牦牛源牛鏈球菌的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究

張興民，張煥容，湯 承，諸明欣

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041）

牦牛源牛鏈球菌的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究

張興民，張煥容＊，湯 承，諸明欣

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041）

摘 要：本研究旨在從腹瀉牦牛糞便中分離鑒定牛鏈球菌，并分析其溶血性、對(duì)小鼠的致病性及對(duì)抗菌藥物的敏感性。將川西北阿壩州45份腹瀉牦牛糞便于血平板上劃線，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h分離細(xì)菌，經(jīng)16SrRNA序列擴(kuò)增測序和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定出14株牛鏈球菌，其中8株巴黎鏈球菌，6株解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種；9株呈α溶血，5株呈β溶血。分離鑒定的牦牛源巴黎鏈球菌和解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種能引起試驗(yàn)小鼠的輕度腹瀉；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離菌株對(duì)青霉素、頭孢噻肟、萬古霉素、乙酰螺旋霉素、環(huán)丙沙星、利福平、替考拉寧、氨芐西林和慶大霉素共9種抗生素高度敏感，對(duì)鏈霉素、卡那霉素、林可霉素、紅霉素、四環(huán)素和克林霉素耐藥率較高。本研究闡明了牦牛源鏈球菌的部分生物學(xué)特性，為該病的防控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牦牛；牛鏈球菌；分離鑒定；耐藥性

牦牛是中國青藏高原特有的牛科中的獨(dú)立物種，一般生活在2 500m以上的高寒地區(qū)［1］，牦牛腹瀉是危害牦牛健康的主要疾病之一，細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原感染是主要原因［2］。鏈球菌是化膿性球菌中的一種常見細(xì)菌，分布十分廣泛，該菌呈圓形或卵圓形，多呈鏈狀排列，可分為α型、β型和γ型3種溶血類型，可感染人和多種動(dòng)物，并引起一定的病理變化［3－4］。牛鏈球菌是動(dòng)物消化道內(nèi)的正常菌群，常見于牛的胃腸道和糞便，也可從犬、大熊貓、羊和人的胃腸道和糞便中分離到［5－10］。一直以來，牛鏈球菌被認(rèn)為是一種無害的細(xì)菌，但1945年，Mc－Neal和Blevins首次報(bào)道牛鏈球菌可引起感染性心內(nèi)膜炎，1951年，McCoy又第一次提出D群鏈球菌與感染性心內(nèi)膜炎及結(jié)腸癌之間存在相關(guān)性，且這種相關(guān)性也被隨后的研究證實(shí)，據(jù)報(bào)道，牛鏈球菌可引起鴿子敗血癥，造成鴿子不能飛行，食欲減退，消瘦，多尿，產(chǎn)生綠色黏液性排泄物甚至急性死亡［11］。因此，人們?nèi)找嬲J(rèn)識(shí)到牛鏈球菌的危害，并展開深入研究。

根據(jù)牛鏈球菌能否發(fā)酵甘露醇將其分為2個(gè)生物型，能發(fā)酵甘露醇的菌株稱生物Ⅰ型，不能發(fā)酵甘露醇的菌株稱生物Ⅱ型。1990年，Osawa研究表明牛鏈球菌生物Ⅰ型能將產(chǎn)生的單寧酶脫羧為沒食子酸，因此，稱牛鏈球菌生物Ⅰ型菌株為解沒食子酸鏈球菌。牛鏈球菌生物Ⅱ型又分為生物Ⅱ／1和生物Ⅱ／2。生物Ⅱ／1包括甘露醇和β－葡糖苷酸酶陰性、α－半乳糖苷酶陽性的菌株。生物Ⅱ／2包括甘露醇陰性、β－葡糖苷酸酶和β－甘露糖苷酶陽性的菌株。根據(jù)生化特性及16SrRNA測序的差異可將牛鏈球菌分為6個(gè)亞種：解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種、解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種、解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種、嬰兒鏈球菌結(jié)腸亞種（巴黎鏈球菌）及不解乳鏈球菌［12］。目前，對(duì)牦牛源牛鏈球菌的研究較少。本研究從腹瀉牦牛糞便中分離鑒定牛鏈球菌，并對(duì)其溶血性、致病性和耐藥性進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1樣品來源

