25型藍(lán)舌病病毒VP2蛋白原核表達(dá)及其單克隆抗體制備

李一經(jīng)，李佳璇，武嘯，臧明鑫，謝雙羽，姜艷平，崔文，唐麗杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

25型藍(lán)舌病病毒VP2蛋白原核表達(dá)及其單克隆抗體制備

李一經(jīng)，李佳璇，武嘯，臧明鑫，謝雙羽，姜艷平，崔文，唐麗杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）為藍(lán)舌病毒（Bluetongue virus，BTV）引起，以高熱、白細(xì)胞減少、黏膜潰瘍性炎癥等為主要癥狀的反芻動(dòng)物傳染病。試驗(yàn)將25型BTV VP2蛋白分段基因分別克隆至pMAL-c5x載體，以終濃度1.0 mmol·L-1IPTG為誘導(dǎo)劑，在大腸桿菌中分別誘導(dǎo)表達(dá)帶麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽的融合蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C。分別以帶His標(biāo)簽的重組VP2分段蛋白VP2-A、VP2-B、VP2-C為免疫原，以試驗(yàn)表達(dá)VP2分段蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C為抗原篩選雜交瘤細(xì)胞。通過細(xì)胞融合篩選出6株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的交雜細(xì)瘤胞，其中4株McAb亞型鑒定為IgG；2株McAb亞型鑒定為IgM。試驗(yàn)為建立25型BTV血清學(xué)鑒別診斷方法奠定基礎(chǔ)。

藍(lán)舌病病毒；VP2；原核表達(dá)；單克隆抗體

藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）由藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起，屬非接觸性傳染病，主要感染綿羊和牛等反芻動(dòng)物，主要癥狀為高熱、白細(xì)胞減少、黏膜潰瘍性炎癥等[1-2]。BTV最早發(fā)現(xiàn)于1876年，呈世界性分布。目前已從非洲、歐洲、亞洲、北美、南美和大洋洲國家分離到BTV，分布范圍擴(kuò)大，危害嚴(yán)重。反芻動(dòng)物感染BTV后平均死亡率為35%，其中易感綿羊死亡率高達(dá)80%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將BT規(guī)定為需上報(bào)疾病，在我國為一類動(dòng)物疾病。

BTV為呼腸病毒科（Reoviridae）、環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）、藍(lán)舌病病毒亞群，是典型環(huán)狀病毒屬病毒。BTV粒子為圓形、無囊膜的二十面立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，核衣殼直徑為53～60 nm，其衣殼外存在一層細(xì)絨毛狀外層，使總直徑提高到70～80 nm。BTV中存在大量基因、抗原變異及多種血清型。目前已確定檢測(cè)出1～27型BTV，28型BTV和29型BTV正在檢測(cè)中[3-4]。25型BTV是2008年從瑞士山羊血液樣本中分離獲得。

BTV分為10個(gè)節(jié)段，主要編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP7）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3/ NS3a和NS4）[5-6]。VP2蛋白由L2基因編碼，是BTV的型特異性蛋白，由950～960個(gè)氨基酸組成，位于病毒外層，各血清型之間氨基酸序列變化范圍22.7%～72.9%，各血清型缺乏有效交叉免疫保護(hù)[7-8]。VP2主要參與病毒吸附和侵入，與病毒毒力有關(guān)。VP2可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，是BTV型特異性抗原主要決定因素[9-12]。25型BTV的VP2與其他血清型病毒VP2同源性僅為23%～79%。因感染25型BTV牲畜無典型癥狀常被忽略。一旦爆發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高。因此建立針對(duì)25型BTV特異性血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)BTV防控具有重要意義。

藍(lán)舌病全球暴發(fā)有擴(kuò)大趨勢(shì)，血清型變異快、種類多，為有效控制其流行，早期診斷很重要。Appleton等首次利用17型BTV高效篩選出21株針對(duì)BTV不同結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白單克隆抗體[13]。Stewart等通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建全新的同時(shí)表達(dá)藍(lán)舌病內(nèi)外層蛋白（VP2、VP3、VP5、 VP7）藍(lán)舌病病毒樣顆粒，通過動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證該病毒顆粒的免疫原性和保護(hù)力，應(yīng)用前景良好[14]。王凌鳳等利用在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分段表達(dá)17型BTV VP2[15]，將重組蛋白作免疫抗原，以17型BTV病毒粒子作包被抗原制備單克隆抗體，利用噬菌體展示技術(shù)分析其抗原表位。

