玉米秸桿降解菌篩選鑒定及其盆栽試驗(yàn)對(duì)生土性能影響

王芳，胡培毅，李莎，馮李鵬，王瑤，高莉

（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

玉米秸桿降解菌篩選鑒定及其盆栽試驗(yàn)對(duì)生土性能影響

王芳，胡培毅，李莎，馮李鵬，王瑤，高莉

（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

從山西地區(qū)林地土壤中篩選得到纖維素降解菌X-7,固氮菌N-8，經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，X-7和N-8分別屬于堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）和腸桿菌屬（Enterobacter）。菌株X-7在50℃時(shí)活性最高，對(duì)玉米秸稈降解率為62.9%，濾紙酶活力和CMC降解酶活力最大分別為90.78和168.54 IU·mL-1。發(fā)酵液pH與纖維素酶活性有一定相關(guān)性，纖維素酶高活性主要集中在發(fā)酵液pH 8.8～9.0。固氮菌N-8固氮能力為45 mg·L-1。為評(píng)估兩株菌在山西干旱氣候下對(duì)生土種植性能影響，作盆栽紫花苜蓿試驗(yàn)。結(jié)果表明，生土中添加玉米秸稈和纖維素降解菌X-7及固氮菌N-8顯著提高生土抗旱能力及苜蓿平均株重和株高。菌株X-7在生土中可有效定殖并提高生土中纖維素降解菌數(shù)量1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，可為山西地區(qū)黃土母質(zhì)生土改良沃化提供參考。

玉米秸稈；生土；纖維素降解菌；固氮菌

華北區(qū)是我國第二大玉米產(chǎn)區(qū)，玉米秸稈產(chǎn)量占全國近30%，其中約30.9%直接還田[1]。玉米秸稈中纖維素含量平均為35.93%，半纖維素含量平均為24.51%[2]。纖維素是葡萄糖高分子縮聚物，在纖維素降解菌作用下被分解，實(shí)現(xiàn)秸稈腐熟。秸稈還田在一定程度上對(duì)提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和活性、改善土壤肥力、保墑節(jié)水、疏松土壤、緩沖低溫等作用顯著[3-5]。

隨秸稈產(chǎn)量不斷增加，如土壤纖維素降解微生物不足或環(huán)境條件不適合菌體生長，秸稈直接還田導(dǎo)致土壤積聚大量未腐解有機(jī)物質(zhì)，操作不當(dāng)可使病原菌在土壤中繁殖[6-7]。因此，在考慮大規(guī)模玉米秸稈還田改良土壤生態(tài)同時(shí)，應(yīng)通過微生物作用加速秸稈腐熟。

目前纖維素降解菌篩選、培養(yǎng)條件及酶學(xué)性質(zhì)研究報(bào)道較多，篩選菌在自然界土壤中的定殖是研究熱點(diǎn)。外源微生物土壤定殖需要與之相適應(yīng)的氣候和土壤條件，如溫度、水分、pH等[8-9]。因此，纖維素降解菌篩選應(yīng)根據(jù)區(qū)域特點(diǎn)精準(zhǔn)篩選與馴化應(yīng)用。從氣候和土壤基質(zhì)來講，中國南方與北方特點(diǎn)分明，溫度、降雨量、土壤性質(zhì)等差異較大。纖維素降解菌在特定環(huán)境中定殖能力研究，尤其是菌株在半干旱氣候條件生土中的作用未見報(bào)道。

山西屬于黃土高原半干旱地區(qū)，黃土母質(zhì)生土營養(yǎng)貧乏，土壤微生態(tài)系統(tǒng)不成熟，生土當(dāng)年土壤生產(chǎn)力僅為耕作熟土1/4[10]。隨環(huán)境污染加大和可耕作土地減少，土壤修復(fù)與黃土母質(zhì)生土改良沃化具有重要意義。向生土中添加秸稈和纖維素降解微生物是改善生土土質(zhì)有效途徑，玉米秸稈還田可快速提高生土有機(jī)質(zhì)含量，纖維素菌使用可加快秸稈腐熟。自生固氮菌是土壤微生態(tài)有益菌之一，對(duì)持續(xù)提高土壤肥力，促進(jìn)作物生長具有積極作用[11]。因此，從山西本地土壤中篩選纖維素降解菌與固氮菌應(yīng)用于黃土母質(zhì)生土改良具有可行性。

