豬A群輪狀病毒BJ株的分離與鑒定

原 霖，韓 燾，倪建強(qiáng)，亢文華，汪葆玥，李曉霞，陳亞娜，翟新驗，沈建忠

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，OIE豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗室，北京102618）

豬A群輪狀病毒BJ株的分離與鑒定

原 霖1，2，韓 燾2，倪建強(qiáng)2，亢文華2，汪葆玥2，李曉霞2，陳亞娜2，翟新驗2，沈建忠1＊

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，OIE豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗室，北京102618）

摘 要：輪狀病毒是引起幼齡動物和兒童病毒性腹瀉的主要病原，輪狀病毒的分離鑒定為該病的流行病學(xué)調(diào)查和分子生物學(xué)特性研究奠定了基礎(chǔ)。本研究采集北京某豬場腹瀉發(fā)病仔豬腸內(nèi)容物，將其接種MA104細(xì)胞，分離得到一株能產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變的病毒。對分離毒株進(jìn)行膠體金、實(shí)時熒光定量RT－PCR和免疫熒光等方法鑒定，并對分離毒株的VP4、VP6和VP7基因進(jìn)行測序及序列分析。結(jié)果表明，分離毒株為豬A群輪狀病毒。按照A群輪狀病毒的最新分類方法，確定該分離株VP4、VP6和VP7基因的基因型分別為P［13］型、I5型和G11型。因此，將該分離株命名為Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］。

關(guān)鍵詞：豬輪狀病毒；分離；鑒定

輪狀病毒（rotavirus，RV）為雙股RNA病毒，由11個雙鏈RNA組成，是引起多種新生動物和幼齡動物腹瀉的重要腸道病原，也是引起哺乳和斷奶仔豬胃腸炎的常見病因［1］。輪狀病毒最先發(fā)現(xiàn)于犢牛［2］，之后在人［3］、豬［4］和其他動物［5－6］中也檢測到。豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）分為A、B、C、E 4種血清群，其中A群輪狀病毒最為常見且與人和豬的腹瀉相關(guān)［7－8］。許多研究均已表明輪狀病毒在不同物種之間可進(jìn)行種間傳播和基因重排。Martella等［9］報道在豬群中分離到牛輪狀病毒。Varghese等［10］發(fā)現(xiàn)印度暴發(fā)的豬輪狀病毒腹瀉由人輪狀病毒RNC321株引起。更多的研究［10－11］表明豬輪狀病毒和人輪狀病毒毒株之間存在基因重排，且基因重排的輪狀病毒可引起人的腹瀉［12］。因此豬輪狀病毒的研究具有重要的公共衛(wèi)生方面的意義。

根據(jù)2013年世界Rotavirus Classification Working Group第6次會議確定的最新分類方法，以及外衣殼蛋白VP4、VP7和VP6基因序列，A群輪狀病毒存在27個G基因型、37個P基因型和18個I基因型。國內(nèi)學(xué)者報道分離到豬輪狀病毒［13－20］。本研究從腹瀉仔豬糞便中分離得到一株豬輪狀病毒，并確定為豬A型輪狀病毒G11P［13］型，為后續(xù)的防控技術(shù)和致病機(jī)理方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 病料來自北京房山某豬場出現(xiàn)腹瀉癥狀仔豬的腸內(nèi)容物。

1.1.2細(xì)胞 MA104細(xì)胞由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心保存。

1.1.3試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司；Anigen Rapid Rota Ag Test Kit購自安捷公司；抗A型輪狀病毒單克隆抗體購自Ingenasa公司；FITC標(biāo)記的兔抗鼠抗體購自Sigma公司。RNeasy?Mini Kit購自Qiagen公司；pEASY－T3Cloning Kit試劑盒、Trans－T1感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金公司；豬輪狀病毒實(shí)時熒光RT－PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨有限公司。