本試驗(yàn)用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室純化帶His標(biāo)簽的VP2-A、VP2-B、VP2-C分別作免疫原，應(yīng)用pMAL-c5X原核表達(dá)系統(tǒng)分段表達(dá)、純化，MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C蛋白作檢測(cè)抗原，制備單克隆抗體，利用Western blot和ELISA方法鑒定其特異性及穩(wěn)定性，為后續(xù)檢測(cè)方法建立提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒與菌株

鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TG1、BL21由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存。表達(dá)載體pMAL-c5X由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所張永寧博士惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)4～6周齡BALB/c小鼠，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑

特級(jí)胎牛血清購自北京瑞京通達(dá)生物科技有限公司；IPTG購自北京索來寶公司；青霉素、鏈霉素購自哈藥集團(tuán)制藥六廠；PRMI 1640培養(yǎng)液購自Gibicol公司；HAT（50×）、HT（100×）、二甲基亞砜（DMSO）、融合劑PEG3350、弗氏完全佐劑（FA）和弗氏不完全佐劑（IFA）、辣根過氧化物酶標(biāo)和熒光FITC標(biāo)記的山羊抗鼠均購自中杉金橋有限公司；抗體亞類鏈特異性鑒別試劑盒購自Sigma公司；限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker（DL8000）、dNTP mixture、Taq酶均購自寶生物公司；pMAL融合蛋白表達(dá)與純化試劑盒、質(zhì)粒提取和純化試劑盒均購自北京中實(shí)生物技術(shù)有限公司。

1.4 基因重組表達(dá)載體構(gòu)建

圖1 L2基因分段擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of L2 gene segments

根據(jù)GenBank中已登錄25型BTV的L2基因序列（EU839840）。利用蛋白分析軟件等分析及預(yù)測(cè)L2基因，將25型L2基因分為A（1～1 206 bp）、B（1 008～1 962 bp）、C（1 812～2 880 bp）3個(gè)節(jié)段，如圖1所示。用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，如表1所示，MBP25-a、MBP25-b、MBP25-c為針對(duì)pMAL-c5x載體引物序列。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence of DNA fragment

PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1.5 μL，dNTP 4 μL，rTaqDNA聚合酶1 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 26 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收。

將膠回收純化PCR產(chǎn)物，連入pMD18-Tsimple載體。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。取出感受態(tài)細(xì)胞TG1，冰浴融化后，立即加入10 μL上述連接產(chǎn)物；混勻后冰浴30 min，42℃熱激90 s，加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，取150 μL涂布氨芐青霉素LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16 h。隨機(jī)挑取若干單菌落分別接種于含100 mg·L-1氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒，單雙酶切鑒定。

陽性重組質(zhì)粒鑒定后序列測(cè)定。分別將A、B、C片段與表達(dá)載體pMAL-5X經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅤ雙酶切、EcoRⅠ、NdeⅠ雙酶切、EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，37℃水浴作用1.5 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化試劑盒純化后，經(jīng)T4DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞，挑去單菌落，提取質(zhì)粒，單雙酶切鑒定。將陽性重組質(zhì)粒命名為pMAL-c5X-VP2-A、pMAL-c5X-VP2-B、pMAL-c5X-VP2-C。

1.5 重組VP2蛋白表達(dá)與鑒定

將測(cè)序正確重組質(zhì)粒pMAL-c5X-VP2-A、pMAL-c5X-VP2-B、pMAL-c5X-VP2-C熱轉(zhuǎn)化至BL21。經(jīng)單雙酶切鑒定后，將含陽性質(zhì)粒重組菌pMAL-5X-VP2-A/BL21、pMAL-5X-VP2-B/BL21、pMAL-5X-VP2-C/BL21按1∶50接種于含氨芐LB液體培養(yǎng)基中。37℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)，加誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)表達(dá)。將菌體沉淀加入上樣緩沖液，表達(dá)產(chǎn)物SDSPAGE鑒定。將表達(dá)蛋白命名為MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C。

