mM-CSF及其剪切體重組逆轉錄病毒表達載體的構建

馬翠花，廖金鳳，王大剛，劉淑艷，任倩，鄭國光( 1秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000;中國醫(yī)學科學院血液學研究所血液病醫(yī)院)

mM-CSF及其剪切體重組逆轉錄病毒表達載體的構建

馬翠花1，2，廖金鳳2，王大剛2，劉淑艷2，任倩2，鄭國光2
( 1秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000;2中國醫(yī)學科學院血液學研究所血液病醫(yī)院)

摘要:目的構建膜結合型M-CSF( mM-CSF)及其胞內區(qū)截短30個氨基酸的剪切體( mM-CSF-Δ)重組逆轉錄病毒表達載體。方法用DNA重組技術構建并鑒定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重組逆轉錄病毒表達載體MSCVPGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ，與空載體對照MSCV-PGK-GFP分別轉染Phoenix細胞包裝病毒，并感染HEK293細胞，通過流式分選術獲得3種陽性細胞。結果經Phoenix包裝的重組及對照逆轉錄病毒成功感染HEK293細胞，獲得了穩(wěn)定表達細胞株HEK293-M、HEK293-M-Δ和對照細胞株HEK293-V。RT-PCR以及Western blotting法檢測發(fā)現HEK293細胞中有mM-CSF和mM-CSF-Δ的表達，HEK293-M細胞和HEK293-M-Δ細胞經流式抗體標記后均能檢測到膜蛋白的表達。結論成功構建了mM-CSF及其剪切體的重組逆轉錄病毒表達載體。

關鍵詞:mM-CSF;剪切體;逆轉錄病毒表達載體; HEK293細胞系

Construction of membrane-bound macrophage colony-stimulating factor and recombinant retroviral expression vector of spliceosome

MA Cui-hua1，LIAO Jin-feng，WANG Da-gang，LIU Shu-yan，REN Qian，ZHENG Guo-guang
( 1 The First Hospital of Qinhuangdao City，Qinhuangdao 066000，China)

Abstract:Objective To construct membrane-bound macrophage colony-stimulating factor ( mM-CSF) and recombinant retroviral expression vector of brachytmema mutation of 30 amino acide located in the intracellular region of mM-CSF ( mM-CSF-Δ).Methods The retroviral vectors MSCV-PGK-GFP-mM-CSF and MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ were constructed and identified by DNA recombinant techniques.Recombinant and empty vectors were used to transfect the packaging Phoenix cells.HEK293 cells were infected by the viral supernatants.After being sorted by flow cytometry，three positive cell lines were obtained.Results HEK293 cells were successfully infected by retroviruses in packaging Phoenix cells and control retrovirus.Stable expressing cell lines，HEK293-M and HEK293-M-Δ as well as control cell line HEK293-V，were established.The expression of mM-SCF and mM-CSF-Δ was detected by RT-PCR and Western blotting in HEK293 cells and its membrane protein expression was also detected by flow cytometry.Conclusion The mM-CSF and recombinant retroviral expression vector of spliceosome were successfully constructed.

Key words:membrane-bound macrophage colony-stimulating factor; spliceosome; retroviral expression vector; HEK293 cell line

巨噬細胞集落刺激因子( M-CSF)是造血系統(tǒng)細胞因子調控網絡中的一個重要成員，是一個多功能的細胞因子，經選擇性剪接可形成膜結合型M-CSF ( mM-CSF)。mM-CSF在霍奇金淋巴瘤和髓系白血病細胞中高表達［1］，可與相鄰細胞膜表面的M-CSF受體作用，形成并置性刺激［2］，調節(jié)單核/巨噬細胞的增殖、分化等。本實驗構建了mM-CSF及其胞內區(qū)截短30個氨基酸剪切體( mM-CSF-Δ)的重組逆轉錄病毒表達載體，并感染HEK293細胞系，為研究mM-CSF胞內區(qū)及胞外區(qū)的作用機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料和試劑E.coli DH5α菌株、人mMCSF-Δ表達質粒pTARGET-mM-CSF-Δ、人mM-CSF表達質粒pTARGET-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP質

