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    miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

    2016-01-20 13:55:08羅湘玉羅衛(wèi)民張軍林稱意郭家龍湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院湖北十堰442000
    山東醫(yī)藥 2015年31期
    關(guān)鍵詞:肺腫瘤細(xì)胞增殖非小細(xì)胞肺癌

    羅湘玉,羅衛(wèi)民,張軍,林稱意,郭家龍(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院,湖北十堰442000)

    miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

    羅湘玉,羅衛(wèi)民,張軍,林稱意,郭家龍
    (湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院,湖北十堰442000)

    摘要:目的miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響。方法采用qRT-PCR檢測(cè)miR-222在A549、16HBE細(xì)胞中的表達(dá);將miR-222 mimics、scramble、TIMP3-siRNA與si-control分別轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞(設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組),Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中的TIMP3蛋白,MTT法和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖與侵襲能力。結(jié)果miR-222在A549、16HBE細(xì)胞的表達(dá)分別為0.767±0.086、0.405 ±0.034,兩者比較,P<0.01。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組A549細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)分別為0.416 ±0.023、0.732±0.019、0.430±0.020與0.803±0.025,實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組比較,實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)4組比較,P均<0.05。在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-222或沉默TIMP3 48、72、96 h后,細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)( P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組A549細(xì)胞48 h后穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)分別為( 104±5)、( 204±8)、( 99± 4)、( 188±7)個(gè),實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組比較,實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)4組比較,P均<0.05。結(jié)論miR-222基因轉(zhuǎn)染的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力增強(qiáng),其可能與miR-222靶向調(diào)控TIMP3作用有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:微小核糖核酸222;肺腫瘤;非小細(xì)胞肺癌;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3;細(xì)胞增殖;細(xì)胞侵襲

    Effects of miR-222 gene transfection on proliferation and invasion of human non-small-cell lung cancer cells

    LUO Xiang-yu,LUO Wei-min,ZHANG Jun,LIN Chen-yi,GUO Jia-long
    ( Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

    Abstract:Objective To investigate the effects of miR-222 gene transfection on proliferation and invasion of human nonsmall-cell lung cancer cells.Methods The qRT-PCR was employed to detect the expression of miR-222 in A549 and 16HBE cells.The miR-222 mimics,scramble,TIMP3-siRNA and si-control sequence were transfected into A549 cells ( experimental group 1,experimental group 2,experimental group 3 and experimental group 4),respectively.Western blotting was used to detect the expression of TIMP3 protein.The proliferation and invasion abilities were evaluated by MTT and Transwell invasion assay.Results The expression of miR-222 in A549 cells and 16HBE cells was respectively 0.767±0.086 and 0.405±0.034 ( P <0.01).The expression levels of TIMP3 protein in the A549 cells of the experimental group 1,experimental group 2,experimental group 3 and experimental group 4 were 0.416±0.023,0.732±0.019,0.430±0.020 and 0.803±0.025,respectively.Significant difference was found between the experimental groups 1 and 2,between the experimental groups 3 and 4 ( all P<0.05).The cell proliferation ability was increased in A549 cells after overexpressing miR-222 and silencing TIMP3 for 48 h,72 h and 96 h ( all P<0.05).After 48 h,in the A549 cells,the number of cells through the basement membrane in the experimental group 1,experimental group 2,experimental group 3 and experimental group 4 were 104±5,204±8,99±4 and 188±7,respectively.Significant difference was found between the experimental groups 1 and 2,between the experimental groups 3 and 4 ( all P<0.05).Conclusion The proliferation and invasion abilities of human non-small-cell lung cancer cells transfected by miR-222 are enhanced which may be related with miR-222 targeted-regulating TIMP3.

