不同濃度LBH589對人前列腺癌PC3細胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表達的影響

韋士勤，李常穎，李保國，李建民，王麗麗，王海濤( 天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060;天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，天津泌尿外科研究所)

不同濃度LBH589對人前列腺癌PC3細胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表達的影響

韋士勤1，李常穎2，李保國1，李建民2，王麗麗1，王海濤1
( 1天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060;2天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，天津泌尿外科研究所)

摘要:目的觀察不同濃度組蛋白去乙?；敢种苿㎜BH589對人前列腺癌PC3細胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表達的影響。方法選擇1、10、100 nmol/L的LBH589處理PC3細胞，采用MTT法測算細胞增殖抑制率，實時定量PCR、Western blotting法分別檢測細胞EZH2的mRNA和蛋白。結果隨著濃度和時間的增加，LBH589對PC3細胞的抑制作用呈現明顯的時間-劑量關系( P均＜0.05)。相同時間時，隨著LBH589濃度的增加，PC3細胞EZH2的mRNA、蛋白表達逐漸降低( P均＜0.05) ;相同濃度時，隨著時間的延長，PC3細胞EZH2的mRNA、蛋白表達逐漸降低( P均＜0.05)。結論LBH589可抑制PC3細胞的增殖，同時可使細胞EZH2的mRNA及蛋白表達降低，且隨著濃度的增加作用增強。

關鍵詞:前列腺腫瘤;去乙?；敢种苿?細胞增殖;多梳蛋白zeste基因增強子類同源物2

組蛋白乙?；?去乙酰化修飾是基因轉錄調控的關鍵機制，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。組蛋白

乙酰化狀態(tài)由組蛋白乙?；? HATs)和組蛋白去乙酰化酶( HDACs)調節(jié)［1］。多梳蛋白zeste基因增強子類同源物2( EZH2)是多梳抑制復合物( PRC2)的催化亞基，是一種高度保守的組蛋白甲基轉移酶，能使組蛋白3第27位賴氨酸( H3K27)三甲基化［2］。EZH2在轉移性前列腺癌中呈現高表達［2］，并且EZH2的高表達可以抑制多種腫瘤抑制基因的表達從而促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移。目前EZH2抑制劑的研究在轉移性前列腺癌方面尚處于臨床前研究階段。PRC2與HDACs在結構和功能上具有聯系［3］，因此是否可以通過HDACs抑制劑的作用來抑制EZH2的活性有待研究。LBH589是一種新型的廣譜HDACs抑制劑，本研究觀察了不同濃度LBH589對人前列腺癌PC3細胞增殖及EZH2表達的影響。

1　材料與方法

1.1細胞與試劑人前列腺癌細胞系PC3由天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿研究所提供。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司;四甲基偶氮唑鹽( MTT)、LBH589購自Sigma公司(將LBH589溶解于DMSO，稀釋為10 μmol/L備用)。兔抗人EZH2多克隆抗體。

1.2 PC3細胞培養(yǎng)和傳代將PC3細胞置于10%胎牛血清+ DMEM +雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)完全培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，2～3 d傳代1次。

1.3 PC3細胞增殖抑制率檢測采用MTT法。取培養(yǎng)至對數生長期的PC3細胞以5×103/mL的密度接種于96孔板，每孔200 μL，每組設3個復孔，置于37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待24 h細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，實驗組加入LBH589使其終濃度分別為1、10、100 nmol/L，并設對照組和調零孔。各組分別作用24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT( 5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h。吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜( DMSO)。在平板搖床搖10 min待紫色結晶溶解后，全波長掃描多功能讀數儀檢測各組490 nm波長處每孔的光密度( OD)值。按下列公式計算細胞增殖抑制率:細胞增殖抑制率= ( 1－實驗組OD平均值/對照組OD平均值)×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.4 PC3細胞EZH2 mRNA檢測方法采用實時定量PCR。取對數生長期PC3細胞，實驗組分別加入終濃度為1、10、100 nmol/L的LBH589繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。同時設立空白對照組。取實驗組及空白對照組PC3細胞。按照TRIzol RNA提取說明書操作法提取總RNA。經紫外分光光度法鑒定、定量后，分別取總RNA 1 μg，按逆轉錄試劑盒說明書操作，逆轉錄反應合成cDNA。以反應所得cDNA進行SYBR實時定量PCR擴增。GAPDH上游引物: 5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'，下游引物: 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'。EZH2上游引物: 5'-AGGACGGCTCCTCTAACCAT-3'，下游引物: 5'-CTTGGTGTTGCACTGTGCTT-3'。擴增條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃繼續(xù)延伸5 min，共30個循環(huán)。溶解曲線為單一峰，mRNA相對表達量結果以2－ΔΔCt表示。

