基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速鑒定蠟樣芽胞桿菌研究與應用

江連洲，曹飛揚，陳穎，王娉，趙曉美

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030；2.中國檢驗檢疫科學研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100176）

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速鑒定蠟樣芽胞桿菌研究與應用

江連洲1，曹飛揚1，陳穎2，王娉2，趙曉美2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030；2.中國檢驗檢疫科學研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100176）

建立基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)針對食源性蠟樣芽胞桿菌快速鑒定方法。以蠟樣芽胞桿菌模式菌株為研究對象，優(yōu)化該菌樣品處理方法，并選取17株蠟樣芽胞桿菌標準菌株補充MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫，探討方法靈敏度、穩(wěn)定性和準確性。結(jié)果表明，蠟樣芽胞桿菌最佳樣品處理方法是甲酸提取法，數(shù)據(jù)庫補充可提高該菌鑒定可信度，MALDI-TOF-MS鑒定方法準確度高、穩(wěn)定性好，靈敏度為104cfu并通過聚類分析分型。研究確定的MALDI-TOF-MS鑒定方法準確快速，可為食源性蠟樣芽胞桿菌快速鑒定和分型提供技術(shù)支持。

蠟樣芽胞桿菌；MALDI-TOF-MS；鑒定；快速；準確

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是革蘭氏陽性菌，為芽胞桿菌屬，兼性需氧。蠟樣芽胞桿菌在水、空氣、土壤中廣泛存在，食品中易檢出[1-4]。感染該菌后可導致胃腸功能紊亂、各種局部或全身性感染，如壞死性腸炎、肝功能衰竭、菌血癥和腦膜炎[5-8]。

目前，蠟樣芽胞桿菌鑒定以傳統(tǒng)生化鑒定為主，該方法操作繁瑣、耗時長、鑒定結(jié)果滯后[9]，分子鑒定方法有PCR、環(huán)介導等溫擴增、16S rRNA測序技術(shù)等[10-13]。但PCR鑒定方法無統(tǒng)一目的基因，不易實現(xiàn)標準化[14]；環(huán)介導等溫擴增技術(shù)靈敏度較高，易被污染，產(chǎn)生假陽性結(jié)果；16S rRNA測序技術(shù)難以實現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌群內(nèi)種間區(qū)分?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionisation time of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）為基于細菌蛋白質(zhì)（2～20 ku）菌種鑒定方法，將一定比例微生物樣品和基質(zhì)溶液點樣到靶板上，溶劑揮發(fā)后激光轟擊，基質(zhì)吸收能量后轉(zhuǎn)移到微生物樣品解吸，通過飛行時間檢測器分離質(zhì)荷比（m/z）不同的離子，采集質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫比對獲得鑒定結(jié)果[15]。MALDI-TOF-MS方法具有操作簡單、快速、高通量、準確度高等優(yōu)點，適合病原微生物診斷和監(jiān)測。但MALDITOF-MS鑒定結(jié)果受樣品處理方法、數(shù)據(jù)庫完善程度等因素影響，為保證鑒定結(jié)果準確度，需優(yōu)化影響因素[16-18]。Matsuda等研究臨床葡萄球菌MALDITOF-MS菌種鑒定方法，發(fā)現(xiàn)樣品制備方法是影響蛋白圖譜重要因素，不同樣品制備方法差異顯著（P＜0.05）[19]；陳秀金等以沙門氏菌為研究對象，探究不同樣品處理方法對MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果影響，發(fā)現(xiàn)不同樣品處理方法對蛋白指紋圖譜影響較大[20]。

本文通過蠟樣芽胞桿菌樣品處理方法優(yōu)化及數(shù)據(jù)庫補充，建立蠟樣芽胞桿菌MALDI-TOF-MS鑒定方法，確定該方法靈敏度及穩(wěn)定性，比較生化鑒定結(jié)果，以期為蠟樣芽胞桿菌準確快速鑒定和分型提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗菌株為17株國際通用蠟樣芽胞桿菌標準菌株，編號分別為ATCC10702、ATCC10987、 ATCC11950、ATCC12826、ATCC13061、ATCC14579、ATCC14737、ATCC15816、ATCC19637、ATCC21769、ATCC21772、ATCC27348、ATCC27877、ATCC33018、ATCC33019、ATCC49063、ATCC49064，購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。