本試驗(yàn)針對(duì)黃土母質(zhì)生土及山西干旱多發(fā)氣候條件，在太原、晉南、晉中地區(qū)篩選玉米秸稈纖維素降解菌，研究玉米秸稈與纖維素降解菌對(duì)生土性能改善；篩選自生固氮菌，與纖維素降解菌組成一種復(fù)合微生物添加劑，以期增加玉米秸稈還田腐熟效率，改良生土土質(zhì)，提高生土種植性能。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采集于2014年6～7月，從山西晉中太谷范村野外草地、山西運(yùn)城臨猗果園、山西運(yùn)城鹽湖地區(qū)等地采集土樣。采樣時(shí)撥去表面雜物，挖取土層以下3～9 cm土樣，分別取不同位置3份土樣，過40目篩，置于無菌瓶中，標(biāo)記，4℃冰箱貯存。

玉米秸稈取自當(dāng)年自然干燥秸稈，水分含量為3.4%，使用前粉碎至1 cm長度。

1.2 培養(yǎng)基配制

纖維素降解菌選擇培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，NaCl 0.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂粉15 g。將上述物質(zhì)溶解后，蒸餾水定容到1 000 mL。加10 mg·mL-1剛果紅（CR）溶液25 mL。菌落周圍出現(xiàn)透明圈為具有纖維素降解能力菌落。

PCS培養(yǎng)基：1.5 g蛋白胨，1.5 g玉米秸稈，1.5 g NaCl，0.6 g CaCO3，0.3 g酵母浸膏，加蒸餾水至300 mL。調(diào)pH至7.0[12]。

阿須貝氏（Ashby）無氮培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g CaCO35 g，甘露醇10 g，瓊脂5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH為7.2。以上培養(yǎng)基均于121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.3 菌株篩選

1.3.1 纖維素降解菌篩選

每份土樣取10 g，以無菌水配制成100 mL溶解，濾紙過濾去除殘?jiān)?。濾液稀釋到合理梯度，取1 mL稀釋液涂布到纖維素降解菌選擇培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3～5 d至長出菌落。挑取周圍出現(xiàn)明顯透明圈菌落，在選擇培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離，置于37℃條件下培養(yǎng)，直至長出明顯單菌落，保存菌種。

1.3.2 固氮菌篩選

分別應(yīng)用泥漿法和阿須貝培養(yǎng)基方法篩選。泥漿法：取30 g土樣，6 mL蒸餾水，0.3 g甘露醇混合攪成泥漿。泥漿用無菌鏟子移到無菌培養(yǎng)皿上，表面壓至光滑平整。28℃培養(yǎng)4 d直至長出圓褐色菌落[13]。

阿須貝培養(yǎng)基篩選方法：將土樣稀釋到合理梯度，接種1 mL樣品以無菌方式涂布于阿須貝固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)4 d直至長出圓褐色菌落。挑取菌落在阿須貝氏無氮培養(yǎng)基中反復(fù)劃線分離純化直至得到純菌株，并保存菌種。發(fā)酵液活菌數(shù)以涂布法在阿須貝固體培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)。

1.3.3 菌株鑒定

篩選菌株X-7和N-8經(jīng)顯微鏡鏡檢、形態(tài)觀察及生化檢測。純化菌株送上海美吉生物公司16S rDNA測序，將測定序列在GenBank（NCBI）數(shù)據(jù)庫上序列比對(duì)，獲得16S rDNA相似性最大菌株。

