高郵鴨IGF-1基因SNP位點變異與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)性分析

陶志云，朱春紅，宋衛(wèi)濤，徐文娟，劉宏祥，章雙杰，李慧芳

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125）

高郵鴨IGF-1基因SNP位點變異與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)性分析

陶志云，朱春紅，宋衛(wèi)濤，徐文娟，劉宏祥，章雙杰，李慧芳*

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125）

胰島素樣生長因子1（IGF-1）是動物生長軸重要基因之一，在調(diào)節(jié)動物生長發(fā)育和代謝中具有重要作用。采用LDR法檢測IGF-1基因在高郵鴨群體中多態(tài)性，篩選與高郵鴨骨骼肌生長性狀相關(guān)SNP位點。結(jié)果表明，在IGF-1基因第二內(nèi)含子上檢測到g.110 431G＞T突變，形成GG、GT、TT三種基因型，該突變位點具有中度多態(tài)信息含量，在高郵鴨中處于哈代-溫伯非平衡狀態(tài)。相關(guān)分析表明，該突變位點與70日齡體重、胸腿肌重、胸肌肌纖維面積和直徑、腿肌肌纖維密度顯著相關(guān)，可作為高郵鴨生長發(fā)育早期選育分子標(biāo)記。

胰島素樣生長因子1；LDR；SNP；高郵鴨

胰島素增長因子1（IGF-1）屬胰島素家族成員，是動物生長軸重要基因之一，調(diào)控動物生長發(fā)育和代謝，在細(xì)胞生長和分化調(diào)節(jié)中起重要作用[1]。研究表明，IGF-1主要在動物出生后生長發(fā)育中作用，IGF-1突變與出生重和體長無相關(guān)性[2]，發(fā)揮影響動物生長候選基因。禽類IGF-1研究主要見于雞，不同雞種IGF-1表達(dá)量比較研究表明，整個生產(chǎn)過程中，IGF-1在大圍山微型雞中表達(dá)量顯著低于武定雞和艾維茵肉雞；三個品種中IGF-1表達(dá)量與生長性狀（體重、體斜長、胸骨長、胸寬、胸深、脛長、脛管圍）顯著相關(guān)[3]。沈華等認(rèn)為黃羽肉雞IGF-1外顯子1上1處突變與雞初生重、4周齡、12周齡及300日齡成年體重顯著相關(guān)[4]。萬秋蓓等對新?lián)P州雞研究表明，IGF-1基因5'調(diào)控區(qū)Pst1位點和HinfI位點多態(tài)性與繁殖性狀顯著相關(guān)[5-6]，朱文奇等對文昌雞和邊雞研究表明，IGF-1多態(tài)性與雞繁殖性狀相關(guān)[7-9]。近年關(guān)于鴨IGF-1相關(guān)研究中，北京鴨IGF-1 mRNA表達(dá)量與胸肌發(fā)育正相關(guān)[10]；胡艷等對金定鴨和高郵鴨研究表明，發(fā)育早期肝臟中IGF-1 mRNA表達(dá)量持續(xù)上升，與鴨體質(zhì)量顯著相關(guān)[11]；淮南麻鴨IGF-1基因單核苷酸多態(tài)性與體重正相關(guān)[12]。張紹勝等提出IFG-1多態(tài)性與生長及屠宰性狀相關(guān)[13-14]。以上結(jié)果表明，IGF-1在禽類生長發(fā)育中具有重要作用。