    Key words:microRNA-222; lung neoplasm; non-small-cell lung cancer; matrix metalloproteinase inhibitor 3; cell proliferation;cell invasion

    腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及多種基因的參與和多種因子的調(diào)控。miRNA是重要的調(diào)控因子,通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)癌基因或抑癌基因,從而參與多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程[1,2]。目前研究者發(fā)現(xiàn)的miRNA已有上百種,其中miRNA-222是一個(gè)重要的miRNA分子。miRNA-222在多種腫瘤中表達(dá)增高,包括乳腺癌[3]、膀胱癌[4]、結(jié)腸癌[5]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]以及胰腺癌[7],提示miRNA-222可能是一個(gè)潛在的致癌因子。TIMP3在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào),并且與腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲相關(guān)[8,9]。目前對(duì)于miRNA-222與TIMP3在肺癌中表達(dá)情況及相關(guān)作用尚未明確,本研究觀察了miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響。

    1 材料與方法

    1.1主要材料人支氣管上皮細(xì)胞16HBE和非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng); RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司(美國(guó)) ; MTT粉購(gòu)自Sigma公司(美國(guó)) ; Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó)) ; Transwell小室購(gòu)自BD公司(美國(guó)) ; miR-222 mimics(用于過(guò)表達(dá)miR-222)、scramble(用于miRNA對(duì)照)、TIMP3-siRNA(用于沉默TIMP3)與si-control(用于沉默TIMP3對(duì)照)序列均由Exiqon公司設(shè)計(jì)合成; RNA抽提試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司; TIMP3和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(美國(guó))。

    1.2 A549、16HBE細(xì)胞miR-222檢測(cè)采用qRTPCR。用RNA抽提試劑盒抽提16HBE和A549細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA保存于-80℃冰箱中備用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL,其中包括MiR-PCR primers ( 5 mmol/L) 0.4 μL,miRNA RT product 2.0 μL,Taq DNA polymerase 5 U/μL) 0.2 μL,2×SYBR Mix 10 μL,滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為95℃3 min,95℃12 s,62℃35 s,72℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,所測(cè)定的miR-222的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

    1.3 A549細(xì)胞miR-222轉(zhuǎn)染方法及分組消化A549細(xì)胞,吹打成單細(xì)胞懸液并收集離心。傾棄上清培養(yǎng)液,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,制成1×105個(gè)細(xì)胞/mL的懸液,用250 μL不含血清的培養(yǎng)液稀釋100 pmol miRNA 和siRNA,輕輕混勻,室溫下孵育5 min;用250 μL不含血清的培養(yǎng)液稀釋5 μL的Lipofectamine 2000,輕輕混勻,室溫孵育5 min,然后將上述兩種稀釋液輕輕混勻,室溫孵育15 min。分別將兩者混合液500 μL加入上述不含抗生素和血清的培養(yǎng)孔中,輕輕混勻。分別將miR-222 mimics、scramble、TIMP3-siRNA、si-control轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組。

    1.4 A549細(xì)胞TIMP3蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。取四組A549細(xì)胞,48 h后抽提各組細(xì)胞總蛋白,每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳后轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,加入DNMT3A抗體或βactin抗體,4℃過(guò)夜,TBST洗膜,加二抗孵育1 h,洗膜,ECL發(fā)光,X片曝光、顯影、定影。

    1.5 miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

    采用MTT法。取四組A549細(xì)胞,將各組細(xì)胞接種于96孔板中,設(shè)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)至臨近飽和,加滅菌MTT液20 μL/孔,繼續(xù)孵育4 h取出,加入DMSO 150 μL/孔,低速振蕩10 min,選擇波長(zhǎng)570 nm,在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔細(xì)胞在24、48、72和96 h的吸光值,并記錄。

    1.6 miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

    采用Transwell法。在Transwell小室中鋪加基質(zhì)膠稀釋液放置過(guò)夜成膜。次日取四組A549細(xì)胞100 μL稀釋液接種至小室的上腔,下腔加500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,取出,擦棄小室上層細(xì)胞,4%甲醛固定,0.1%結(jié)晶祡染色。光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值。