1.4 玉米秸稈降解能力測定

玉米秸稈降解率測定：以玉米秸稈為碳源，按1%秸稈配制95 mL PCS培養(yǎng)基，將活化后48 h菌種X-7，按5%接種量接種，50℃搖床培養(yǎng)，130 r·min-1。配制7個(gè)平行樣品，每24 h取樣，測定pH，另取樣10 mL抽濾，濾渣65℃烘干后稱重，計(jì)算生物降解后玉米秸稈降解率，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不接種菌樣培養(yǎng)液為對(duì)照。

降解率（%）=（玉米秸稈干重-發(fā)酵后玉米秸稈干重）/玉米秸稈干重×100%

1.5 纖維素降解酶活力測定

以DNS（3，5-二硝基水楊酸比色法）繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。纖維素降解菌X-7以2%比例接入纖維素降解菌選擇培養(yǎng)基，37℃，150 r·min-1培養(yǎng)7 d，每天取樣5 mL，8 000 r·min-1離心3 min，上清即為粗酶液。測定粗酶液CMCase和濾紙酶活測定參考文獻(xiàn)[14-15]。

1.6 篩選菌株N-8固氮量測定

固氮菌N-8于阿須貝培養(yǎng)基中28℃，120 r· min-1震蕩培養(yǎng)4 d，10 000 r·min-1離心2 min收集菌體，采用微量凱氏定氮法測定菌株固氮能力[16]。

1.7 X-7與N-8菌拮抗試驗(yàn)

以無菌方式在阿須貝瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布固氮菌N-8，晾干后在固氮菌上層點(diǎn)種纖維素降解菌X-7，28℃培養(yǎng)4 d，觀察X-7周圍是否產(chǎn)生抑菌圈。

以無菌方式在剛果紅選擇培養(yǎng)基上均勻涂布纖維素降解菌X-7，晾干后在X-7菌上層點(diǎn)種固氮菌N-8，37℃培養(yǎng)4 d，觀察N-8周圍有無抑菌圈。

1.8 目標(biāo)菌對(duì)生土苜蓿生長影響

供試土壤為黃土母質(zhì)上發(fā)育而成石灰性褐土，取自太原中北大學(xué)后山工地地表以下2～3 m母質(zhì)生土。風(fēng)干，過40目篩，充分混勻。母質(zhì)生土養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)4.03 g·kg-1，pH 8.3。玉米秸稈為當(dāng)年生曬干秸稈，水分含量3.4%，使用前切段至1 cm長度。農(nóng)家肥為豬糞漚制肥料。纖維素降解菌X-7為培養(yǎng)7 d菌液，活菌數(shù)約1.5×108cfu·mL-1，固氮菌N-8為培養(yǎng)3 d菌液，活菌數(shù)約2.3×107cfu· mL-1。菌液發(fā)酵成熟后噴灑玉米秸稈，然后與生土按比例混合。試驗(yàn)分為六組，分別為Ⅰ組：生土空白對(duì)照組，Ⅱ組：生土+農(nóng)家肥組，Ⅲ組：生土+玉米秸稈組，Ⅳ組：生土+玉米秸稈+X-7發(fā)酵液組，Ⅴ組：生土+玉米秸稈+N-8，Ⅵ組：生土+玉米秸稈+混合菌組。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。每組種植10個(gè)花盆，花盆為PVC材質(zhì)，底部直徑為10 cm，口徑15 cm，有效高度為10 cm，容積1 500 cm3。每個(gè)花盆播撒苜蓿種子10粒，置于溫室內(nèi)，溫度（20±5）℃。為模擬地區(qū)干旱氣候，苜蓿發(fā)芽2周后斷水2周，其他時(shí)間正常澆水。種植5個(gè)月后，測定苜蓿平均干重及最高植株。土樣分別于播種前、收獲后采集，采用“S”型取樣法，每個(gè)組取5個(gè)點(diǎn)，然后將土樣充分混合，新鮮土樣取10 g經(jīng)無菌水溶解、梯度稀釋后，以剛果紅纖維素選擇培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基計(jì)算土樣中纖維素降解菌和固氮菌數(shù)量。

