糖絡(luò)通對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡及抗氧化酶表達的影響

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(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧　大連　116011)

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糖絡(luò)通對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡及抗氧化酶表達的影響

常庚李明常風云1雷陽張炳蔚韓杰

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧大連116011)

摘要〔〕目的觀察糖絡(luò)通對大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的療效，并探討其在抗氧化損傷中的作用。方法SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素復制糖尿病模型，對模型大鼠每日灌胃糖絡(luò)通，8 w后檢測坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)含量。結(jié)果與模型組比較，糖絡(luò)通明顯減少DPN大鼠坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目，降低MDA、LDH、8-OhdG的含量，增加抗氧化酶SOD、GSH-Px的表達(P<0.05)。結(jié)論糖絡(luò)通能有效上調(diào)抗氧化酶SOD、GSH-Px的表達，減輕氧化損傷，降低坐骨神經(jīng)細胞的凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕糖尿病周圍神經(jīng)病變；凋亡；氧化應激；抗氧化酶

1河北醫(yī)科大學中西結(jié)合學院

第一作者：常庚(1981-)，男，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

氧化應激是糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素，抑制氧化損傷成為目前治療DPN的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究依據(jù)中醫(yī)“久病入絡(luò)”的理論，用自擬方糖絡(luò)通觀察其對大鼠DPN的療效，通過檢測坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、血清8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)的含量以及抗氧化蛋白谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達，探討糖絡(luò)通減輕神經(jīng)細胞氧化損傷的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級Wistar雄性大鼠90只，體重150～180 g，鼠齡4～6 w，由河北省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.2藥品及試劑糖絡(luò)通組成：黃芪、紅花、懷牛膝、赤芍、生地、威靈仙、當歸、蜈蚣、桂枝等(購自樂仁堂藥房，經(jīng)河北醫(yī)科大學中藥系鑒定，符合國家藥典標準)，在我校中藥系指導下常規(guī)水煎，濃縮至含生藥3 g/ml，備用。測定LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量的試劑來自南京建成生物工程研究所；鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司。

1.3模型建立及分組按文獻〔1〕方法復制模型。造模組大鼠禁食12 h后，鏈脲佐菌素(STZ)(溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，pp.3)50 mg/kg一次性腹腔注射，72 h后通過尾靜脈測定血糖，>16.67 mmo/L者為造模成功。造模過程中除2只未成模外，其余全部成模。將造模成功的大鼠再隨機分為模型組及中藥干預組。正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。

1.4實驗動物給藥中藥干預組：每日給糖絡(luò)通中藥25 g/kg(相當于成人劑量的20倍)。正常對照組、模型組：每日給相同容量的生理鹽水灌胃。中藥干預共8 w。

1.5標本采集中藥干預8 w后禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛完全麻醉后，心腔取血，4℃ 3 500 r/min離心15 min，分離血清及血漿，置于-20℃密封保存?zhèn)溆?。剖取坐骨神?jīng)，取部分組織固定于4%的甲醛溶液中，常規(guī)固定、脫水，石蠟包埋，切片以供檢測細胞凋亡等備用。其余坐骨神經(jīng)組織制成勻漿，以供檢測LDH 活性、MDA含量。

1.6TUNEL法測定細胞凋亡率應用TUNEL法檢測坐骨神經(jīng)細胞凋亡，操作步驟按說明書。

1.7坐骨神經(jīng)組織生化測定采用比色法測定組織勻漿中的LDH 活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量，二硫代二硝苯甲酸法則定GSH-Px含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量，測試操作過程嚴格按照說明書進行。

1.8血清8-OhdG的含量檢測應用ELISA法測定血清8-OhdG的含量，操作步驟按說明書。

1.9統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2結(jié)果

2.1坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及坐骨神經(jīng)組織中LDH含量與正常對照組比較，模型組在坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目、LDH含量顯著增加〔(428.25±21.53)vs (176.37±14.15)U/mg,P<0.01〕；與模型組比較，中藥干預組在坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目和LDH含量顯著下降〔(216.74±17.86)U/mg,P<0.01〕。見圖1。