高郵鴨，又名高郵麻鴨，是中國三大名鴨之一，屬蛋肉兼用型地方優(yōu)良品種。高郵鴨不僅生長快、肉質(zhì)好、產(chǎn)蛋率高，且耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、蛋頭大、蛋質(zhì)好，因善產(chǎn)雙黃蛋乃至三黃蛋而享譽(yù)海內(nèi)外。但目前高郵鴨育種基本采用傳統(tǒng)方法，無法滿足日益增長消費(fèi)需求。因此，本文以高郵鴨為研究對象，篩選IGF-1基因單核苷酸多態(tài)性，并與70日齡高郵鴨體重、胸腿肌重及胸腿肌肌纖維性狀關(guān)聯(lián)分析，以期為高郵鴨選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇0日齡高郵鴨260只，購自江蘇高郵鴨集團(tuán)，在相同日糧水平條件下飼養(yǎng)。試驗所用主要試劑TaqDNA聚合酶（Sigma aldrich Z266272）購自天根生化科技（北京）有限公司；dNTP（Promega U1511）購自上海玉博生物科技有限公司；PCR儀（Gene Amp PCR system 9 600）購自Norwalk，CT.06859 USA；電泳儀（JY600+）購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；全自動紫外與可見分析裝置（FR-200A）購自上海復(fù)日科技有限公司；測序儀（PRISM 3730）購自ABI公司。

1.2 血液樣品采集

70日齡時對高郵鴨稱重，屠宰和采血，采用1次性注射器從鴨翅靜脈中抽取1 mL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有200 μL 2%無菌乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的1.5 mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生長性狀測定

70日齡高郵鴨活體稱重后屠宰，解剖后分離出胸大肌和腓腸肌稱重（下文胸肌和腿肌分別是指胸大肌和腓腸?。＝厝⌒卮蠹『碗枘c肌中間膨大部冰凍切片并HE染色，染色后每個個體至少取3個切片拍照，計算肌纖維面積、直徑和密度，取平均值。

1.4 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測純度和濃度，并將DNA稀釋成50 ng·μL-1，作為PCR擴(kuò)增模板。根據(jù)GenBank上鴨IGF-1基因（NW_004677293）序列設(shè)計引物，上游引物序列為5'TTGCATG GAGTG GATGTGAT 3'；下游引物序列為：5'GC AGGAA TAAGAGTGCCATGT 3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。在PCR反應(yīng)條件下擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小234 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：10×buffer 2 μL，3 mmol·L-1Mg2+0.6 μL，dNTP mix 40 mmol·L-12 μL，1 U·μL-1Taq聚合酶0.2 μL，10 μmol·L-1上下游引物Mix 2 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為：95℃變性2 min，40次循環(huán)（94℃30 s，50℃30 s，65℃30 s），65℃延伸10 min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE中電泳，檢測反應(yīng)成功率，剩余反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存。

1.5 SNP檢測與基因型分型

PCR產(chǎn)物連接酶檢測反應(yīng)（LDR），設(shè)計三條LDR探針，序列如下：

連接酶檢測反應(yīng)體系為10 μL，包括：4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、1 μL 10×Buffer、1 μL Probe mix（2 pmol·μL-1）、0.05 μLTaqDNA ligase（2 U·μL-1）、加ddH2O補(bǔ)足10 μL，充分混勻后短暫離心，最后加入10 μL石蠟油。連接酶檢測反應(yīng)程序為：①95℃預(yù)變性2 min；②94℃變性15 s，50℃退火25 s，40次循環(huán)。反應(yīng)完成后，在每個上樣孔中加入10 μL Loading Buffer，0.25 μL ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，最后加入0.5 μL LDR產(chǎn)物。充分混勻后上樣，ABI377測序儀測序膠毛細(xì)管電泳，并用GENESCANTM672軟件收集數(shù)據(jù)、校正泳道線、測量遷移片段并校正內(nèi)在分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI3730型基因分析儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物長度與各基因型通過Genemapper關(guān)聯(lián)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

假設(shè)某群體某位點等位基因有A、B兩種，其等位基因頻率分別為p、q。

該群體基因型有AA、AB、BB三種，基因型頻率分別記為D、H和R。根據(jù)觀測基因型頻率，可計算等位基因頻率：

根據(jù)等位基因頻率，可計算理論基因型頻率：

根據(jù)樣本含量、觀測基因型頻率和理論基因型頻率，可分別計算觀測基因型頻數(shù)和理論基因型頻數(shù)。

通過卡方檢驗：

計算卡方值。如果卡方值對應(yīng)概率＞0.05，則可認(rèn)為該等位基因處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