1.2 食品樣品

大塊腐乳、玫瑰腐乳、白腐乳等腐乳樣品購自北京華聯(lián)超市，涵蓋4個品牌。

1.3 主要試劑與儀器

腦心浸液肉湯（Brain heart infusion,BHI）、營養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar,NA）、腦心浸液瓊脂（Brain Heart infusion agar,BHIA）、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；三氟乙酸（Trifluoracetic acid,TFA）（色譜純）購自德國Merck公司；無水乙醇（色譜純）、甲酸（Formicacid,FA）、乙腈（Acetonitrile,ACN）購自美國Fisher公司；基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-Hydroxy-Cinnamic Acid，HCCA）、肽蛋白標準品購自德國Bruker公司；基質(zhì)和標準品配制溶劑（50%ACN，2.5%TFA，47.5%水）；臺式冷凍離心機（德國Sorvall公司）；PhoenixTM-100全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)（美國BD公司）；AutoflexIII生物質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌株培養(yǎng)

待鑒定蠟樣芽胞桿菌接種BHIA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h。

1.4.2 樣品處理方法選擇

采用直接轉(zhuǎn)移法、擴展直接轉(zhuǎn)移法、甲酸提取法三種樣品處理方法處理蠟樣芽胞桿菌模式菌株ATCC14579培養(yǎng)物，探討不同樣品處理方法對鑒定結(jié)果影響。直接轉(zhuǎn)移法將蠟樣芽胞桿菌模式菌株ATCC14579單菌落在靶板靶點上涂布成一個薄層，覆蓋1 μL HCCA溶液并自然晾干。擴展直接轉(zhuǎn)移法將蠟樣芽胞桿菌模式菌株ATCC 14579單菌落在靶板靶點上涂布成一個薄層，覆蓋1 μL 70%甲酸溶液并自然晾干，再覆蓋1 μL HCCA溶液并自然晾干。甲酸提取法在離心管中加入300 μL去離子水，取蠟樣芽胞桿菌模式菌株ATCC 14579單菌落至離心管中并充分混勻，加入900 μL無水乙醇充分混勻，13 000 r·min-1離心2 min并棄上清，再次離心并用移液器棄上清液，室溫干燥3 min，加入30 μL 70%甲酸溶液并用移液器吸放混勻，加入30 μL純乙腈并用移液器吸放混勻，13 000 r·min-1離心2 min，取1 μL上清點樣至靶板靶點并自然晾干，覆蓋1 μL HCCA溶液并自然晾干。選取可信度分數(shù)高、蛋白質(zhì)峰多、峰強度高、譜圖基線平滑、信噪比高處理方法為最佳。

1.4.3 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)采集及結(jié)果判定

肽蛋白標準品溶液對儀器校準后，運用Flex Control軟件采集樣品數(shù)據(jù)（儀器參數(shù)：Smartbeam激光器；激光頻率200 Hz；每個樣品譜圖累積200個激光脈沖信號；質(zhì)量為2～20 ku），獲得樣品質(zhì)譜圖譜；BioTyper軟件將采集樣品圖譜與數(shù)據(jù)庫中標準圖譜比對，根據(jù)得分判定結(jié)果。得分2.300～3.000表示菌種鑒定可信度較高，2.000～2.299表示保守菌屬鑒定或可能菌種鑒定，1.700～1.999表示可能菌屬鑒定，0.000～1.699表示鑒定結(jié)果不可信。

1.4.4 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫補充及識別能力驗證

以17株國際通用蠟樣芽胞桿菌標準菌株為試驗對象，采用最佳樣品處理方法補充蠟樣芽胞桿菌數(shù)據(jù)庫（原數(shù)據(jù)庫中僅2株蠟樣芽胞桿菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)）。每株標準菌株重復點樣8次，每個靶點采集3張質(zhì)譜圖，使用FlexAnalysis軟件分析獲得24張質(zhì)譜圖，除去低質(zhì)量圖譜，運用BioTyper軟件將＞20張有效圖譜（若＜20張，重復試驗）添加到數(shù)據(jù)庫中。依據(jù)GB 4789.14-2014[21]，選擇不同品牌、不同批次腐乳樣品通過樣品處理、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯選擇性培養(yǎng)、顯色培養(yǎng)基MYP分離純化等分離蠟樣芽胞桿菌，MALDI-TOF-MS對分離41株蠟樣芽胞桿菌疑似菌株（編號為0001～0041）采集數(shù)據(jù)，分別與數(shù)據(jù)庫補充前后標準圖譜比對。