表1 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Pot experiment design plan

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)平均值，采用Excel 2010數(shù)據(jù)處理及分析，Duncan法作處理間差異多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌篩選與性能測定

2.1.1 纖維素降解菌篩選

將多個(gè)土樣在剛果紅選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d后，除運(yùn)城鹽湖地區(qū)土樣未長出菌落外，太谷野外草地及運(yùn)城蘋果園地土壤樣品均在剛果紅培養(yǎng)基平板上長出透明圈菌落。取透明圈直徑最大菌落經(jīng)反復(fù)劃線純化得到纖維素降解菌，命名為X-7（見圖1）。

該菌在剛果紅透明圈直徑達(dá)10 mm，菌落呈圓，表面濕潤，凸起，邊緣光滑。革蘭氏染色陽性，桿狀，有芽孢。經(jīng)16S rDNA序列分析及生物學(xué)分析綜合判斷，菌株X-7屬于Bacillus firmus，相似度為99%。該纖維素降解菌來自太谷縣范村野外草地，10年內(nèi)未施加農(nóng)藥和化肥，而同地采自露天耕地及大棚土壤樣品在纖維素降解菌初篩培養(yǎng)基上長出的菌落較少。

圖1 纖維素降解菌在剛果紅篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈Fig.1 Transparent zone of cellulose degradation bacteria on congo red agar

2.1.2 纖維素降解菌X-7生長特性及纖維素降解能力

研究采用28、37、40及50℃培養(yǎng)溫度培養(yǎng)纖維素降解菌X-7，發(fā)現(xiàn)28℃條件下菌株生長緩慢，28～50℃溫度內(nèi)，培養(yǎng)溫度越高，菌體生長越快。50℃培養(yǎng)條件下生長最快，但超過55℃菌體生長受到抑制。

為測定菌株X-7對(duì)玉米秸稈降解性能，將菌株活化后加入PCS培養(yǎng)基中50℃培養(yǎng)7 d，菌液pH變化曲線如圖2所示。由圖可見，在發(fā)酵過程中，pH由7.0逐步上升7.64（1 d后），發(fā)酵2 d后pH升至8.8，并保持在8.8附近。推測是由于培養(yǎng)基中碳源、氮源分別為CMC-Na和NaNO3，在代謝過程中發(fā)酵液pH增加。培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基中玉米秸稈降解率達(dá)最大62.9%±0.0363%，表明該菌株對(duì)玉米秸稈有較高降解效率。

圖2 纖維素降解菌X-7 50℃培養(yǎng)過程中pH變化曲線Fig.2 pH change curve of cellulose degradation bacteria X-7 during the fermentation at 50℃

2.1.3 篩選菌株X-7纖維素酶活

篩選菌株X-7在37℃培養(yǎng)條件下濾紙酶活力和CMC酶活力見表2，纖維素酶活與發(fā)酵液pH相關(guān)性見圖3。

表2 篩選菌株X-7纖維素降解酶酶活Table 2 Cellulase activity of strain X-7

圖3 纖維素酶活與發(fā)酵液pH相關(guān)性Fig.3 Correlation between cellulose activity and pH of culture

以羧甲基纖維素鈉為底物測定酶活力，由表2可知，X-7在發(fā)酵前2 d未檢測到酶活性，從發(fā)酵第3天開始，酶活性增加，到第6天達(dá)到最大值，酶活力為168.54 IU·mL-1。而在濾紙酶活性測定中，第1天即檢測到酶活，此后隨發(fā)酵時(shí)間增加，酶活性逐漸增加，到第6天，酶活力達(dá)最大值90.78 IU·mL-1。這一趨勢(shì)說明，發(fā)酵開始時(shí)菌體量較少，酶活性較低。從第3天開始，菌體量增大，pH增加，此時(shí)酶活力逐漸增加。隨發(fā)酵時(shí)間延長和菌體增加，酶活性逐漸增大。到第6天，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)消耗大，代謝產(chǎn)物積累，菌體活力下降，此時(shí)酶活性下降至檢測線以下。