1.2方法

1.2.1病料處理 取小腸和糞便用1%PS DMEM洗2遍，然后剪碎研磨成糊狀，加入無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，制成10%組織懸液，4℃、10 000r／min離心15min，吸取上清液，用0.2μm微孔針頭濾器過濾。于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病毒接種 在病毒液中加入終濃度為10μg／mL的胰酶，37℃水浴30min。待MA104細(xì)胞生長至90%以上單層時（傳代12～24h）棄去培養(yǎng)液，用無血清的DMEM洗2遍。按培養(yǎng)液量的10%接種樣品。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1h。棄去病毒液，補(bǔ)加無血清的DMEM。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變（CPE），72h后，放入－20℃冰箱，凍融3次，每次凍融過程中劇烈晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞瓶底部培養(yǎng)物脫落。混合收獲的病毒液，12 000r／min離心10min，收集上清液。盲傳5代后，病毒液分裝，于－80℃保存。

1.2.3膠體金檢測 采用Anigen Rapid Rota Ag Test Kit對收獲的病毒液進(jìn)行檢測。將收獲的病毒液加入膠體金的樣品孔內(nèi)，靜置5min判定結(jié)果。

1.2.4免疫熒光檢測 將MA104細(xì)胞以2× 105個／mL接種于6孔板內(nèi)，24h后按1.2.2方法進(jìn)行病毒接種，同時設(shè)細(xì)胞對照。24h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，然后加入固定液，室溫靜置10min。吸出固定液，每孔用PBS洗滌2遍，加入1%馬血清37℃封閉20min。棄去封閉液加入輪狀病毒單克隆抗體37℃孵育30min。棄液，用PBS洗2遍，加入FITC標(biāo)記兔抗鼠二抗，37℃孵育30min。棄液，PBS洗2遍。加入PBS在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測 將病毒液按RNeasy?Mini Kit說明書提取RNA，以提取的RNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT－PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25μL：無菌無核酸酶水7μL，RT－PCR反應(yīng)液12.5μL，酶混合液1μL，熒光探針2.5μL，模板2μL。反應(yīng)條件：42℃5min；95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s，60℃退火35s，共40次。

1.2.6引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中收錄的豬A群輪狀病毒VP4、VP6和VP7基因序列及已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)［21］，設(shè)計3對引物，分別用于分離病毒VP4、VP6和VP7基因的擴(kuò)增，引物信息見表1。引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2.7RT－PCR擴(kuò)增 將病毒液按RNeasy?Mini Kit說明書進(jìn)行RNA的提取。然后進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。RT－PCR反應(yīng)體系50μL：5×Green Buffer 10μL，2.5mmol／L dNTPs 5μL，5U／μL GoTaqDNA聚合酶2μL，10U／μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.6μL，40U／μL RNA酶抑制劑0.4μL，10μmol／L上、下游引物各2.5μL，RNA模板4μL，ddH2O 23μL。RTPCR反應(yīng)條件：42℃60min；95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸2.5min（VP4）（VP6 1.5min、VP7 1min）35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物暫放4℃保存。將電泳后正確的產(chǎn)物切下，用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit試劑盒回收目的DNA片段。將回收的DNA片段與pEASY－T3載體相連。最后進(jìn)行菌落PCR鑒定。將鑒定正確的單菌落送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

表1　引物信息Table 1 Primer information

1.2.8基因型鑒定與序列分析 將分離株VP4、VP6和VP7基因測序的結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對。根據(jù)最新的輪狀病毒分類方法，VP4和VP7基因核苷酸同源性大于80%，VP6基因核苷酸同源性大于85%為同一基因型，確定分離株各基因的基因型。從GenBank中選取輪狀病毒不同基因型的毒株，使用Mega軟件繪制VP4、VP6和VP7基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析分離株進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞病變結(jié)果

將病毒在MA104細(xì)胞盲傳至第5代，接毒后48h細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變。正常MA104細(xì)胞生長良好，形態(tài)清晰（圖1A）。接種病毒后的MA104細(xì)胞固縮，顆粒增多，最后細(xì)胞崩解脫落（圖1B）。