1.6.2 多態(tài)信息含量

其中Pi、Pj分別為第i、j個等位基因頻率，n為等位基因個數(shù)。

1.6.3 有效等位基因數(shù)

其中Pi為某一位點上第i個等位基因頻率，n為等位基因個數(shù)。

利用SPSS 16.0軟件檢驗基因型頻率和基因頻率，分析與骨骼肌性狀相關(guān)性，作Hardy-Weinberg平衡卡方適合性檢驗，計算多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 LDR分型及SNP位點信息

通過LDR法，對252只高郵鴨個體IGF-1基因作基因分型。LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI3730型基因分析儀檢測，根據(jù)LDR產(chǎn)物長度與各基因型通過Genemapper關(guān)聯(lián)分析，分型圖見圖1，基因型GG的LDR產(chǎn)物長度170 bp，基因型TT的LDR產(chǎn)物長度172 bp，基因型GT的LDR產(chǎn)物長度170和172 bp混合。IGF-1基因具有4個外顯子，在NW_004677199.1序列中分別位于89 201:90 285、100 673:100 854、136 234:136 390和140 698:140 977處。IGF-1基因110 431位點發(fā)現(xiàn)有g(shù).110 431G＞T突變（見圖1），該位點位于IGF-1基因內(nèi)含子2的第9 577位點。其中GG、GT和TT基因型分型圖譜見圖2。GG、TT基因型均只有1個檢測峰，GT基因型有兩個并列檢測峰。

2.2 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位點在高郵鴨分布情況

根據(jù)IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位點在高郵鴨中基因型分布情況，統(tǒng)計基因型及基因頻率，檢測60個GG基因型、48個GT基因型、144個TT基因型。根據(jù)基因型分布情況，利用SPSS軟件皮卡遜卡方值作基因型頻率卡方適合性檢驗，由表1可知，高郵鴨突變位點χ2為41.236，P=0.000＜0.05，說明高郵鴨在該突變位點上處于哈代-溫伯非平衡狀態(tài)。根據(jù)等位基因頻率算出突變位點多態(tài)信息含量（PIC）和有效等位基因數(shù)（Ne）。PIC值為0.372，介于0.25～0.5，說明該SNP位點為中度多態(tài)。

圖1 IGF-1基因SNP位點三種基因型分型圖譜Fig.1 Three genotypes of SNP of IGF-1

圖2 SNP位點所處IGF-1基因第二內(nèi)含子部分序列Fig.2 Part sequence of intro 2 of IGF-1 gene containing the SNP

表1 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位點在高郵鴨中的分布情況Table 1 Distribution of g.110 431G＞T SNP of IGF-1 in Gaoyou duck

2.3 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP與高郵鴨體重及胸腿肌重關(guān)聯(lián)分析

對IGF-1基因SNP分子標(biāo)記不同基因型與70日齡高郵鴨體重、胸肌重和腓腸肌重關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表2。由表2可知，IGF-1基因SNP位點與高郵鴨體重、胸肌重差異極顯著（P＜0.01）；與腿肌重差異顯著（P＜0.05）；其中基因型GG 70日齡高郵鴨體重、胸肌重和腿肌重均顯著高于基因型GT和TT；比較GT和TT，GT型70日齡高郵鴨體重和胸肌重顯著高于TT，腿肌重在兩基因型間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP與70日齡高郵鴨胸肌肌纖維特性關(guān)聯(lián)分析

將胸腿肌冰凍切片并HE染色，Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計每個肌纖維面積、直徑和密度，結(jié)果見圖3。

IGF-1基因SNP位點不同基因型與70日齡高郵鴨胸腿肌肌纖維特性關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表3。

表2 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP與70日齡高郵鴨體重及胸腿肌重關(guān)聯(lián)分析Table2Correlation analysis of g.G110 431G＞T SNP of IGF-1 gene with the body weight,chest muscle weight and leg muscle weight of 70 days-age Gaoyou duck