由表2可知，纖維素降解菌X-7在發(fā)酵第1天表現(xiàn)出全酶解能力，在第3天表現(xiàn)出內(nèi)切葡萄糖苷酶酶活，提示該菌纖維素酶產(chǎn)生具有以下特征：①可產(chǎn)生纖維素降解所需內(nèi)切葡萄糖苷酶及外切葡萄糖苷酶；②可能首先由外切葡萄糖苷酶發(fā)揮作用，然后產(chǎn)生（第3天）內(nèi)切葡萄糖苷酶；③發(fā)酵過程中纖維素酶活性，尤其是內(nèi)切葡萄糖苷酶與培養(yǎng)基pH有相關(guān)性，濾紙酶活性和CMC酶活與pH相關(guān)系數(shù)分別為0.564和0.583。由圖3可知，高酶活性主要集中在pH 8.8～9.0，當(dāng)pH低于8.8時(shí)，酶活力通常較低。結(jié)果提示在工業(yè)生產(chǎn)中纖維素降解菌發(fā)酵液pH可作為纖維素酶活相關(guān)指標(biāo)。

2.2 固氮菌篩選與性能測定

山西運(yùn)城臨猗土壤樣品分別采自鹽湖附近、蘋果園表面土壤及大豆露天耕地。應(yīng)用泥漿法和阿須貝無氮培養(yǎng)基兩種方法篩選。鹽池周圍土壤樣品在試驗(yàn)條件下未見菌落，蘋果地土樣和大豆耕地土樣在泥漿培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基上均長出大量圓形菌落，初期為白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，3 d后開始變?yōu)楹稚煞N方法均由甘露醇提供碳源，菌落數(shù)與土樣稀釋濃度正相關(guān)，兩種方法產(chǎn)生結(jié)果無顯著差異。選取褐色菌落在阿須貝培養(yǎng)基上經(jīng)反復(fù)劃線分離純化直至得到純菌株，命名為N-8。純化菌落在阿須貝無氮培養(yǎng)基上3 d內(nèi)顏色開始為白色，培養(yǎng)時(shí)間延長至3～7 d時(shí)，菌落顏色由白色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚叙ば?，革蘭氏陰性。經(jīng)16S rDNA序列分析及生化分析綜合判斷，菌株N-8屬于腸桿菌屬（Enterobacter）。相關(guān)研究報(bào)道在野生水稻、玉米根系固氮菌中腸桿菌科為優(yōu)勢(shì)菌[17-18]，本試驗(yàn)篩選的固氮菌經(jīng)鑒定也屬于腸桿菌科。通常認(rèn)為種植大豆的耕地中具有更多固氮菌，本研究發(fā)現(xiàn)蘋果園底土樣中具有同大豆土樣相似數(shù)量固氮菌。固氮菌N-8在28℃培養(yǎng)4 d后固氮菌活菌數(shù)為4.8×107cfu·mL-1。將培養(yǎng)基中甘露糖改為葡萄糖，活菌數(shù)無顯著變化，固定氮量達(dá)到45 mg·L-1。

2.3 菌體拮抗試驗(yàn)結(jié)果

將篩選菌株X-7與N-8分別在纖維素培養(yǎng)基和阿須貝無氮培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，在點(diǎn)種的X-7和N-8周圍均未出現(xiàn)抑菌圈，說明兩種菌無拮抗作用，可聯(lián)合使用。