2015年6月初采自四川阿壩州的1～2月齡腹瀉牦犢牛糞便樣品45份，干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑和試驗(yàn)動(dòng)物

綿羊血瓊脂平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNA Marker均購自TaKaRa公司；青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、利福平、萬古霉素、替考拉寧和四環(huán)素共15種藥敏片均購自杭州微生物試劑有限公司；MH藥敏瓊脂、胰蛋白胨大豆胨瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。18～22g昆明小鼠購自四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3細(xì)菌的分離純化

取約1g糞便樣品用無菌生理鹽水稀釋至1mL，充分震蕩混勻后取200μL混懸液經(jīng)劃線法無菌接種于綿羊血瓊脂平板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落純化培養(yǎng)。挑取可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的染色情況及細(xì)菌形態(tài)。

1.4加熱法提取細(xì)菌DNA

參照王瓊等［13］取培養(yǎng)16h的TSB含菌培養(yǎng)液1mL于1.5mL EP管中，12 000r／min離心2min，棄上清液。加入500μL TE緩沖溶液充分洗滌菌體，離心棄上清；加入1mL TE緩沖溶液重懸菌體，渦旋使菌體充分混勻，將懸液分裝于200μL的PCR管中，用微波爐加熱60s，12 000r／min離心2min，取上層液即為提取的細(xì)菌DNA，－20℃保存。

1.5分離菌PCR擴(kuò)增鑒定

采用革蘭氏陽性菌16SrRNA基因通用引物［14］PCR擴(kuò)增16SrRNA序列并測序鑒定，采用鏈球菌特異性引物PCR擴(kuò)增鑒定分離菌。引物信息見表1。引物均由成都擎科生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系25μL：DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，ExTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.2μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，16℃暫存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收，送成都擎科生物工程有限公司測序。

1.6系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用BLAST軟件將測序獲得的細(xì)菌16SrRNA序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的8株牛鏈球菌（表2）序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并從GenBank中下載序列相似性最大的其他動(dòng)物或植物來源的同種細(xì)菌的16SrRNA序列，運(yùn)用Mega 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2　參考菌株信息表Table 2 Essential information of reference strains

1.7溶血試驗(yàn)

將純化后的菌株接種于血平板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況及溶血特性。

1.8致病性試驗(yàn)

取分離鑒定的菌株各1株培養(yǎng)后，用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)并調(diào)整菌液濃度至1×109CFU／mL，15只18～22g昆明小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，其中1個(gè)對(duì)照組，2個(gè)試驗(yàn)組，試驗(yàn)組每只小鼠灌服0.2mL菌液，對(duì)照組每只小鼠灌服0.2mL TSB培養(yǎng)基，觀察小鼠的臨床表現(xiàn)，若有發(fā)病小鼠，剖檢觀察小鼠的病變情況。

1.9藥敏試驗(yàn)

參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，采用K－B紙片法做藥敏試驗(yàn)，檢測分離菌對(duì)臨床常用藥物的敏感性。取0.5麥?zhǔn)蠁挝痪海ê繛?× 105～2×105CFU／mL）500μL均勻涂布于含5%犢牛血清的MH藥敏瓊脂平板上，貼上藥敏片，37℃恒溫培養(yǎng)18h后測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

45份腹瀉牦牛糞便中共分離到31株革蘭氏陽性且呈鏈狀排列的細(xì)菌，呈圓形或卵圓形（圖1）。分離菌在TSA培養(yǎng)基上37℃、5%CO2培養(yǎng)24h可見灰白色、圓形、中央隆起、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落（圖2）。分離菌與牛鏈球菌菌落形態(tài)相似。

2.2分離菌16SrRNA序列PCR擴(kuò)增和測序鑒定

從31株分離菌中均擴(kuò)增獲得了長度約為1 500bp的片段，經(jīng)測序分析，其中14株與Gen－Bank中牛鏈球菌（Streptococcusbovis）的同源性最高，相似性為99.4%～99.8%；這14株菌的16SrRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致（圖3）。序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示分離的31株細(xì)菌中，8株與巴黎鏈球菌（Streptococcuslutetiensis）的同源性最高，相似性為99.6%～99.8%；6株與解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種（Streptococcus gallolyticus）的同源性最高，相似性為99.4%～99.8%。

