過食物鏈傳給人類，因此，研究肉鴿群體沙門氏菌血清型和耐藥性有助于預(yù)防食品沙門氏菌感染的發(fā)生，為控制沙門氏菌病、減少耐藥性菌株的出現(xiàn)和擴(kuò)散提供科學(xué)依據(jù)。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉鴿群體沙門氏菌分離率為26.1%，與國外研究結(jié)果一致［7］，但與國內(nèi)有關(guān)研究顯示的多種動物沙門氏菌平均攜帶率為11.1%（其中雞14.38%、鴨11.28%、犬8.74%、豬8.65%）［8］相比，沙門氏菌在肉鴿群體的分離率相對較高。血清型鑒定結(jié)果表明，一方面，24株肉鴿沙門氏菌分離株以鼠傷寒沙門氏菌（66.7%）為優(yōu)勢血清型，這與中國華南地區(qū)的報道一致［9］，與此同時，趙玉林［10］報道的楊凌、西安、寶雞3個地區(qū)中，牛源、雞源、豬源、羊源鼠傷寒沙門氏菌的檢出率比肉鴿群體低，分別為12.5%、13.0%、15.8%和12.5%，這表明肉鴿群體中鼠傷寒沙門氏菌的檢出率較高。另一方面，根據(jù)上海市臨床監(jiān)測數(shù)據(jù)［11］，由沙門菌引起腹瀉的病人中，鼠傷寒沙門菌也是優(yōu)勢血清型，這也說明肉鴿群體中致病性沙門菌很有可能通過食物鏈?zhǔn)谷祟惛腥尽Ｊ髠抽T氏菌目前是中國臨床常見的沙門氏菌致病血清型，其在動物、食品和低齡兒童中的感染率和致病力很高，因此加強(qiáng)肉鴿群體沙門氏菌的防控十分必要。阿貢納沙門氏菌也是較為常見的血清型，近年來國內(nèi)外因阿貢納沙門氏菌感染引起食物中毒和疾病的例子也屢有報道。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿貢納沙門氏菌的檢出率達(dá)25.0%，較目前其他報道的檢出率（3.0%）高［12］，應(yīng)引起重視。

隨著抗生素在臨床上的廣泛使用，沙門氏菌耐藥問題越發(fā)突出，質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)等方式可使耐藥基因在細(xì)菌之間進(jìn)行廣泛傳播，從而導(dǎo)致新的耐藥菌株乃至超級菌株不斷出現(xiàn)，給人類和動物沙門氏菌感染的治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［13］。本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，75.0%（18株）沙門氏菌株表現(xiàn)出不同程度耐藥，分離株對傳統(tǒng)抗生素如四環(huán)素、磺胺異唑、鏈霉素、萘啶酸等耐藥率較高（50.0%以上），與沈海燕等［14］、沈雋卿等［15］結(jié)果一致。分離菌株對鏈霉素耐藥的中介率高達(dá)41.7%，表明在藥物的持續(xù)誘導(dǎo)和選擇作用下，沙門氏菌對鏈霉素的耐藥性會持續(xù)上升，這提示在臨床選擇藥物時應(yīng)謹(jǐn)慎選用鏈霉素。第3代頭孢菌素和第3代喹諾酮類藥物是治療沙門氏菌感染的常用藥物，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有沙門氏菌分離株對頭孢噻肟和環(huán)丙沙星分別為100.0%、87.5%的敏感率，與現(xiàn)有研究結(jié)果相近［16］。但也有文獻(xiàn)報道，人臨床分離株對頭孢噻肟和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為10%和19%以上［17－18］，因此，臨床用藥應(yīng)引起重視。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，62.5%（15株）沙門氏菌株耐3種（含3種）以上抗菌藥物，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。本試驗中最常見的多重耐藥譜為四環(huán)素（TET）－萘啶酸（NA）－磺胺異唑（SF）－鏈霉素（S），這4類抗生素都是常用的，多重耐藥表型的出現(xiàn)主要是因為抗生素濫用產(chǎn)生的高選擇壓力和耐藥基因的水平傳遞，具有此耐藥譜的菌株能否成為優(yōu)勢菌株值得密切關(guān)注。鼠傷寒沙門氏菌有3個不同的耐藥譜，至少可耐受3種抗菌藥物，還有2株鼠傷寒沙門氏菌可耐受7種以上的抗菌藥物，這與張增峰［19］對上海市臨床鼠傷寒沙門氏菌的耐藥性檢測數(shù)據(jù)相似。隨著鼠傷寒沙門氏菌越來越成為食源性沙門氏菌的重要檢出血清型，分析其耐藥情況，對臨床治療藥物篩選有著重要的指導(dǎo)作用。阿貢納沙門氏菌的多重耐藥譜與禽源、人源阿貢納分離株的耐藥譜相似［20－21］，表明沙門氏菌的耐藥性可在不同動物之間進(jìn)行交叉?zhèn)鞑ァ？仆呃股抽T氏菌在中國屬于罕見血清型，本試驗中，僅有的2株科瓦利斯沙門氏菌耐藥譜與鼠傷寒沙門氏菌和阿貢納沙門氏菌耐藥譜相似，均表現(xiàn)多重耐藥。