1.4.5 生化鑒定

以BD全自動生化鑒定系統(tǒng)鑒定腐乳中分離的41株蠟樣芽胞桿菌疑似菌株，并與MALDI-TOFMS數(shù)據(jù)庫補充后鑒定結(jié)果比較。

1.4.6 MALDI-TOF-MS鑒定靈敏度及穩(wěn)定性試驗

生理鹽水將蠟樣芽胞桿菌模式菌株ATCC 14579分別稀釋為108～100cfu·mL-1菌液，取1 mL菌液12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，最佳樣品處理方法沉淀菌體，MALDI-TOF-MS鑒定，分析不同數(shù)量蠟樣芽胞桿菌ATCC14579鑒定結(jié)果，測定MALDI-TOF-MS鑒定靈敏度。

將蠟樣芽胞桿菌模式菌株ATCC14579在30℃培養(yǎng)24 h條件下傳代培養(yǎng)3次，每次傳代后均取3個單菌落用最佳樣品處理方法處理，MALDITOF-MS鑒定以比較同批次及不同批次MALDITOF-MS鑒定一致性。

1.4.7 MALDI-TOF-MS分型

運用BioTyper軟件對1.4.4中41株蠟樣芽胞桿菌分離株質(zhì)譜數(shù)據(jù)聚類，分析蠟樣芽胞桿菌分離株型與來源關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方法選擇

不同樣品處理方法影響MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果，選擇適合菌株鑒定樣品處理方法是保證MALDI-TOF-MS鑒定準確前提。三種樣品處理方法下蠟樣芽胞桿菌ATCC14579可信度得分均在2.300以上，說明鑒定結(jié)果可靠。與其他兩種樣品處理方法相比，甲酸提取法可信度得分最高、蛋白峰最多（見表1），蛋白指紋圖譜基線平滑、峰強度高（見圖1），信噪比高，統(tǒng)計學分析結(jié)果表明，甲酸提取法與其他兩種樣品處理方法可信度得分、蛋白峰數(shù)量差異顯著。因此選取甲酸提取法為最佳樣品處理方法。

表1 不同處理方法下MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果Table 1 Detection results of different pre-treatments by MALDI-TOF-MS

圖1 不同處理方法對蠟樣芽胞桿菌蛋白指紋圖譜影響Fig.1 Effect of different pre-treatments on protein mass spectrometric profiles ofBacillus cereus

2.2 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫補充及識別能力驗證

微生物通過MALDI-TOF-MS采集數(shù)據(jù)后，需與標準數(shù)據(jù)庫比對獲得鑒定結(jié)果，因此MALDITOF-MS菌種鑒定數(shù)據(jù)庫對鑒定結(jié)果尤為重要。本研究運用MALDI-TOF-MS采集17株國際通用蠟樣芽胞桿菌標準菌株數(shù)據(jù)，篩去低質(zhì)量譜圖，通過BioTyper軟件將有效譜圖添加到細菌鑒定數(shù)據(jù)庫。本研究共采集21張ATCC10702有效譜圖（見圖2）。

其他圖譜為22張ATCC10987有效譜圖、22張ATCC11950有效譜圖、23張ATCC12826有效譜圖、24張ATCC13061有效譜圖、23張ATCC14579有效譜圖、22張ATCC14737有效譜圖、24張ATCC15816有效譜圖、24張ATCC19637有效譜圖、23張ATCC21769有效譜圖、23張ATCC21772有效譜圖、24張ATCC27348有效譜圖、23張ATCC27877有效譜圖、24張ATCC33018有效譜圖、23張ATCC33019有效譜圖、24張ATCC49063有效譜圖、20張ATCC49064有效譜圖。