2.3分離菌鏈球菌特異性片段PCR擴(kuò)增鑒定

由圖4可知，從31株分離菌中均擴(kuò)增獲得了長度約為600bp的鏈球菌特異性引物擴(kuò)增片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。結(jié)果表明，分離到的31株細(xì)菌均為鏈球菌。

2.4牛鏈球菌16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

本試驗(yàn)鑒定出的14株牛鏈球菌16SrRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和同源性比對(duì)結(jié)果見圖5、6。14株牛鏈球菌與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的8株牛鏈球菌聚類后分成兩個(gè)主要分支，菌株代號(hào)1、15、30、18、19、17、23和27的8株巴黎鏈球菌與StreptococcuslutetiensisKU693335.1、StreptococcusequinusKP703862.1、Streptococcussp KU533881.1、Streptococcussp HQ717303.1、StreptococcuslutetiensisKU693335.1聚在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系較近，同源性高達(dá)99.4%～99.8%。而菌株代號(hào)6、7、11、21、26和24的6株解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種分離株與StreptococcuspasteurianusEF670543.1、StreptococcusmacedonicusLC097080.1、Streptococcussp KU533869.1聚為一支，親緣關(guān)系較近，同源性高達(dá)99.4%～99.8%。

圖1　革蘭氏陽性鏈球菌（1 000×）Fig.1 Gram－positiveStreptococci（1 000×）

圖2　分離菌菌落特征Fig.2 Colony morphology characteristics of the isolates

圖3　14株分離菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 16SrRNA PCR amplification products of the 14isolated strains

圖4　鏈球菌特異性片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification result ofStreptococcusspecific fragment

圖5　牛鏈球菌分離株與GenBank相關(guān)菌株的16SrRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 16SrRNA gene phylogenic tree of the isolatedStreptococcusstrains and the GenBank recordedStreptococcusbovis

2.5 溶血試驗(yàn)結(jié)果

14株鑒定為牛鏈球菌的菌株中有9株呈α溶血，5株呈β溶血。

2.6牛鏈球菌分離株對(duì)小鼠的致病性

小鼠灌服牦牛源巴黎鏈球菌和解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種6h后開始出現(xiàn)精神萎靡，被毛聳立，蜷縮一隅等臨床癥狀，12h后出現(xiàn)輕度的腹瀉癥狀，剖檢見小鼠腸壁變薄，腸內(nèi)有黃色黏液。其余組織或器官未見肉眼可見的病變。結(jié)果表明，分離到的巴黎鏈球菌和解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種具有致病性。

2.7牛鏈球菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

14株牛鏈球菌對(duì)青霉素、頭孢噻肟、萬古霉素、乙酰螺旋霉素、環(huán)丙沙星、利福平、替考拉寧和氨芐西林共8種抗菌藥物100%高度敏感。對(duì)慶大霉素和四環(huán)素的高敏率分別為86.6%和33.3%。對(duì)鏈霉素、卡那霉素、林可霉素、紅霉素和克林霉素的耐藥率較高分別達(dá)到60.0%、73.3%、66.7%、46.7%和53.3%（表3）。

表3　牛鏈球菌的藥物敏感性結(jié)果（%）Table 3 Drug sensitivity results ofStreptococcusbovis

3 討 論

牛鏈球菌是人畜共患病病原，食品中牛鏈球菌的污染率為3%～5%［15］，人類多因食入被該菌污染的食物引起腹瀉，心內(nèi)膜炎和結(jié)腸癌等，被普遍認(rèn)為是引起人結(jié)腸炎的主要致病菌。Paritsky等［16］從203名結(jié)腸炎患者糞便中分離牛鏈球菌，49例（27%）患者攜帶該菌，其次牛鏈球菌中的巴黎鏈球菌和解沒食子酸鏈球菌是引起嬰兒腹瀉的重要病原菌［17］，所以該菌具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