重組菌pMAL-5X-VP2-A/BL21、pMAL-5XVP2-B/BL21、pMAL-5X-VP2-C/BL21大量誘導(dǎo)后，利用GST標(biāo)簽蛋白親和層析柱純化。透析袋濃縮。純化后蛋白使用微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，分裝后-80℃低溫凍存。

純化后分段蛋白用商品化抗MBP-Tag單抗為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗，作Western blot鑒定。

1.6 動(dòng)物免疫及單克隆抗體制備

帶His標(biāo)簽的VP2-A、VP2-B、VP2-C蛋白純化后，分別免疫4～6周齡BALB/C小鼠。間接ELISA法檢測(cè)小鼠效價(jià)。融合免疫后小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，用純化后MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C作為包被抗原篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，具體方法如下[16]：用包被緩沖液（0.05 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3）稀釋純化的MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C（1 μg·mL-1），每孔100 μL，37℃包被2 h。棄去ELISA板中包被液，加入PBST洗滌3次，每孔200 μL，每次5 min。加入含50 g·L-1脫脂乳PBS作為封閉液，每孔200 μL，37℃封閉2 h。PBST洗滌3次，每孔200 μL，每次5 min。取細(xì)胞培養(yǎng)上清100 μL檢測(cè)間接ELISA效價(jià)，并向孔內(nèi)補(bǔ)加100 μL培養(yǎng)液。同時(shí)以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清作為空白對(duì)照，以未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，以免疫小鼠血清為陽性對(duì)照。37℃孵育2 h。棄去ELISA板中液體，加入PBST洗滌3次，每孔200 μL，每次5 min。以1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG，每孔100 μL，37℃孵育1 h。每孔加入100 μL底物OPD顯色液，37℃避光顯色15 min。每孔加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀490 nm波長測(cè)定OD值。間接ELISA法檢測(cè)為陽性的細(xì)胞孔，有限稀釋法亞克隆，經(jīng)3次亞克隆后獲得細(xì)胞株篩選結(jié)果均為陽性，挑選穩(wěn)定分泌抗體雜交瘤細(xì)胞，將其移至6孔培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，保存細(xì)胞上清，最后凍存細(xì)胞。

1.7 單克隆抗體反應(yīng)性

VP2-A/B/C三段蛋白分別經(jīng)SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)印，110 V，2 h。結(jié)束后將NC膜放入50 g· L-1脫脂乳中4℃封閉過夜，取出NC膜用PBST洗滌3次，每次15 min；以陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為一抗，室溫作用2 h，取出NC膜用PBST洗滌3次，每次15 min；再以脫脂乳稀釋HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋）為二抗，室溫作用2 h，取出NC膜用PBST洗滌3次，每次15 min，作Western blot分析，鑒定單克隆抗體反應(yīng)性。

1.8 單抗亞類鑒定

用Sigma公司生產(chǎn)單抗亞類鑒定試劑盒測(cè)定單克隆抗體亞型，對(duì)試劑盒說明書方法稍作修改。方法如下：將試劑盒中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IGM 6類亞類試劑按1∶1 000用PBS稀釋，加入ELISA反應(yīng)板中，每孔200 μL，37℃作用1 h；PBST洗滌3次，每孔200 μL，每次5 min。每孔加入100 μL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，室溫作用1 h；PBST洗滌3次，每孔200 μL，每次5 min，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（PBST 1∶2 500稀釋），常溫作用30 min；PBST洗滌3次，每孔200 μL，每次5 min，OPD顯色，37℃避光顯色15 min，再加入終止液終止反應(yīng)，讀值。

1.9 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性鑒定

將獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代培養(yǎng)3個(gè)月，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再將細(xì)胞株凍存并復(fù)蘇，將凍存前后細(xì)胞培養(yǎng)上清液以間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，SP2/0上清為陰性對(duì)照，小鼠陽性血清為陽性對(duì)照。以此方法評(píng)價(jià)其分泌抗體穩(wěn)定性。