通過比較數(shù)據(jù)庫補充前后MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果（見表2），可知41株蠟樣芽胞桿菌分離菌株在數(shù)據(jù)庫補充前可信度得分較低，部分菌株得分在2.300以下；數(shù)據(jù)庫補充后，其中39株蠟樣芽胞桿菌可信度得分提高，所有菌株鑒定得分均在2.300以上，識別能力提高34.15%（可信度得分在2.300以上菌株增加量/總菌株數(shù)），由差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌數(shù)據(jù)庫補充前后鑒定結(jié)果差異顯著（P＜0.05），說明MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫補充提高菌種鑒定可信度。

綜合上述試驗結(jié)果，最優(yōu)樣品處理方法為甲酸提取法，數(shù)據(jù)庫補充提高蠟樣芽胞桿菌鑒定可信度。在此條件下，蠟樣芽胞桿菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果可信度高，且10 min內(nèi)可得到鑒定結(jié)果。

2.3 與生化鑒定比較

通過比較41株蠟樣芽胞桿菌疑似菌株MALDITOF-MS鑒定結(jié)果和生化鑒定結(jié)果，探究MALDITOF-MS鑒定準確性。結(jié)果表明，MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致，均鑒定為蠟樣芽胞桿菌（見表2），MALDI-TOF-MS鑒定周期顯著低于傳統(tǒng)生化鑒定。說明本研究建立蠟樣芽胞桿菌MALDI-TOF-MS鑒定方法準確度高，可用于蠟樣芽胞桿菌快速、準確鑒定。

2.4 MALDI-TOF-MS鑒定方法靈敏度

運用MALDI-TOF-MS鑒定方法鑒定108～100cfu蠟樣芽胞桿菌ATCC14579，探討MALDI-TOF-MS鑒定靈敏度。結(jié)果表明，蠟樣芽胞桿菌ATCC 14579數(shù)量為108～104cfu時，可信度得分均＞2.000，鑒定結(jié)果準確；在103～100cfu范圍內(nèi)時，可信度得分＜1.700，無準確鑒定結(jié)果（見表3）。

本研究MALDI-TOF-MS鑒定靈敏度為104cfu，可滿足蠟樣芽胞桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上增菌培養(yǎng)后鑒定需求。

2.5 MALDI-TOF-MS鑒定方法穩(wěn)定性

通過對比蠟樣芽胞桿菌ATCC14579同一傳代次數(shù)不同菌落及不同傳代次數(shù)鑒定結(jié)果，探討MALDITOF-MS鑒定穩(wěn)定性。

由表4可知，蠟樣芽胞桿菌ATCC14579同一傳代次數(shù)3個菌落平行樣可信度得分接近，差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，不同傳代次數(shù)蠟樣芽胞桿菌ATCC14579可信度得分差異不顯著（P＞0.05），說明蠟樣芽胞桿菌MALDI-TOF-MS鑒定方法穩(wěn)定性較好，同批次及不同批次鑒定結(jié)果一致。

圖2 蠟樣芽胞桿菌ATCC10702平行蛋白指紋Fig.2 Protein mass spectrometric profiles ofBacillus cereusATCC10702

2.6 MALDI-TOF-MS分型結(jié)果

通過運用MALDI-TOF-MS對蠟樣芽胞桿菌分型，探討不同品牌腐乳蠟樣芽胞桿菌親緣關(guān)系。分型結(jié)果表明，以距離0.87為界分型，可將41株蠟樣芽胞桿菌分為4個型別，A型包含14株蠟樣芽胞桿菌分離株，源于3個品牌腐乳樣品；B型包含11株蠟樣芽胞桿菌分離株，源于2個品牌腐乳樣品；C型包含7株蠟樣芽胞桿菌分離株，源于1個品牌腐乳樣品；D型包含9株蠟樣芽胞桿菌分離株，源于2個品牌腐乳樣品（見圖3）。

同一品牌腐乳中分離蠟樣芽胞桿菌具有聚集性，品牌3和品牌4中分離蠟樣芽胞桿菌分別聚集到D型和A型，C型中7株蠟樣芽胞桿菌均源于品牌1，為蠟樣芽胞桿菌溯源提供參考。但并非所有相同品牌腐乳中蠟樣芽胞桿菌均可聚到同類，說明某些品牌腐乳中分離蠟樣芽胞桿菌呈多樣化，這與原材料、生產(chǎn)設備、生產(chǎn)人員等因素密