16SrRNA基因是核糖體RNA基因中的一員，具有進(jìn)化速率慢、序列保守性高的特點(diǎn)，但同時(shí)由于各種原因其序列又有一定的突變，具有種屬差異，因而廣泛用于種屬鑒定及分子分型［18］。本研究采用了細(xì)菌16SrRNA基因及序列測定對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定。從分子水平上進(jìn)一步證實(shí)從45份牦犢牛糞便中分離的14株牛鏈球菌中8株為牛鏈球菌中的巴黎鏈球菌，6株為解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種。隨機(jī)選取巴黎鏈球菌和解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種各1株感染試驗(yàn)小鼠后，引起了小鼠的輕微腹瀉。Paiva等［19］從反芻動(dòng)物胃腸道中分離的巴黎鏈球菌感染小鼠，也引起小鼠小腸形態(tài)的改變。

本研究分離鑒定的14株牦牛源牛鏈球菌中9株為α溶血，5株為β溶血。通常認(rèn)為β溶血的細(xì)菌為致病菌，α溶血的細(xì)菌為條件致病菌。牦牛源牛鏈球菌的溶血特性提示應(yīng)注意該類細(xì)菌的致病作用及這兩種病原菌的潛在危害。

Leclercq等［20］報(bào)道，分離自美國患者的46株牛鏈球菌對(duì)青霉素、利福平、萬古霉素、替考拉寧、氨芐青霉素高度敏感。本研究中14株分離菌對(duì)青霉素、頭孢噻肟、萬古霉素、乙酰螺旋霉素、環(huán)丙沙星、利福平、替考拉寧和氨芐西林8種抗菌藥物100%高度敏感，與Leclercq等［20］的報(bào)道一致。2014年，Sheng等［21］從患者血液培養(yǎng)物中分離的60株牛鏈球菌有38株對(duì)卡那霉素和克林霉素呈現(xiàn)交叉耐藥，本研究中14株分離菌對(duì)卡那霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%和53.3%。

4 結(jié) 論

本研究通過分離鑒定牛鏈球菌，分析其溶血性、對(duì)小鼠的致病性及對(duì)抗菌藥物的敏感性，闡明了牦牛源鏈球菌的部分生物學(xué)特性，為該地區(qū)牛鏈球菌性腹瀉的臨床治療及防控提供一定科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 董曉云）

中圖分類號(hào)：S823.8＋5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3314－08

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.034

收稿日期：2016－04－15

基金項(xiàng)目：西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2016SZ092）；國家民委科技項(xiàng)目（14XNZ025）

作者簡介：張興民（1990－），男，甘肅張掖人，碩士，研究方向：畜禽傳染病診斷與防制，E－mail：2197345890＠qq.com

通信作者：＊張煥容（1968－），女，重慶江津人，博士，教授，研究方向：畜禽傳染病診斷與防制，E－mail：zhrong05＠163.com

Isolation，Identification and Biological Characteristics Research ofStreptococcusbovisfrom Yak

ZHANG Xing－min，ZHANG Huan－rong＊，TANG Cheng，ZHU Ming－xin
（CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China）

Abstract：The objective of this study was to isolate and identifyStreptococcusbovisfrom yak，and detect their hemolytic，pathogenicity and antimicrobial susceptibility.45fecal samples collected from the diarrheal yaks in Aba state in Northwest Sichuan province were used to isolateStreptococcusboviswith sheep blood culture media under 37℃and 5%CO2condition cultured for 24h.The isolated bacteria were identified by 16SrRNA amplification and sequencing.Total 14Streptococcusboviswere identified，among which，8Streptococcuslutetiensisstrains and 6Streptococcus gallolyticusstrains.9Streptococcusbovisstrains showedαhemolytic，and 5Streptococcus bovisshowedβhemolytic.BothStreptococcuslutetiensisandStreptococcusgallolyticuscaused the experimental mice mild diarrhea.The isolated 14Streptococcusboviswere sensitive to penicillin，cefotaxime，vacomycin，acetylspiramycin，ciprofloxacin，rifampicin，teicoplanin，ampicillin and gentamicin，and highly tolerant to streptomycin，kanamycin，lincomycin，erythrocin，tetracycline and clindamycin.This study illustrated the biological characteristics of the isolatedStreptococcusbovisfrom yak，which made the basis for the prevention and control of diseases caused byStreptococcusbovis.

Key words：yak；Streptococcusbovis；isolation and identification；antimicrobial susceptibility