圖1　細(xì)胞病變結(jié)果（200×）Fig.1 Results of CPE（200×）

2.2膠體金檢測結(jié)果

將病毒液加入膠體金的樣品孔內(nèi)，5min后膠體金上“C”和“T”均出現(xiàn)色帶，表明試驗結(jié)果成立，病毒液中含有輪狀病毒抗原。

2.3間接免疫熒光檢測結(jié)果

將病毒進(jìn)行間接免疫熒光試驗（IFA），在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞對照孔內(nèi)未見熒光，背景干凈（圖2A）；感染的細(xì)胞胞漿內(nèi)有綠色熒光（圖2B），結(jié)果表明MA104細(xì)胞漿內(nèi)含有輪狀病毒。

2.4實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測結(jié)果

將病毒液進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT－PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知，陰性對照無Ct值，無特定擴(kuò)增曲線；病毒液Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明，病毒液中含有輪狀病毒特異性的核酸片段。

圖2　IFA檢測結(jié)果（200×）Fig.2 Results of IFA（200×）

圖3　實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測結(jié)果Fig.3 The results of Real－time RT－PCR

2.5RT－PCR鑒定

提取分離株基因組進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示在約2 000、1 500和1 000bp處存在目的條帶（圖4），分別與預(yù)期VP4（2 362bp）、VP6（1 356bp）和VP7（1 062bp）基因片段大小相符。將鑒定正確的菌落測序，初步鑒定分離株為豬輪狀病毒，簡稱為BJ株。

2.6基因型鑒定與序列分析

豬輪狀病毒的VP4基因決定P基因型的分型。分離株VP4基因與豬A型輪狀病毒FGP36日本株和RVA／Pig－wt／BEL／12R041／2012／G9P［13］比利時株同源性為90.0%和89.0%，這兩毒株均為P［13］基因型，核苷酸同源性大于80.0%，因此分離株為P［13］型（圖5）。

圖4　輪狀病毒VP4、VP6、VP7基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 RT－PCR amplification ofVP4，VP6andVP7genes of RV

圖5　輪狀病毒VP4基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the full length nucleotide sequences ofVP4gene from RV

豬輪狀病毒的VP6基因為群抗原，具有群特異性，基因分型為I。分離株VP6基因與豬A型輪狀病毒TA－4－1中國株和RVA／Pig－wt／THA／CMP40／08／2008／G3P［23］泰國株同源性分別為97.0%和 94.0%，毒株均為豬A型輪狀病毒I5型，核苷酸同源性大于85.0%，因此分離株為豬A型輪狀病毒I5型（圖6）。

圖6　輪狀病毒VP6基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of full length nucleotide sequences ofVP6gene from RV

豬輪狀病毒的VP7基因決定G基因型的分型。分離株VP7基因與豬A型輪狀病毒ZJhz13－3中國株和Rotavirus A EC2184／ECU／G11P［6］厄瓜多爾株的同源性分別為96.0%和92.0%，毒株均為A型輪狀病毒G11型，基因核苷酸同源性大于85.0%，因此分離株為G11型（圖7），經(jīng)序列比對分析確定該分離株名稱為Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］。

圖7　輪狀病毒VP7基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of full length nucleotide sequences ofVP7gene from RV

3 討 論

豬輪狀病毒最初適應(yīng)在經(jīng)胰酶預(yù)處理的豬原代腎細(xì)胞上培養(yǎng)。Bohl等［22］用非洲猴腎細(xì)胞系MA104成功對輪狀病毒進(jìn)行體外分離。后來相繼有研究者使用人克隆細(xì)胞CaCo－2［23］、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero［24］、恒河猴胎腎細(xì)胞Marc－145［13］、豬小腸細(xì)胞IRBSⅡ等成功分離到輪狀病毒。胰酶是輪狀病毒分離中重要的物質(zhì)因素，輪狀病毒難以在細(xì)胞上培養(yǎng)是由于RVVP4蛋白能抑制病毒感染力。胰酶能裂解輪狀病毒外衣殼蛋白VP4并產(chǎn)生新的蛋白VP5（羧基端）和VP8（氨基端），從而使病毒具有了感染宿主細(xì)胞的能力［25］。感染前用胰酶進(jìn)行預(yù)處理使病毒活化，也可在病毒吸附后把胰酶加入無血清的培養(yǎng)基中［1］。