1.5 PC3細胞EZH2蛋白檢測方法采用Western blotting法。取上述實驗組及空白對照組PC3細胞，胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌2次，加入高效RIPA細胞裂解液和蛋白酶抑制劑( PMSF) ( 10∶1)，冰上裂解1 h，每隔15 min振蕩器上震蕩1次，12 000 g離心10 min后收集上清，BCA法行蛋白定量，取20 μg蛋白于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠( SDS-PAGE)電泳分離，蛋白質轉移至PVDF膜，5%牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜5 min× 3次，加入EZH2一抗、鼠抗人β-actin工作濃度1∶1 000，4℃孵育過夜; TBST漂洗，加入1∶10 000辣根過氧化物酶( HRP)標記的二抗羊抗兔IgGHRP，HRP標記的二抗羊抗鼠IgG-HRP，室溫搖床孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min。最后用ECL化學發(fā)光試劑和膠曝光機曝光，以GAPDH為內參對照，計算各組細胞EZH2蛋白相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

隨著濃度和時間的增加，LBH589對PC3細胞的抑制作用呈現明顯的時間-劑量關系( P均＜0.05)，結果見表1。各組PC3細胞EZH2 mRNA、蛋白表達比較見表2。相同時間時，隨著LBH589濃度的增加，PC3細胞EZH2的mRNA、蛋白表達逐漸降低( P均＜0.05) ;相同濃度時，隨著時間的延長，PC3細胞EZH2的mRNA、蛋白表達逐漸降低( P均＜0.05)。

3　討論

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在歐美地區(qū)其發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位，近年來我國前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［4］。目

表1　不同濃度LBH589對PC3細胞增殖的抑制作用(±s)

表1　不同濃度LBH589對PC3細胞增殖的抑制作用(±s)

LBH589 ( nmol/L)細胞增殖抑制率( %) 24 h　48 h　72 h 1 16.32±0.20　 24.27±0.30　 35.11±0.32 10　25.02±0.03　 35.64±0.17　 44.02±0.20 100　56.00±0.49　 67.64±0.74　 84.55±0.73

表2　各組PC3細胞HDAC1、HDAC2、EZH2 mRNA及蛋白表達比較(±s)

表2　各組PC3細胞HDAC1、HDAC2、EZH2 mRNA及蛋白表達比較(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別EZH2 mRNA 蛋白實驗組1 nmol/L LBH589 24 h　0.51±0.03　0.56±0.06 48 h　0.19±0.11*　0.25±0.04*10 nmol/L LBH589 24 h　0.39±0.08　0.45±0.03 48 h　0.12±0.05*　0.19±0.04*100 nmol/L LBH589 24 h　0.35±0.17　0.39±0.02 48 h　0.08±0.17*　0.12±0.06*空白對照組1.00±0.00　0.91±0.12

前前列腺癌的治療包括手術切除、內分泌治療及輔助治療，其中中晚期前列腺癌以內分泌治療為主。我國大多數前列腺癌在診斷時已處于中晚期，雖然內分泌治療可以使大多數患者的病情得到控制和改善，但在經過中位時間為18～24個月的緩解期后，絕大多數患者會發(fā)展為去勢難治性前列腺癌( CRPC)。CRPC患者預后極差，對傳統(tǒng)治療的有效率僅為10%～20%，因此迫切需要尋找新的治療靶點。