    1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示,組間比較用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    miR-222在A549、16HBE細(xì)胞的表達(dá)分別為0.767±0.086、0.405±0.034,兩者比較,P<0.01。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組A549細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)分別為0.416± 0.023、0.732±0.019、0.430±0.020與0.803 ±0.025,實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組比較,實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)4組比較,P均<0.05。在A549細(xì)胞中miR-222基因轉(zhuǎn)染或沉默TIMP3 48、72、96 h后,細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),詳見表1。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)4組A549細(xì)胞48 h后穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)分別為( 104±5)、( 204±8)、( 99±4)、( 188±7)個(gè),實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組比較,實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)4組比較,P均<0.05。

    表1  miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(±s)

    表1  miR-222基因轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(±s)

    注:實(shí)驗(yàn)1組與實(shí)驗(yàn)2組比較,*P<0.05,#P<0.01;實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)4組比較,△P<0.05,▲P<0.01。

    組別細(xì)胞增殖24 h 48 h 72 h 96 h實(shí)驗(yàn)1組 0.436±0.025  0.590±0.047* 0.740±0.042# 0.852±0.065#實(shí)驗(yàn)2組 0.419±0.010  0.485±0.023  0.569±0.036  0.636±0.031實(shí)驗(yàn)3組 0.423±0.021  0.600±0.042* 0.746±0.038▲ 0.843±0.024▲實(shí)驗(yàn)4組 0.418±0.018  0.501±0.021  0.580±0.037  0.645±0.027

    3 討論

    非小細(xì)胞肺癌包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌,是肺癌最常見的組織學(xué)類型,也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,其5年存活率低,約為13%[10]。miRNA是一類長(zhǎng)度為18~24個(gè)核苷酸的非編碼、內(nèi)源性小RNA分子,通過(guò)靶向結(jié)合mRNA的3'非編碼區(qū),使翻譯抑制或?qū)е耺RNA降解,進(jìn)而調(diào)控靶基因表達(dá)量[1]。miRNA參與重要生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控,包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等過(guò)程。目前,大量的研究者聚焦于腫瘤與表達(dá)失調(diào)的miRNAs之間關(guān)系的研究。研究[11,12]發(fā)現(xiàn)miRNA-222在多種腫瘤中有類似癌基因樣作用,通過(guò)抑制CDK抑制因子p27Kip1 和p57或上調(diào)EMT誘導(dǎo)基因ZEB2發(fā)揮致癌作用。miR-222在胰腺癌中表達(dá)上調(diào),通過(guò)下調(diào)Ki67促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。miR-222在乳腺癌中表達(dá)上調(diào),通過(guò)靶向脂聯(lián)素受體1促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化[13]。miR-222在卵巢癌和肝癌中表達(dá)上調(diào),分別通過(guò)靶向其靶基因p27Kip1與p27促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[14,15]。由此可見,miR-222在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn),外源高表達(dá)miR-222能明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲,提示miR-222在肺癌中具有潛在的促癌作用。

    Gan等[16]研究發(fā)現(xiàn),miR-222在乳腺癌中表達(dá)上調(diào),TIMP3是miR-222直接調(diào)控的靶基因,外源沉默乳腺癌細(xì)胞中miR-222的表達(dá)可通過(guò)上調(diào)TIMP3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性。TIMP3是一種前凋亡蛋白,與多種腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲相關(guān)[8]。研究[8,9]顯示,TIMP3在子宮內(nèi)膜癌以及胃癌中表達(dá)下調(diào),并且與患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),在肺癌細(xì)胞中外源過(guò)表達(dá)miR-222能下調(diào)TIMP3蛋白的表達(dá),而在肺癌細(xì)胞中沉默TIMP3后,肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力也明顯增強(qiáng),進(jìn)一步提示TIMP3是miR-222下游的功能靶點(diǎn),miR-222通過(guò)下調(diào)TIMP3的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

    綜上所述,miR-222基因轉(zhuǎn)染的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲能力增強(qiáng),其可能與miR-222靶向調(diào)控TIMP3作用有關(guān)。miR-222可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn),這為肺癌的防治提供了有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Tang H,Deng M,Tang Y,et al.miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression [J].Clin Cancer Res,2013,19( 20) : 5602-5612.