4 結(jié) 論

本研究獲得了上海市肉鴿致病沙門氏菌流行血清學(xué)和耐藥情況的數(shù)據(jù)，對制定肉鴿群體中沙門氏菌疾病防控措施及治療方法具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)上海市農(nóng)貿(mào)市場肉鴿群體沙門氏菌攜帶率較高，耐藥情況較嚴(yán)重，對沙門氏菌病原體的防控工作帶來較大挑戰(zhàn)和風(fēng)險。為確保食品安全，有關(guān)食品監(jiān)管部門應(yīng)改進(jìn)和加強(qiáng)禽類農(nóng)貿(mào)產(chǎn)品的衛(wèi)生管理工作，杜絕沙門氏菌的產(chǎn)生源頭。另外，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)該科學(xué)用藥，如采取交替用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等方式，有條件的最好結(jié)合實(shí)驗室藥物敏感試驗選擇所用的藥物，以避免或減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

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（責(zé)任編輯 董曉云）

中圖分類號：S836

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3322－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.035

收稿日期：2016－05－12

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201403054）；廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項資金（pdjh2016a0072）

作者簡介：梁德媚（1992－），女，廣東云浮人，學(xué)士，研究方向：細(xì)菌傳染病，E－mail：wyyxldm＠163.com

通信作者：＊張建民（1983－），河南內(nèi)黃人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物傳染病，E－mail：junfeng－v＠163.com

Isolation，Identification and Analysis of Serotype and Drug Resistance ofSalmonellafrom Pigeon in Shanghai

LIANG De－mei1，XU Xue－bin2，WANG Wei－fang3，ZHAN Ze－qiang1，REN Xing－xing1，LIN Jia－te1，LIAO Ming1，ZHANG Jian－min1＊
（1.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；2.ShanghaiCenterforDiseaseControl，Shanghai200336，China；3.GuangzhouAnimalHusbandryand
VeterinaryStationofHighRiverTowninBaiyunDistrict，Guangzhou510450，China）

Abstract：The purpose of this study was to investigate the molecular types and antimicrobial resistance ofSalmonellaisolated from pigeon in Shanghai from 2011to 2014.A total of 92fecal samples were collected from markets.XLD plate andSalmonellachromogenic medium were used to isolate suspectedSalmonellacolonies，and then determined the number ofSalmonellathrough gram staining and biochemical tests.Among them，24（26.1%）were positive forSalmonella.Kauffmann－White method and the K－B method were used respectively for serotype identification and susceptibility testing.In result，serological identification showed that 24isolates from pigeon could be divided into 3serotypes includingS.typhimurium（66.7%），S.agona（25.0%）andS.corvallis（8.3%）.Drug susceptibility test showed that 75.0%of the isolates were resistant to one antibiotic at least.The highest level resistance were found for tetracycline as well as sulfisox－azole（62.5%），followed by streptomycin（58.3%），nalidixic acid（50.0%）and ampicillin（20.8%）.Multi－drug resistant strains accounted for 62.5%（15），in which the largest number of strains（7，16.7%）were resistant to four drugs.In addition，isolates were 100.0%susceptible to cefepime，cefotaxime，ceftazidime，imipenem and ofloxacin，but 12.5%were moderately sensitive to the amoxicillin／clavulanic acid and ciprofloxacin.The study showed thatSalmonellahad a high separation rate of pigeon in Shanghai farmers market and performed serious multidrug resistance，which would bring great challenges and risks to the prevention and control ofSalmonellain food，so that the prevalence and drug resistance ofSalmonellain pigeon deserved close attention.

Key words：pigeon；Salmonella；serotype；drug resistance