近年來研究發(fā)現，表觀遺傳調控因子PcG蛋白表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，而其核心成分EZH2也受到更多的關注。EZH2主要起組蛋白甲基轉移酶的作用，能使H3K27側鏈上的ε氨基發(fā)生三甲基化。H3K27三甲基化被認為是在PcG沉默機制中起作用的主要存在形式。三甲基化后的H3K27能將PRC1復合物招募到特定基因位點，從而沉默與細胞分化、抑制增殖在內的基因，導致腫瘤的發(fā)生。EZH2在前列腺癌、乳腺癌、膠質瘤等一系列的腫瘤組織中高表達［5］，在良性前列腺腫瘤、局限性前列腺癌無表達或弱表達，而在轉移性前列腺癌中高表達［6］。EZH2的高表達可以抑制多種腫瘤抑制基因的表達從而促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移［7］。目前EZH2抑制劑有競爭性的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑DZNep和EZH2競爭性抑制劑GSK126、UNC1999等［8］。EZH2抑制劑目前主要用于淋巴瘤的研究［9］，在前列腺癌的治療中尚處于臨床前研究階段。Kirk等［10］發(fā)現依托泊苷聯合EZH2抑制劑GSK126或DZNep可明顯促進鼠前列腺癌細胞凋亡，但尚不能滿足于臨床治療。

PRC2與HDACs在結構和功能上具有聯系［11］，PRC2有組蛋白乙酰轉移酶活性，在人類細胞中PRC2的結構與HDAC1和HDAC2相關聯。雖然大量生化研究證明HDAC不是組成PRC2的核心元件，但兩者之間短暫的相互作用可影響相關的轉錄酶表達。本研究結果發(fā)現，LBH589對PC3細胞具有明顯的增殖抑制效應，抑制作用有明顯的時間-劑量依賴性。且實時定量PCR及Western blotting結果顯示，不同濃度LBH589可以明顯降低EZH2的表達，且有明顯的時間-劑量依賴性。

綜上所述，LBH589可抑制PC3細胞的增殖，同時可使細胞EZH2表達降低，且隨著濃度的增加作用增強。

參考文獻:

［1］Mahlknecht U，Hoelzer D.Histone acetylation modifiers in the pathogenesis of malignant disease［J］.Mol Med，2000，6( 8) : 623-644.

［2］Vlkel P，Dupret B，Le Bourhis X，et al.Diverse involvement of EZH2 in cancer epigenetics［J］.Am J Transl Res，2015，7( 2) :175-193.

［3］Tonini T，Bagella L，D'Andrilli G，et al.Ezh2 reduces the ability of HDAC1-dependent pRb2/p130 transcriptional repression of cyclin A［J］.Oncogene，2004，23( 28) : 4930-4937.

［4］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65( 1) : 5-29.

［5］Bachmann IM，Halvorsen OJ，Collett K，et al.EZH2 expression is associated with high proliferation rate and aggressive tumor subgroups in cutaneousmelanoma and cancers of the endometrium，prostate，and breast［J］.J Clin Oncol，2006，24( 2) : 268-273.

［6］Cardoso C，Mignon C，Hetet G，et al.The human EZH2 gene: genomic organisation and revised mapping in 7q35 within the critical region for malignantmyeloid disorders［J］.Eur J Hum Genet，2000，8( 3) : 174-180.

［7］Verma SK.Inhibition of the histone lysine methyltransferase EZH2 for the treatment of cancer［J］.Curr Top Med Chem，2015，15 ( 8) : 714-719.

［8］McCabe MT，Creasy CL.EZH2 as a potential target in cancer therapy［J］.Epigenomics，2014，6( 3) : 341-351.

［9］McCabe MT，Ott HM，Ganji G，et al.EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations［J］.Nature，2012，492( 7427) : 108-112.

［10］Kirk JS，Schaarschuch K，Dalimov Z，et al.Top2a identifies and provides epigenetic rationale for novel combination therapeutic strategies for aggressiveprostate cancer［J］.Oncotarget，2015，6 ( 5) : 3136-3146.

［11］Volkel P，Dupret B，Le Bourhis X，et al.Diverse involvement of EZH2 in cancer epigenetics［J］.Am J Transl Res，2015，7( 2) : 175-193.

收稿日期:( 2015-05-21)

文章編號:1002-266X( 2015)31-0032-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.25

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.012

通信作者:王海濤

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81301949) ;天津市衛(wèi)生行業(yè)重大公關項目( 14KG141) ;天津市科技計劃項目( 13ZCZCSY20300)。