2.4 混合菌株及玉米秸稈對(duì)生土中苜蓿生長影響

本研究在生土中添加玉米秸稈以快速增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，以玉米秸稈為菌劑媒介，噴灑纖維素降解菌與固氮菌兩種發(fā)酵菌液，盆栽試驗(yàn)中苜蓿生長及土樣中活菌數(shù)見表3。從表3可看出，在紫花苜蓿種植后2周內(nèi)正常澆水，所有試驗(yàn)組土樣苜蓿發(fā)芽，各組間發(fā)芽率無顯著差異。為探討秸稈和菌體對(duì)土壤干旱耐受性，發(fā)芽后設(shè)置為期3周的不澆水干旱期。經(jīng)歷干旱期后，空白組、有機(jī)肥組、秸稈組及固氮菌+秸稈組紫花苜蓿幼苗全部死亡。生土中添加玉米秸稈組、生土添加纖維素降解菌組及生土添加混合菌組苜蓿幼苗存活率分別為10%、25%、80%，差異顯著。說明單獨(dú)添加玉米秸稈在一定程度上提高生土抗旱能力，同時(shí)添加玉米秸稈和纖維素降解菌、固氮菌可顯著提高生土抗旱能力。

在干旱期后5個(gè)月內(nèi)正常澆水，土樣中苜蓿最高株高和平均鮮重混合菌組最高，單株苜蓿鮮重最大為7.73 g，平均鮮重為5.67 g，與其他組差異顯著。說明纖維素降解菌和固氮菌混合噴灑玉米秸稈后，顯著促進(jìn)生土中苜蓿生長。原因一方面添加玉米秸稈增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，為苜蓿生長提供更多營養(yǎng)素。另一方面，添加纖維素降解菌和固氮菌亦可為苜蓿生長提供可供利用營養(yǎng)素。

種植5個(gè)月后，各組土樣中纖維素降解菌和自生固氮菌活菌數(shù)見表3。結(jié)果表明，對(duì)于土壤中纖維素降解菌而言，外源纖維素菌單獨(dú)添加組活菌數(shù)量最高，達(dá)到1.1×107cfu·g-1；混合菌組次之，達(dá)到3.7×106cfu·g-1；單獨(dú)添加玉米秸稈和農(nóng)家肥土樣中菌體數(shù)量為105cfu·g-1；生土組最少，為4.0×104cfu·g-1。表明單獨(dú)添加玉米秸稈和農(nóng)家肥均可提高土壤中纖維素降解菌1個(gè)數(shù)量級(jí)。而添加外源纖維素降解菌在土壤中有較好適應(yīng)性，可有效提高土壤中相應(yīng)菌含量，提高量為2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

種植5個(gè)月后，各組土樣中固氮菌數(shù)量發(fā)生變化，空白組和玉米秸稈組固氮菌活菌數(shù)在105cfu· g-1，農(nóng)家肥組、固氮菌組及混合菌組土樣中固氮菌數(shù)量在106cfu·g-1。說明單獨(dú)添加玉米秸稈對(duì)土壤中固氮菌數(shù)量無影響，而外源添加固氮菌可提高土壤中固氮菌總量1個(gè)數(shù)量級(jí)。從試驗(yàn)結(jié)果可見，添加玉米秸稈和外源菌液均提高生土中相應(yīng)微生物數(shù)量，但是本試驗(yàn)條件下，外源纖維素降解菌在生土中定殖能力高于固氮菌。

表3 混合菌對(duì)紫花苜蓿生長影響Table 3 Effects of mixed bacteria on alfalfa growth

3 討論

山西地區(qū)氣候干旱、降雨量小，春季存在較長時(shí)間干旱天氣[19-20]。研究表明，土壤中混合小麥秸稈和玉米秸稈，可顯著提高土壤保水性和水分利用效率[21-22]。本研究表明，生土中添加玉米秸稈可提高抗旱能力（干旱期后苜蓿存活率由0提高到10%），而秸稈還田與兩種微生物共同施用，可顯著提高苜蓿抗旱能力（干旱期后苜蓿存活率提高到80%）。因此，秸稈和微生物混合施用對(duì)山西地區(qū)黃土母質(zhì)生土的抗旱保水效果顯著。