1.10 交瘤細(xì)胞染色體數(shù)鑒定

采用秋水仙素法鑒定染色體數(shù)。具體方法如下[16]：選生長旺盛雜交瘤細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞傳代培養(yǎng)，48 h后向細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入終濃度為0.7 μg·mL-1秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后用吸管將細(xì)胞吹落轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r·min-1離心15 min，棄上清；加入37℃預(yù)熱0.075 mol·L-1KCl溶液5 mL，混勻后37℃水浴作用25 min；細(xì)胞懸液中加入新鮮配制固定液（冰醋酸∶甲醇=1∶3）1 mL，混勻后1 000 r·min-1離心15 min，棄上清；加入5 mL固定液使細(xì)胞懸浮，輕輕混勻，室溫靜置40 min，1 000 r· min-1離心15 min，棄上清，重復(fù)此步驟；加入固定液5 mL，懸浮并混勻細(xì)胞，封好管口，置4℃冰箱過夜；以1 000 r·min-1離心15 min，吸去上清液，保留微量固定液與細(xì)胞混勻后滴于預(yù)冷玻片，待其自然干燥，Giemsa染色液染色15 min，清水沖洗后放置室溫自然干燥。油鏡下觀察，染色體記數(shù)分析。

1.11 單克隆抗體特異性鑒定

利用MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C分別作為反應(yīng)原，濃度為100 μg·mL-1，每孔100 μL包被ELISA反應(yīng)板，4℃過夜；5%脫脂乳37℃封閉2 h后，洗滌3次；每孔各加入100 μL單抗上清，每個(gè)樣品作3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置陰性、陽性和空白對(duì)照孔，37℃作用2 h，PBST洗滌3次。1∶2 000稀釋HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG，每孔100 μL加入各反應(yīng)孔，37℃作用1 h，PBST洗滌3次。加入現(xiàn)配制OPD-H2O2底物顯色液，100 μL·孔-1，37℃避光顯色15 min；加入終止液（2 mol·L-1H2SO4），每孔50 μL，終止顯色，讀值。

2 結(jié)果與分析

2.1 L2基因表達(dá)載體構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pMAL-c5X-VP2-A分別經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ單雙酶切鑒定，1 230 bp出現(xiàn)目的條帶；重組質(zhì)粒pMAL-c5X-VP2-B分別經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ單雙酶切鑒定，984 bp處出現(xiàn)目的條帶；重組質(zhì)粒pMAL-c5X-VP2-C分別經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅤ單雙酶切鑒定，1 155 bp處出現(xiàn)目的條帶，3條目的條帶均與預(yù)期大小一致，結(jié)果說明VP2的3個(gè)分段基因均已正確插入表達(dá)載體pMAL-c5X（見圖2）。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c5X-VP2-A、pMAL-c5X-VP2-B、pMAL-c5X-VP2-C酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pMAL-c5X-VP2-A,pMAL-c5X-VP2-B,pMAL-c5X-VP2-C by enzyme digestion

2.2 VP2重組蛋白表達(dá)及純化

重組菌pMAL-5X-VP2-A/BL21、pMAL-5XVP2-B/BL21、pMAL-5X-VP2-C/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，均可見預(yù)期大小相符融合蛋白，分子質(zhì)量分別約84、82、82 ku，標(biāo)簽大小分別為40 ku，與預(yù)期大小結(jié)果相符（見圖3）。

重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C主要以可溶形式表達(dá)，MBP標(biāo)簽試劑盒純化。Western blot結(jié)果表明，重組蛋白在84、82、82 ku處均有特異條帶，而空載體重組菌表達(dá)對(duì)照無此條帶（見圖4）。重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C可被抗Tag-MBP單克隆抗體識(shí)別。

2.3 雜交瘤細(xì)胞間接ELISA篩選條件

以重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C為抗原，小鼠陽性和陰性血清為抗體，采用矩陣法確定抗原和抗體，作10倍稀釋為陽性雜交瘤細(xì)胞間接ELISA篩選條件。

圖3 重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C表達(dá)鑒定結(jié)果Fig.3 Expression of the recombinant protein MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C

圖4 重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C Western blot鑒定結(jié)果Fig.4Western blot of the recombinant protein MBPVP2-A,MBPVP2-B,MBPVP2-C

2.4 單克隆抗體獲得及亞型檢測(cè)

細(xì)胞融合后，經(jīng)3～4次細(xì)胞亞克隆，共獲6株抗25型BTV的單克隆抗體。其中針對(duì)VP2-A、 B、C段蛋白各有兩株，命名為25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3、25C-5E5、25C-5G11。經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定，25A-2C4、25B-1H7、25B-2F3雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體均為IgG1，25A-3E9雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體為IgG2a，25C-5E5、25C-5G11雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生抗體為IgM，結(jié)果如表2所示。