切相關(guān)。

表2 41株分離菌株MALDI-TOF-MS與BD鑒定結(jié)果Table 2 Detection results of 25 strains of isolates by MALDI-TOF-MS and BD

表3 靈敏度試驗結(jié)果Table 3 Results of the identification sensitivity

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Results of the identification stability

圖3 41株蠟樣芽胞桿菌聚類分析Fig.3 Cluster analysis diagram for 41 strains of Bacillus cereus

3 討論與結(jié)論

本研究比較不同樣品處理方法對蠟樣芽胞桿菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理方法鑒定結(jié)果差異顯著。同種/屬細菌，選擇不同樣品處理方法影響MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果準確性，優(yōu)化和統(tǒng)一樣品處理方法是保證MALDI-TOF-MS準確鑒定前提。數(shù)據(jù)庫完善程度是制約MALDI-TOF-MS鑒定準確性重要因素，本研究選取17株國際通用蠟樣芽胞桿菌標準菌株補充數(shù)據(jù)庫，提高蠟樣芽胞桿菌鑒定可信度，與戰(zhàn)曉微等研究結(jié)果一致[22]。MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫補充時效性是限制該技術(shù)發(fā)展重要因素，保證標準菌株及時補充數(shù)據(jù)庫，才能發(fā)揮MALDI-TOF-MS菌種鑒定優(yōu)勢。本研究建立蠟樣芽胞桿菌MALDITOF-MS鑒定方法靈敏度為104cfu，可滿足蠟樣芽胞桿菌鑒定需要，良好穩(wěn)定性可為蠟樣芽胞桿菌指紋圖譜聚類分析及快速溯源奠定基礎(chǔ)。與生化鑒定比較發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致，說明MALDI-TOF-MS鑒定方法適用蠟樣芽胞桿菌檢測和鑒定，也為其他病原菌快速鑒定提供參考。通過聚類分析將41株蠟樣芽胞桿菌分離株分型，分型結(jié)果顯示菌株型別與來源具有相關(guān)性，說明其在蠟樣芽胞桿菌溯源方面具有參考價值。質(zhì)譜數(shù)據(jù)準確是保證MALDI-TOFMS分型結(jié)果可靠前提，優(yōu)化和統(tǒng)一MALDI-TOFMS數(shù)據(jù)采集影響因素是保證分型結(jié)果準確關(guān)鍵。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化蠟樣芽胞桿菌樣品處理方法及數(shù)據(jù)庫補充，實現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌快速準確鑒定。研究MALDI-TOF-MS鑒定方法，可為預防和鑒別蠟樣芽胞桿菌提供技術(shù)手段，應用前景廣闊。

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Study on matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry method forBacillus cereusidentification/

JIANG Lianzhou1,CAO Feiyang1,CHEN Ying2,WANG Ping2,ZHAO Xiaomei2(1.School of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Agro-product Safety Research Center,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China)

Identification method forBacillus cereusin food by matrix assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)was established.This study optimized sample handling methods,focusing onBacillus cereustype strain,and 17 standard strains ofBacillus cereuswere used to supplement a MALDI-TOF-MS database,the sensitivity,stability,accuracy of the method were evaluated.The results showed that the optimal sample handling method ofBacillus cereuswas formic acid treatment method,the credibility of identification results ofBacillus cereuswas improved by supplementing the database.Based on these conditions,the MALDI-TOF-MS method showed excellent accuracy,stability and appropriate sensitivity(104cfu).Further typing was achieved by cluster analysis.The identification method forBacillus cereusby MALDI-TOF-MS is accurate,rapid,and it could provide a technical support for identification and typing ofBacillus cereusin food.

Bacillus cereus;MALDI-TOF-MS;identification;rapid;accurate

TS207.4

A

1005-9369（2016）12-0056-09

時間2016-12-28 10:33:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.004.htmll

2016-10-03

國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B03）

江連洲（1960-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:jlzname@163.com

江連洲,曹飛揚,陳穎,等.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜快速鑒定蠟樣芽胞桿菌研究與應用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2016,47(12):56-64.

Jiang Lianzhou,Cao Feiyang,Cheng Ying,et al.Study on matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry method forBacillus cereusidentification[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):56-64. (in Chinese with English abstract)