圖3 肌纖維Fig.3 Sketch map of muscle fiber

表3 IGF-1基因g.110431G＞T SNP與70日齡高郵鴨胸腿肌肌纖維特性關(guān)聯(lián)分析Table 3 Correlation analysis of 70 days age Gaoyou duck muscle fiber characteristics of chest and leg with g.110 431G＞T SNP of IGF-1 gene

由表3可知，胸肌中IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位點與70日齡高郵鴨胸肌肌纖維面積、肌纖維平均直徑差異顯著（P＜0.05），與肌纖維密度差異不顯著（P＞0.05）；其中基因型GG 70日齡高郵鴨胸肌纖維面積和直徑均顯著高于基因型GT和TT，胸肌纖維面積顯著低于基因型GT和TT（P＜0.05）；比較GT和TT，胸肌纖維面積、直徑和密度間差異均不顯著（P＞0.05）。腿肌中，IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位點與70日齡高郵鴨腿肌肌纖維面積、平均直徑相關(guān)不顯著（P＞0.05），與腿肌肌纖維密度差異顯著（P＜0.05），其中，基因型GG 70日齡高郵鴨腿肌肌纖維密度顯著高于基因型GT和TT（P＜0.05），而腿肌肌纖維面積和直徑在GG、GT和TT基因型間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

IGF-1基因多態(tài)性在多種動物研究中均有報道，研究表明，大西洋鮭魚中IGF-15763G＞T、7292C＞T、4671A＞C三個突變位點與體重相關(guān)[15]。牛IGF-1多態(tài)性與其斷奶重[16]、產(chǎn)奶量、體況評分和奶牛繁殖力性狀相關(guān)[17]。豬IGF-1外顯子3突變與豬生長性狀相關(guān)[18]。武艷平等在泰和烏雞IGF-1第1外顯子發(fā)現(xiàn)1處突變，該突變AB基因型體重顯著高于AA基因型體重[19]。王洪才等發(fā)現(xiàn)莊河大骨雞IGF-1的5'非編碼區(qū)1處突變形成CC、CD和DD基因型，在活重、屠體重、半凈膛重、腿肌重和平均日增重方面，DD基因型個體均顯著高于CC型和CD型個體[20]。研究表明，IGF-1是影響動物生長繁殖等性能重要基因。黃慧蓉等研究表明，IGF-1多態(tài)性與山麻鴨產(chǎn)蛋性能相關(guān)[21]。本試驗在高郵鴨IGF-1中發(fā)現(xiàn)一個單核苷酸突變位點，該突變位點與高郵鴨70日齡體重、胸腿肌重顯著相關(guān)，GG基因型體重顯著高于GT和TT基因型。本試驗中體重最高GG基因型組，其胸肌和腿肌重也最高，與Sato等研究結(jié)果一致[22]。試驗表明，GG基因型為體重增長優(yōu)勢基因型。

肌纖維特性研究表明，肌纖維組織學(xué)特性與肌肉品質(zhì)密切相關(guān)。如北京油雞、福建和田雞、泰寧烏鳳雞三個地方品種雞纖維特性與肌肉嫩度研究表明，胸肌和腿肌剪切力與肌纖維直徑顯著正相關(guān)，與肌纖維密度顯著負(fù)相關(guān)[23]。5個品系優(yōu)質(zhì)雞肌纖維生長規(guī)律及肉品質(zhì)關(guān)系研究結(jié)果表明，肌纖維面積與密度顯著負(fù)相關(guān)，與嫩度、肉色、肌內(nèi)脂肪含量、肌甘酸含量正相關(guān)[24]。為進(jìn)一步研究IGF-1多態(tài)性與胸腿肌肌纖維特性相關(guān)性，本文分析和統(tǒng)計胸腿肌的肌纖維面積、直徑和密度，并關(guān)聯(lián)分析胸腿肌肌纖維面積、直徑和密度與IGF-1多態(tài)性，結(jié)果表明，在胸肌中，GG基因型胸肌纖維面積和直徑顯著高于GT和TT基因型，GG基因型密度顯著低于GT和TT基因型，GG基因型胸肌肌纖維密度顯著低于GT和TT基因型，說明胸肌肌纖維面積和直徑與IGF-1在g.110 431G＞T多態(tài)性顯著相關(guān)。在腿肌中，腿肌肌纖維面積GG與GT基因型間差異顯著，與TT基因型間差異不顯著；腿肌肌纖維直徑在GG、GT和TT基因型間差異不顯著；腿肌肌纖維密度GG基因型顯著低于GT和TT基因型，說明腿肌肌纖維密度與IGF-1在g.110 431G＞T多態(tài)性顯著相關(guān)。