表2 單克隆抗體亞型鑒定Table 2 Monoclonal antibody isotypes identification

2.5 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)鑒定

采用秋水仙素法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株和SP2/0細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)。染色后油鏡觀察，挑選細(xì)胞形態(tài)完整、染色體分散均勻的細(xì)胞計(jì)數(shù)。雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目均明顯高于SP2/0和脾細(xì)胞染色體數(shù)目，說明雜交瘤細(xì)胞是SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞雜交產(chǎn)物。圖5給出雜交瘤細(xì)胞25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7染色體計(jì)數(shù)圖片，其余略。

圖5 雜交瘤細(xì)胞株染色體計(jì)數(shù)Fig.5 Chromosomes number of hybridoma cell strains

2.6 單克隆抗體反應(yīng)性與穩(wěn)定性檢測(cè)

將6株分泌單抗雜交瘤細(xì)胞連續(xù)體外傳代3個(gè)月，利用間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清和凍存復(fù)蘇后上清效價(jià)。

以重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C作為檢測(cè)抗原，凍存與復(fù)蘇前后細(xì)胞上清為抗體，SP2/0細(xì)胞上清為陰性對(duì)照。測(cè)得6株單抗細(xì)胞數(shù)值均高于SP2/0對(duì)照數(shù)值，凍存前后數(shù)值無明顯差異，判定制備雜交瘤細(xì)胞具有良好分泌穩(wěn)定性。

圖625 A-2C4(a)、25A-3E9(b)細(xì)胞上清與VP2-A蛋白Western blot鑒定Fig.6 Western blot identification of 25A-2C4(a),25A-3E9(b)with VP2-A protein

通過Western blot試驗(yàn)鑒定單克隆抗體的反應(yīng)特異性。將原核表達(dá)的重組分段VP2蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，分別以穩(wěn)定分泌IgG抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3培養(yǎng)上清液作一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作二抗，ECL顯色。結(jié)果如圖6～7所示，在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，說明制備的單克隆抗體能與重組蛋白特異性結(jié)合。

圖725 B-1H7、25B-2F3細(xì)胞上清與VP2-B蛋白Western blot鑒定Fig.7 Western blot identification of 25B-1H7,25B-2F3 with VP2-B protein

2.7 單克隆抗體特異性檢測(cè)

25 A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3、25C-5E5、25C-5G11 6株單抗上清分別與MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C間接ELISA反應(yīng)，結(jié)果表明：25A-2C4、25A-3E9只與MBPVP2-A反應(yīng)，不與MBPVP2-B和MBPVP2-C反應(yīng)；25B-1H7、25B-2F3只與MBPVP2-B反應(yīng)，不與MBPVP2-A和MBPVP2-C反應(yīng)；25C-5E5、25C-5G11只與MBPVP2-C反應(yīng)，不與MBPVP2-A和MBPVP2-B反應(yīng)。

3 討論

目前BTV已有28種個(gè)血清型，血清型種類多、變異快，各血清型間缺少交叉免疫保護(hù)反應(yīng)。為解決該問題，本研究主要關(guān)注VP2，VP2蛋白為決定BTV型特異性、血凝活性、病毒中和活性的主要抗原。Hwang等利用一株具有中和活性的型特異性單克隆抗體鑒定位于BTV13 VP2上構(gòu)象表位（aa：642～651）[17]。我國每年進(jìn)口大量牲畜，為防止25型BTV傳入，需獲掌握有良好特異性和靈敏度的血清篩選方法。因此通過制備針對(duì)BTV25 VP2單克隆抗體建立診斷BTV方法尤為重要。