    [2]Liu J,Zheng M,Tang YL,et al.MicroRNAs,an active and versatile group in cancers[J].Int J Oral Sci,2011,3( 4) : 165-175.

    [3]Hwang MS,Yu N,Stinson SY,et al.miR-221/222 targets adiponectin receptor 1 to promote the epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer[J].PLoS One,2013,8( 6) : e66502.

    [4]Lee C,He H,Jiang Y,et al.Elevated expression of tumor miR-222 in pancreatic cancer is associated with Ki67 and poor prognosis [J].Med Oncol,2013,30( 4) : 700.

    [5]Zhang DQ,Zhou CK,Jiang XW,et al.Increased expression of miR-222 is associated with poor prognosis in bladder cancer[J].World J Surg Oncol,2014,12: 241.

    [6]Xu K,Liang X,Shen K,et al.MiR-222 modulates multidrug resistance in human colorectal carcinoma by down-regulating ADAM-17[J].Exp Cell Res,2012,318( 17) : 2168-2177.

    [7]Quintavalle C,Garofalo M,Zanca C,et al.miR-221/222 overexpession in human glioblastoma increases invasiveness by targeting the protein phosphate PTPμ[J].Oncogene,2012,31( 7) :858-868.

    [8]唐海林,蘇堅(jiān),鄧敏,等.胃癌組織中miR-222與TIMP3的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)腫瘤臨床,2012,39( 4) : 194-196.

    [9]Dong M,Yang P,Hua F.MiR-191 modulates malignant transformation of endometriosis through regulating TIMP3[J].Med Sci Monit,2015,21: 915-920.

    [10]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63( 1) : 11-30.

    [11]Howe EN,Cochrane DR,Richer JK.The miR-200 and miR-221/222 microRNA families: opposing effects on epithelial identity[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2012,17( 1) : 65-77.

    [12]Fornari F,Gramantieri L,F(xiàn)erracin M,et al.MiR-221 controls CDKN1C/p57 and CDKN1B/p27 expression in human hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2008,27( 43) : 5651-5661.

    [13]Hwang MS,Yu N,Stinson SY,et al.miR-221/222 targets adiponectin receptor 1 to promote the epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer[J].PLoS One,2013,8( 6) : e66502.

    [14]Sun C,Li N,Zhou B,et al.miR-222 is upregulated in epithelial ovarian cancer and promotes cell proliferation by downregulating P27kip1[J].Oncol Lett,2013,6( 2) : 507-512.

    [15]Yang YF,Wang F,Xiao JJ,et al.MiR-222 overexpression promotes proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells bydownregulating p27[J].Int J Clin Exp Med,2014,7( 4) :893-902.

    [16]Gan R,Yang Y,Yang X,et al.Downregulation of miR-221/222 enhances sensitivity of breast cancer cells to tamoxifen through upregulation of TIMP3[J].Cancer Gene Ther,2014,21( 7) : 290-296.

    收稿日期:( 2015-03-12)

    通信作者簡(jiǎn)介:羅衛(wèi)民( 1978-),男,副主任醫(yī)師,主要研究方向?yàn)槭彻馨?、肺癌的診斷及治療。E-mail: luoweimin0803@ sina.com

    作者簡(jiǎn)介:第一羅湘玉( 1972-),女,副主任護(hù)師,主要研究方向?yàn)槭彻馨⒎伟┑脑\斷及治療。E-mail: Luoxiangyu2000@126.com

    基金項(xiàng)目:湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目( B2015477)。

    文章編號(hào):1002-266X( 2015) 31-0014-03

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    中圖分類號(hào):R734.2

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.005

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