肌纖維特性是衡量肌肉品質(zhì)重要指標(biāo)，肌纖維直徑越小，密度越大，則肉質(zhì)越嫩。體重、胸腿肌重和基因型間相關(guān)性分析表明，GG基因型有利于高郵鴨體重、胸腿肌重增長，但同時肌纖維特性與基因型間相關(guān)性分析表明，GG基因型鴨肉質(zhì)嫩度低。綜合考慮體重增長和肉質(zhì)因素，建議選擇TT基因型，可獲得肉質(zhì)好、生長快高郵鴨新品系。

4 結(jié)論

本研究通過高郵鴨IGF-1基因第2內(nèi)含子多態(tài)位點檢測，發(fā)現(xiàn)g.110 431G＞T突變位點，形成GG、GT、TT三種基因型。通過與70日齡體重、胸腿肌重、胸腿肌肌纖維面積、直徑和密度關(guān)聯(lián)分析，該突變位點與70日齡體重、胸腿肌重、胸肌肌纖維面積、直徑和腿肌肌纖維密度顯著相關(guān)，提示該位點可作為高郵鴨生長發(fā)育早期選育分子標(biāo)記。

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Polymorphism ofIGF-1 gene and relationship between genotypes and skeletal muscle development traits in Gaoyou duck/

TAO Zhiyun,ZHU Chunhong,SONG Weitao,XU Wenjuan,LIU Hongxiang,ZHANG Shuangjie,LI Huifang(Jinagsu lnstitute of Poultry Science,Yangzhou Jiangsu 225125,China)

Insulin growth factor 1(IGF-1)is one of the important gene of animal growth axis.The polymorphism ofIGF-1 gene was detected in Gaoyou duck.The association betweenIGF-1 gene polymorphism and growth traits of Gaoyou duck was analysed.The results showed that one single nucleotide polymorphism(SNP)was detected in intron 2 ofIGF-1 gene,which was g.110 431G＞T.The mutation formed GG,GT and TT genotype.The PIC was 0.372,and the mutation site was not in Hardy-Weinberg equilibrium in Gaoyou duck.The results of correlation analysis showed that there were significantly correlation between the mutation site and body weight,chest muscle weight,leg muscle weight,area and diamete of breast rmuscle fiber,and density of leg muscle fiber of 70 days-age Gaoyou duck.It was suggested that the mutation site could be used as a molecular marker of Gaoyou duck to accelerate the breeding process.

insulin growth factor 1;LDR;SNP;Gaoyou duck

S834

A

1005-9369（2016）12-0086-07

時間2016-12-28 10:33:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.018.html

2016-08-11

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目（CX（15）1010-03）

陶志云（1979-），女，助理研究員，碩士，研究方向為家禽免疫及遺傳育種。E-mail:zhiyun2@126.com

*通訊作者：李慧芳，研究員，博士，研究方向為家禽遺傳育種與資源保護(hù)。E-mail:lhfxf_002@aliyun.com

陶志云,朱春紅,宋衛(wèi)濤,等.高郵鴨IGF-1基因SNP位點變異與骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47 (12):86-92.

Tao Zhiyun,Zhu Chunhong,Song Weitao,et al.Polymorphism ofIGF-1 gene and relationship between genotypes and skeletal muscle development traits in Gaoyou duck[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):86-92.(in Chinese with English abstract)