本研究篩選出纖維素降解菌經(jīng)理化及16S rDNA測定為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bcillus firmusAU9，ident99%）。堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌為芽孢桿菌屬，是土壤微生態(tài)中優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌之一，出土量大于60%[23]。堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌生物防治方面研究較多，其發(fā)酵代謝物具有防治核桃炭疽病、林木幼苗立枯病等林木病害作用，B.firmusI-1582在美國、歐盟等地作為微生物農(nóng)藥[24-25]。此外，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也有應(yīng)用[26]。目前，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌在纖維素降解方面報(bào)道較少，本研究篩選的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌具有纖維素降解功能，可為其拓展應(yīng)用提供新方法。

纖維素酶活力是纖維素降解菌最重要指標(biāo)，本研究中發(fā)現(xiàn)菌體培養(yǎng)過程中pH與酶活力相關(guān)，高活性集中在pH 8.8～9.0。研究表明，纖維素酶最佳活性出現(xiàn)在偏酸性pH 5.8附近[27]，也有研究報(bào)道在堿性pH 8.0條件下酶活性最高，但是當(dāng)pH上升到9時(shí)活力下降[28]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)纖維素降解菌在pH 9.0附近堿性條件下出現(xiàn)最大活性，具體酶作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

自生固氮菌在氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，土壤中自生固氮菌固氮量可達(dá)每年60 kg·hm-2，自身固氮菌在自然界表現(xiàn)豐富多樣性。土壤中分離出的需氧自生固氮菌包括固氮菌、貝捷林克氏固氮菌（Beijerinckia）等，兼性自生固氮菌包括多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、克雷伯氏桿菌（Klebsiella）及腸桿菌等[29]。除自生固氮菌，在內(nèi)生固氮菌分離中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)腸桿菌[30]。從安全性角度考慮，腸桿菌在土壤中分布廣泛，個(gè)別菌株為條件致病菌，但大部分相對(duì)安全。某些具有固氮功能的腸桿菌已應(yīng)用于土壤肥料[31-32]，目前未見致病性報(bào)道。本研究篩選的腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)固氮作用，在添加固氮菌和農(nóng)家肥土壤中，總固氮菌數(shù)量均從對(duì)照組的105cfu·g-1提高到106cfu·g-1，固氮菌有小幅增長。試驗(yàn)結(jié)果表明腸桿菌在生土中的增殖在安全范圍內(nèi)，不會(huì)擾動(dòng)土壤微生態(tài)系統(tǒng)多樣性或者造成其他安全問題。此外，施用農(nóng)家肥與添加固氮菌的土壤中最終總固氮菌數(shù)量無顯著差異，表明活性固氮菌添加效果與農(nóng)家肥相同。研究報(bào)道，玉米秸稈深翻連續(xù)兩年還田可顯著提高土壤微生物數(shù)量，且自生固氮菌數(shù)量增幅最高[33]。本試驗(yàn)中纖維素菌增殖超過固氮菌增殖量，差異可能源于秸稈還田時(shí)間不同，相關(guān)文獻(xiàn)為連續(xù)2年玉米秸稈還田，本試驗(yàn)為5個(gè)月。因此，秸稈對(duì)土壤作用可能存在持續(xù)效應(yīng)，后期試驗(yàn)將深入研究腸桿菌安全性及在土壤中持續(xù)效應(yīng)。

作為新墾耕地生土，土壤有機(jī)質(zhì)較少，微生物總活性較差。楊珍平等通過施肥、作物混作等方式研究黃土母質(zhì)生土改良[34]。本研究中將纖維素菌、固氮菌與玉米秸稈復(fù)合還田生土中，不僅提高生土種植肥力，促進(jìn)土壤微生態(tài)區(qū)系建立，同時(shí)有效利用玉米秸稈，結(jié)合作物混作可為黃土母質(zhì)生土改良提供更有效方法。