Papp等［26］統(tǒng)計了1976—2011年間公開發(fā)表的關(guān)于豬A型輪狀病毒的文章，統(tǒng)計結(jié)果顯示，在全球范圍內(nèi)所有G基因型的毒株所占比例：G5（45.8%）、G3（11.2%）、G4（9.6%）；在全球范圍內(nèi)所有P基因型的毒株所占比例：P［7］（47.4%）、P［6］（15.9%）、P［13］（3.2%）。在亞洲地區(qū)G基因型的毒株所占比例：G5（29.4%）、G3（25.4%）、G9（11.37%）；在亞洲地區(qū)P基因型的毒株所占比例：P［7］（41.6%）、P［6］（9.92%）、P［23］（8.73%）。G5P［7］是流行最廣泛的毒株。本研究分離株G11基因型亞洲由于未報道無法統(tǒng)計，占美洲報道的1.89%，歐洲報道的2.17%，分離株P(guān)［13］占亞洲報道的5.95%，占美洲報道的0.46%，占?xì)W洲報道的8.06%。由此可知，分離株G11P［13］基因型無論在亞洲還是全球分布都較少。

本研究中的分離株VP4基因與豬A型輪狀病毒FGP36日本株核苷酸同源性為90.0%，VP6基因與2015年提交序列的豬A型輪狀病毒TA－4－1中國株核苷酸同源性為97.0%，VP7基因與2012年提交序列的豬A型輪狀病毒ZJhz13－3中國株核苷酸同源性為96.0%。分離株除VP4基因與日本株同源性較高外，VP6和VP7基因均與中國分離株具有很高的同源性，但由于這兩株分離株在Gen－Bank上只分別提交了VP6或VP7的基因序列，無法與這兩株病毒進(jìn)行全面的序列比對。

4 結(jié) 論

本研究為中國豬輪狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查和防控奠定了基礎(chǔ)。但分離株Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］在全國的流行情況及與國內(nèi)其他毒株的同源性還需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 董曉云）

中圖分類號：S852.65＋9.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3306－08

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.033

收稿日期：2016－05－11

基金項目：科技部科技基礎(chǔ)性工作專項——動物及動物產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制（2013FY113300－6）

作者簡介：原 霖（1982－），男，遼寧鞍山人，碩士，研究方向：動物疫病診斷技術(shù)研究，E－mail：6428949＠163.com

通信作者：＊沈建忠（1963－），男，浙江桐鄉(xiāng)人，博士，研究方向：動物及動物性食品中病原生物耐藥性機(jī)理研究，E－mail：sjzh＠cau.edu.cn

Isolation and Identification of Porcine Group A Rotavirus BJ Strain

YUAN Lin1，2，HAN Tao2，NI Jian－qiang2，KANG Wen－h(huán)ua2，WANG Bao－yue2，LI Xiao－xia2，CHEN Ya－na2，ZHAI Xin－yan2，SHEN Jian－zhong1＊
（1.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.OIEReferenceLaboratoryforPorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，ChinaAnimalDisease PreventionandControlCenter，Beijing102618，China）

Abstract：Rotavirus infections are a major cause of viral diarrheas in young animals and children.Isolation and identification of rotavirus make a contribution to epidemiological survey and molecular biology study.A strain of porcine rotavirus was isolated in MA104cell cultures from the intestinal contents of piglets with diarrhea in Beijing.The virus was identified to be porcine rotavirus by immunochromatography strip test，Real－time RT－PCR，immunofluorescence test and sequencing analysis.According to the sequence analysis，the virus was classified as group A porcine rotavirus，the genotype ofVP4，VP6andVP7genes belonged to P［13］，I5and G11，respectively.The virus was designated Rotavirus A pig／China／BJ／2015／G11P［13］.

Key words：porcine rotavirus；isolation；identification