粒、Phoenix包裝細胞、HEK293細胞系均由天津市血液學研究所惠贈。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、PyrobestTMDNA聚合酶、質粒提取和膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司，PCR擴增引物的合成與DNA測序均由上海生工公司完成。Anti-M-CSF抗體購自Santa公司，APC-anti-rabbit二抗為Biolegend公司產品。

1.2重組逆轉錄病毒表達載體的構建選取逆轉錄病毒表達載體MSCV-PGK-GFP載體MCS處雙酶切位點( XhoⅠ和BglⅡ)用以插入目的基因，分別以pTARGET-mM-CSF和pTARGET-mM-CSF-Δ質粒為模板，用mM-CSF( Forward為5'-ATACTCGAGTGC CCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-GGCAGATCTCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段長度為771 bp)和mM-CSF-Δ( Forward為5'-ATACTCGAGTGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-GGCAGATCTCTACCGCCGCCTCCACCTGT-3';片段長度為681 bp)的克隆引物進行PCR，反應條件均為94℃預變性5 min; 94℃變性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃延伸7 min結束反應。膠回收、連接、轉化感受態(tài)方法如文獻［3］報道，陽性質粒酶切鑒定，并進行DNA測序。PCR鑒定重組質粒插入片段長度均正確，用XhoⅠ和BglⅡ雙酶切進行鑒定，結果能切除長度相符的目的片段，測序結果與GenBank公布的序列( NC_000001.11)完全一致。成功構建的載體分別命名為MSCV-PGK-GFP-mMCSF和MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ。

1.3細胞培養(yǎng)與逆轉錄病毒包裝Phoenix細胞和HEK293細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清( FBS)的DMEM培養(yǎng)基內，每3 d換液1次，0.25%胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。病毒的包裝轉染前1 d，將處于對數生長期的Phoenix細胞以6×106/皿的密度消化傳代于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，觀察細胞融合至90%、狀態(tài)良好時換液4 mL，按照LipofectamineTM2000說明進行操作，將MSCV-PGK-GFP-mMCSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ和空載體MSCVPGK-GFP質粒分別轉染上述Phoenix細胞，6 h后換液8 mL，轉染后48、72 h，顯微鏡觀察顯示幾乎所有的Phoenix細胞都表達GFP標記蛋白，收集病毒上清，0.45 μm濾器過濾后，－80℃保存。

1.4細胞感染及陽性細胞的篩選實驗分三組進行，將上述攜帶MSCV-PGK-GFP-mM-CSF、MSCVPGK-GFP-mM-CSF-Δ和空載體MSCV-PGK-GFP的病毒分別感染HEK293細胞。收集處于對數生長期的HEK293細胞，以1×106個/孔的密度接種于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后感染(方法詳見本室文獻［3］)，感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察HEK293細胞GFP表達陽性率約60%，消化傳代并將細胞移至培養(yǎng)瓶中，每2 d換液1次，除去壞死細胞碎片。培養(yǎng)3代以后，將細胞制備成單細胞懸液，以GFP作為分選標志，流式細胞儀分選純化，獲得的3種＞95% GFP陽性細胞，分別命名為HEK293-M、HEK293-M-Δ和對照細胞株HEK293-V。