良好微生態(tài)系統(tǒng)對(duì)土壤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、病蟲害防治、作物生長均有促進(jìn)作用。土壤接種有益微生物或玉米秸稈接種菌劑可提高土壤中有益菌數(shù)量[35-36]。外源微生物在土壤系統(tǒng)中的定殖受當(dāng)?shù)貧夂蚣巴寥罈l件影響，如土壤有機(jī)物與礦物質(zhì)含量、pH、溫度、水分及系統(tǒng)其他微生物影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，生土中添加帶菌液玉米秸稈后，土壤中纖維素菌和固氮菌提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，說明該外源菌系可適應(yīng)干旱氣候，在生土中有效定殖。后續(xù)研究將擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模，同時(shí)關(guān)注玉米秸稈及混合菌添加對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量及其他物理化學(xué)指標(biāo)影響。

4 結(jié)論

針對(duì)山西半干旱氣候精準(zhǔn)篩選與鑒定微生物菌株，篩選到纖維素降解菌X-7，經(jīng)鑒定屬于堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus），篩選到固氮菌N-8經(jīng)鑒定屬于腸桿菌屬（Enterobacter）。纖維素降解菌X-7對(duì)玉米秸稈降解率達(dá)62.9%；纖維素降解酶活性集中在發(fā)酵液為pH 8.8～9.0。

在黃土母質(zhì)生土中添加3.3%（重量比）玉米秸稈及纖維素降解菌X-7（3.3×107cfu·g-1）和固氮菌N-7（5.0×106cfu·g-1），顯著提高苜蓿株高、株重及抗旱能力（P＜0.05），增加土壤中相應(yīng)微生物數(shù)量，是快速改善生土土壤性能的新方法。

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Screening and identification of corn straw cellulose degradation strain and the effects on quality of immature soil in potted experiment

WANG Fang,HU Peiyi,LI Sha,FENG Lipeng,WANG Yao,GAO Li(School of Chemical Engineering and Environment,North University of China,Taiyuan 030051,China)

Cellulose degradation bacteria X-7 and nitrogen-fixing bacteria N-8 were isolated from forest land in Shanxi Province,respectively.Results of 16S rDNA sequence alignment showed that X-7 and N-8 belonged toBacillus firmusandEnterobacter,respectively.At 50℃,62.9%of the corn straw was degraded by the strain X-7,the filter paper degrading enzyme and the CMCase activity reached to the highest level of 90.78 and 168.54 IU·mL-1,respectively,there was a certain correlation between pH and cellulose activity.High cellulose activity was often appeared at pH within 8.8 and 9.0 of fermentation broth. Nitrogen fixation ability of strain N-8 was 45 mg·L-1.In order to evaluate the effects of two strains on immature soil quality under arid climate,potted alfalfa growing experiment were conducted.Results showed that adding corn straw,X-7 and N-8 into immature soil could improve not only the water retention ability of immature soil,but also the average weigh of single afalfa and the maxium height of afalfa.These results implied that X-7 could colonize in the soil and increase the number of cellulose bacteria at 1-2 order of magnitudes.The results would supple a way to improve the quality of immature soil.

corn straw;immature soil;cellulose degradation bacteria;nitrogen-fixing bacteria

S311；S314

A

1005-9369（2016）12-0030-08

時(shí)間2016-12-28 10:33:09 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.012.html

2016-09-26

山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2014021027-3）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140311008-7）

王芳（1976-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ芪⑸锏暮Y選與應(yīng)用。E-mail：wangfang136@126.com

王芳,胡培毅,李莎,等.玉米秸桿降解菌篩選鑒定及其盆栽試驗(yàn)對(duì)生土性能影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(12):30-37.

Wang Fang,Hu Peiyi,Li Sha,et al.Screening and identification of corn straw cellulose degradation strain and the effects on quality of immature soil in potted experiment[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):30-37.(in Chinese with English abstract)