圖1　TUNEL法檢測坐骨神經(jīng)細胞凋亡率(×200)

2.2坐骨神經(jīng)組織中MDA、GSH-Px和SOD的含量與正常對照組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)組織中MDA含量顯著增加而GSH-Px和SOD含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥干預組坐骨神經(jīng)組織中MDA含量均顯著下降而GSH-Px和SOD的含量明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1　中藥干預對8-OhdG、MDA、GSH-Px及SOD的

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.3血清8-OhdG的含量與正常對照組比較，模型組大鼠血清8-OhdG含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，中藥干預組血清8-OhdG的含量明顯降低(P<0.01)。見表1。

3討論

DPN是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，起病隱匿，發(fā)病率高，是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴重影響糖尿病患者的生存質(zhì)量。因此，如何預防和治療 DPN 是目前研究熱點之一。

高糖狀態(tài)誘導的坐骨神經(jīng)細胞凋亡損傷是導致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的主要原因〔2〕。臨床病理證實，DPN患者坐骨神經(jīng)細胞出現(xiàn)典型的凋亡相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)變化，核膜破裂，染色質(zhì)凝集，核碎裂分散于胞質(zhì)中，形成凋亡小體；神經(jīng)凋亡數(shù)目顯著增加。本研究表明，在模型組中大鼠坐骨神經(jīng)細胞的凋亡數(shù)目及LDH含量顯著上升，給予中藥糖絡(luò)通干預后，坐骨神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及LDH含量明顯下降，表明糖絡(luò)通能有效抑制DPN坐骨神經(jīng)細胞凋亡，具有顯著的神經(jīng)細胞保護作用。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定代謝物MDA的含量可反映組織自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度；8-OhdG是由ROS中羥自由基進攻脫氧鳥苷8位碳原子而形成的。MDA與8-OhdG被認為是DNA氧化損傷標志物，是評價機體氧化應激狀態(tài)的敏感指標。臨床與基礎(chǔ)研究證實，體內(nèi)的在高血糖條件下，活性氧簇生成增多，過量的自由基通過攻擊膜蛋白質(zhì)、核酸及生物膜上的不飽和脂肪酸，使之發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，致使細胞結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，誘導神經(jīng)細胞凋亡壞死〔3，4〕。本研究提示在DPN發(fā)病過程中，氧化應激是導致神經(jīng)細胞損傷凋亡的主要發(fā)病機制。SOD是生物體內(nèi)至關(guān)重要的氧自由基清除劑；GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，體內(nèi)SOD與GSH-Px的高低可反映機體清除自由基的能力，也是機體重要的抗氧化防御機制。本研究證實，糖絡(luò)通可以有效上調(diào)SOD及GSH-Px的表達，減輕坐骨神經(jīng)細胞的凋亡和損傷。

本實驗推測糖絡(luò)通治療DPN變是通過上調(diào)GSH-Px和SOD的表達，減輕坐骨神經(jīng)細胞的氧化損傷，來延緩DPN的發(fā)生與發(fā)展。

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2Wu YB，Shi LL，Wu YJ，etal.Protective effect of gliclazide on diabetic peripheral neuropathy through Drp-1 mediated-oxidative stress and apoptosis〔J〕.Neurosci Lett，2012；523(1)：45-9.

3Kellogg AP，Cheng HT，Pop-Busui R.Cyclooxygenase-2 pathway as a potential therapeutic target in diabetic peripheral neuropathy〔J〕.Curr Drug Targets，2008；9(1)：68-76.

4Sima AA.Pathological mechanisms involved in diabetic neuropathy：can we slow the process〔J〕?Curr Opin Invest Drugs,2006；7(4)：324-37.

〔2014-03-21修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：韓杰(1966-)，男，醫(yī)學博士，教授，碩士生導師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

中圖分類號〔〕R285.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6072-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.029