與細(xì)胞繁殖BTV相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有周期短、成本低、表達(dá)量高、易于規(guī)?；忍攸c(diǎn)，適合于大量繁殖，可用于試驗(yàn)研究。本試驗(yàn)前通過不同表達(dá)載體（pET-30a、pET-32a）比較VP2分段蛋白表達(dá)量和表達(dá)形式差異。結(jié)果顯示，pMAL-c5X表達(dá)蛋白為可溶形式，表達(dá)量高。因此，本試驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室已有pET-28a表達(dá)的重組蛋白作免疫原，以pMAL-c5X表達(dá)的可溶性蛋白作檢測(cè)抗原制備單克隆抗體。pET-28a表達(dá)的重組蛋白VP2-A、VP2-B和VP2-C與其他載體相比具有表達(dá)量大、誘導(dǎo)時(shí)間短和His標(biāo)簽小等優(yōu)點(diǎn)；pMAL-c5X表達(dá)重組蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C通過低溫誘導(dǎo)使重組蛋白以可溶形式存在，蛋白接近天然結(jié)構(gòu)，載體pMAL-c5X上含有麥芽糖結(jié)合蛋白（即MBP標(biāo)簽）可在無變性條件下，分別利用MBP純化試劑盒純化相應(yīng)蛋白。

為保持MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C抗原性和反應(yīng)活性并克服蛋白質(zhì)重折疊問題，優(yōu)化各種誘導(dǎo)條件。確定用1.0 mmol·L-1IPTG在37℃誘導(dǎo)4 h為MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C最佳誘導(dǎo)條件。通過改變誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度，獲得目的蛋白最大表達(dá)量。

本研究共獲得6株雜交瘤細(xì)胞同25-BTV不同分段的VP2蛋白呈現(xiàn)不同反應(yīng)特性。6株雜交瘤細(xì)胞分別表現(xiàn)不同亞型，由于IgM不適合后期建立檢測(cè)方法，本試驗(yàn)主要研究分泌IgG抗體的四種雜交瘤細(xì)胞，即25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3。

本研究中，通過Western blot試驗(yàn)鑒定單克隆抗體反應(yīng)特異性，25A-2C4、25A-3E9分別與VP2-A反應(yīng)，顯示25A-2C4、25A-3E9兩株細(xì)胞VP2蛋白有較強(qiáng)反應(yīng)性。25B-1H7、25B-2F3分別與VP2-B反應(yīng)，顯示25B-1H7、25B-2F3兩株細(xì)胞VP2蛋白反應(yīng)性強(qiáng)。同時(shí)，通過間接ELISA反應(yīng)檢測(cè)25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3、25C-5E5、25C-5G11 6株與不同分段的25BTV VP2蛋白不發(fā)生反應(yīng)，表明這6株單抗均有良好特異性。

目前普遍認(rèn)為VP2蛋白是決定BTV血清型主要抗原[18]。本研究通過表達(dá)VP2蛋白，制備針對(duì)VP2單克隆抗體，為建立25型BTV檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)；制備單克隆抗體為建立25型BTV與其他血清型的血清學(xué)鑒別診斷方法奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用大腸桿菌表達(dá)載體表達(dá)25型BTV VP2蛋白，重組MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C可與商品化的抗Tag-MBP單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說明該重組蛋白具有良好抗原性。本研究共制備6株針對(duì)重組VP2的單克隆抗體，經(jīng)鑒定，除25C-5E5和25C-5G11為IgM外，其余四株25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3皆為IgG，并且6株單克隆抗體均與VP2蛋白反應(yīng)。說明本研究制備的單克隆抗體具有良好生物活性和反應(yīng)活性，可為國內(nèi)研制25型藍(lán)舌病ELISA診斷試劑盒及有效控制和凈化25型藍(lán)舌病奠定基礎(chǔ)。

[1]Maclachlan N J,Drew C P,Darpel K E,et al.The pathology and pathogenesisof bluetongue[J].Journal of Comparative Pathology,2009,141(1):1-16.

[2]李志華,張開禮,皺福中.綿羊藍(lán)舌病(湖北毒株)的分離鑒定報(bào)告[J].云南畜牧獸醫(yī),1989(4):49-51.

[3]Maan S,Maan N S,Belaganahalli M N,et al.Full-genome sequencing as a basis for molecular epidemiology studies of bluetongue virus in India[J].PLoS One,2015,10(6):e0131257.

[4]Maan S,Maan N S,Batra K,et al.Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid identification of eastern and western strains of bluetongue virus in India[J].Virol Methods,2016,234:65-74.

[5]Mertens P P,Brown F,Sangar D V.Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode [J].Virology,1984,135(1):207-217.