1.5陽性細胞株中的基因表達及蛋白定位鑒定應用RT-PCR及Western blotting鑒定穩(wěn)定表達的細胞株。收集HEK293-M、HEK293-M-Δ和對照細胞株HEK293-V，用RT-PCR檢測mM-CSF基因。按產品說明書，用TRIzol提取細胞總RNA，并用MML-V反轉錄酶將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，以甘油醛三磷酸脫氫酶( GAPDH)為內參( Forward為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，Reverse為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';片段長度為226 bp)，取2 μL進行PCR，進行25個循環(huán)，具體反應條件同1.2所述，產物經瓊脂糖凝膠電泳。收集HEK293-M、HEK293-M-Δ和HEK293-V細胞各5×106個，分別加入裂解液提取總蛋白。樣品經10% SDS-PAGE分離后，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶4℃封閉過夜，1∶200稀釋M-CSF抗體室溫孵育2 h，洗膜后1∶2 000稀釋二抗室溫孵育1 h，最后在暗室中以化學發(fā)光法顯色，X線片曝光。應用流式細胞術分析蛋白定位。收集HEK293-M、HEK293-M-Δ和HEK293-V細胞各1×106個，分別經PBS磷酸緩沖液稀釋后，1∶100稀釋M-CSF抗體4℃孵育20 min;洗滌后1∶100稀釋二抗( APC標記) 4℃孵育20 min;洗滌后流式細胞儀分析。

2　結果

RT-PCR以及Western blotting法均能檢測到HEK293細胞中mM-CSF和mM-CSF-Δ的表達(見圖1)，HEK293-M細胞和HEK293-M-Δ細胞經流式抗體標記后均能檢測到膜蛋白的表達。

3　討論

M-CSF為單基因編碼的二聚體蛋白，經選擇性剪接，可形成mM-CSF、分泌型CSF( sM-CSF)和基質型CSF( PG-M-CSF) 3種形式的蛋白［4］，其受體均為c-fms原癌基因編碼的跨膜糖蛋白［5］。mM-CSF由于其前體缺乏相應的蛋白酶切位點而形成膜結合型分子，不僅可以通過異常活化巨噬細胞促進血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展［6］，而且在乳腺癌、甲狀腺癌、前列腺癌中也發(fā)揮重要作用［7～9］。

圖1　 HEK293細胞中mM-CSF和mM-CSF-Δ的表達檢測

近年來，膜結合型細胞因子作為配體參與細胞通信受到廣泛關注。當膜結合型配體與細胞膜上相應的受體結合后，膜結合型的配體可以向其所在的細胞內傳遞反向信號［10，11］，從而影響血管新生及血管生成、免疫細胞的發(fā)育成熟、T/B細胞的活化及細胞的凋亡等。膜結合型的TNF-α可與NK細胞表面的TNF受體2作用，活化胞內NF-κB信號通路，刺激GM-CSF分泌，調節(jié)免疫反應［12］。應用逆轉錄病毒載體介導膜結合型IL-15( mIL-15)在NK細胞表面表達，發(fā)現mIL-15可以以自分泌的方式激活胞內抗凋亡信號通路，發(fā)揮抗腫瘤效應［13］。mM-CSF作為膜結合型配體，其在細胞通信及胞內胞外區(qū)發(fā)揮作用的機制為我們關注的焦點。

逆轉錄病毒載體是目前研究最多的一類RNA病毒載體，其可轉染細胞范圍廣，效率高，并可將目的基因整合到受體細胞基因組中，使目的基因得以穩(wěn)定高效的表達，被認為是比較理想的轉基因載體［14，15］。逆轉錄病毒表達載體MSCV-PGK-GFP是由1.3 kb的PGK-GFP代替MSCV載體中的neo基因改造而成，GFP標簽的引入不僅便于觀察，而且提高了陽性細胞的分選效率。本研究通過酶切和亞克隆技術成功構建了重組逆轉錄病毒表達載體MSCV-PGK-GFP-mM-CSF和MSCV-PGK-GFP-mMCSF-Δ，通過轉染及篩選產生高滴度逆轉錄病毒顆粒，分別感染得到穩(wěn)定表達mM-CSF及mM-CSF-Δ 的HEK293細胞株，為下一步研究奠定了基礎。

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收稿日期:( 2015-03-09)

通信作者簡介:鄭國光( 1967-)，男，博士，研究員，主要研究方向為血液細胞生物學、分子生物學。E-mail: zhengggtjchn@ aliyun.com

作者簡介:第一馬翠花( 1981-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向為分子生物學。E-mail: michellemch@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81370634)。

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0005-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.002