[6]DeMaula C D,Bonneau K R,MacLachlan N J.Changes in the outer capsid proteins of bluetongue virus serotype ten that abrogate neutralization by monoclonalantibodies[J].Virus Research,2000; 67(1):59-66.

[7]Osburn B I,McGowan B,Heron B,et al.Epizootiologic study of bluetongue:Virologic and serologic results[J].Vet Res,1981,42 (5):884-887.

[8]MacLachlan N J.The pathogenesis and immunology of bluetongue virus infection of ruminants[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,1994,17:197-206.

[9]Maan S,MaanN S,Nomikou K.et al.Complete genome characterization of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait[J]. PLoS One.2011,6(10):26147.

[10]趙晶.東方馬腦炎病毒E2蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定[D].哈爾濱:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,2012.

[11]高學(xué)軍,李?yuàn)檴?于萌萌,等.牛NF-κB1基因的原核表達(dá)與蛋白純化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(9)33-38.

[12]李廣興,楊婷,潘龍,等.禽白血病J亞型病毒分離鑒定及其gp85基因克隆表達(dá)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,44(6):38-43.

[13]Appleton J A,Letchworth G J.Monoclonal antibody analysis of serotype-restricted and unrestricted bluetongue viral antigenic determinants[J].Virology,1983,124(2):286-299.

[14]Stewart M E,Roy D.Role of cellular caspases,nuclear factor-kappa B and interferon regulatory factors in Bluetongue virus infection and cell fate[J].Virology Journal,2010,7(1):1-16.

[15]王凌鳳,楊濤,孫恩成,等.藍(lán)舌病病毒17型VP2蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011,33(6):465-470.

[16]耿宏偉,秦永麗,李俊平,等.藍(lán)舌病毒重組VP7蛋白單克隆抗體制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012,34(5):388-392.

[17]Hwang G Y,Li J K.Identification and localization of a serotypic neutralization determinant on the VP2 protein of bluetongue virus 13[J].Virology,1993,195(2):859-862.

[18]Batten C A,Henstock M R,Steedman H M,et al.Bluetongue virus serotype 26:infection kinetics,pathogenesis and possible contact transmission in goats[J].Vet Microbiol,2013,162(1):62-67.

Prokaryotic expression of VP2 protein of Bluetongue disease virus serotype 25 and preparation of monoclonal antibody/

Bluetongue(BT),caused by Bluetongue virus(BTV),is a ruminant infectious disease that is characterized by hyperpyrexia,leucocyte decrease and mucosal ulcerative inflammation changes.In this study,the gene of serotype 25-BTV VP2 was cloned and segmented into the pMAL-c5x vector,and induced expression the fusion protein MBPVP2-A,MBPVP2-B and MBPVP2-C with the maltose binding protein (MBP)tag by 1.0 mmol·L-1IPTG inducer inE.coliBL21,respectively.VP2-A,VP2-B and VP2-C with His tag, used as immunogen,the VP2 segmented protein MBPVP2-A,MBPVP2-B and MBPVP2-C screen hybridoma cells as antigen.Six hybridoma cells secreting monoclonal antibody steadily screened by cell fusion,among the MAbs against 25-BTV VP2,the isotypes of four MAbs were IgG,and two MAbs were IgM. This study laid a foundation for the establishment of serological methods on differential diagnosis whichcontrasted serotype 25 BTV and other serum types.

bluetongue virus;VP2;prokaryotic expression;monoclonal antibody

S852.65+9.4

A

1005-9369（2016）12-0065-09

時(shí)間2016-12-28 10:33:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.006.htmlLI Yijing,LI Jiaxuan,WU Xiao,ZANG Mingxin,XIE Shuangyu,JIANG Yanping,CUI Wen,TANG Lijie(School of Veterinary Medicine,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

2016-10-25

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD12B01）

李一經(jīng)（1960-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail:yijingli@163.com

李一經(jīng),李佳璇,武嘯,等.25型藍(lán)舌病病毒VP2蛋白原核表達(dá)及其單克隆抗體制備[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(12):65-73.

Li Yijing,Li Jiaxuan,Wu Xiao,et al.Prokaryotic expression of VP2 protein of Bluetongue disease virus serotype 25 and preparation of monoclonal antibody[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):65-73.(in Chinese with English abstract)