LBH589對腎癌細(xì)胞株OS-RC-2增殖的影響及機(jī)制探討

馬俊健，陳婷，劉彬，徐米清( 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州5400;2廣州市番禺區(qū)婦幼保健院; 廣州心血管疾病研究所)

LBH589對腎癌細(xì)胞株OS-RC-2增殖的影響及機(jī)制探討

馬俊健1，2，陳婷1，劉彬3，徐米清1
( 1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州511400;2廣州市番禺區(qū)婦幼保健院; 3廣州心血管疾病研究所)

摘要:目的觀察LBH589對腎癌細(xì)胞株OS-RC-2細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制。方法將人腎癌細(xì)胞株OS-RC-2細(xì)胞分為DMSO組、N-乙酰半胱氨酸( NAC)組、LBH589組和NAC + LBH589組，NAC組加入5 mmol/L NAC刺激2 h，LBH489組加入50 nmol/L LBH589刺激48 h，NAC + LBH589組先加入5 mmol/L NAC預(yù)處理2 h，洗脫后再以50 nmol/L LBH589刺激48 h。EdU法測算細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、活性氧簇( ROS)，Western blotting法檢測細(xì)胞p-STAT3、Cyclin D1蛋白。結(jié)果DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組EdU染色陽性細(xì)胞比例分別為53%±4%、52%±5%、7%±3%、29%±6%，細(xì)胞凋亡率分別為0.25%±0.13%、0.18%±0.15%、11.35%±2.40%、1.92%±0.63%，ROS分別為0.60%±0.26%、0.33%±0.25%、12.2%± 2.65%、5.33%±1.05%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組p-STAT3相對表達(dá)量分別為1.00±0.07、1.02±0.07、0.49±0.04、0.52±0.05，Cyclin D1相對表達(dá)量分別為1.00±0.08、1.03±0.08、0.45±0.04、0.49±0.03，DMSO組與LBH589組比較，P均＜0.05。結(jié)論LBH589對OS-RC-2腎癌細(xì)胞生長有抑制作用，其可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、升高ROS水平有關(guān)。LBH589能抑制STAT3信號通路，進(jìn)而使Cyclin D1表達(dá)下降，而LBH589誘導(dǎo)ROS升高不是通過抑制STAT3信號通路從而使腎癌細(xì)胞生長抑制。

關(guān)鍵詞:腎腫瘤;腎癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;組蛋白去乙?；敢种苿?/p>

Effect of LBH589 on cell proliferation of renal carcinoma cell line OS-RC-2 and its mechanism

MA Jun-jian1，CHEN Ting，LIU Bin，LI Ai-qun，XU Mi-qing
( 1 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 511400，China)

Abstract:Objective To observe the influences of LBH589 on cell proliferation of renal cancer cell line OS-RC-2 and to explore its mechanism.Methods OS-RC-2 cells were divided into the DMSO group，N-acetyl cysteine ( NAC) group，LBH589 group and NAC +LBH589 group.NAC group was stimulated with 5 mmol/L of NAC for 2 h，LBH489 group was stimulated with 50 nmol/L of LBH589 for 48 h，and the NAC +LBH589 group was pre-treated with 5 mmol/L of NAC for 2 h and then after elution，the group was stimulated with 50 nmol/L of LBH589 for 48 h.EdU assay was used to measure cell proliferation，flow cytometry was used to detect the apoptosis and reactive oxygen species ( ROS)，while Western blotting was used to detect p-STAT3 and Cyclin D1 proteins.Results The proportions of positive Edu cells in the DMSO group，NAC group，LBH589 group and NAC +LBH589 group were respectively 53%±4%，52%±5%，7%±3% and 29%±6%.The apoptosis rates of the corresponding groups were 0.25%±0.13%，0.18%±0.15%，11.35%±2.40% and 1.92%± 0.63%.ROS of the corresponding groups were 0.60%±0.26%，0.33%±0.25%，12.2%±2.65% and 5.33%± 1.05%.Significant difference was found between the DMSO，NAC +LBH589 groups and the LBH589 group ( all P＜0.05).The relative expression of p-STAT3 was 1.00±0.07，1.02±0.07，0.49±0.04 and 0.52±0.05 in the DMSO group，NAC group，LBH589 group and NAC +LBH589 group.The relative expression of Cyclin D1 was 1.00±0.08，1.03±0.08，0.45 ±0.04 and 0.49±0.03 in the corresponding groups.Significant difference was found between the DMSO group and the LBH589 group ( all P＜0.05).Conclusions LBH589 inhibits the growth of renal cancer cell line OS-RC-2，which may be related to induction of apoptosis，inhibition of cell proliferation and the increased ROS level.LBH589 can inhibit STAT3 sig-

naling pathway，thus decrease the expression of Cyclin D1.However，LBH589-induced ROS increase is not achieved through the inhibition of STAT3 signaling pathway to inhibit the growth of renal cancer cells.

Key words:kidney neoplasms; renal cell carcinoma; cell proliferation; apoptosis; histone deacetylase inhibitor

腎細(xì)胞癌( RCC)的治療以根治性手術(shù)為主，放療及化療效果不理想，手術(shù)后復(fù)發(fā)率大于20%［1］。因此，尋找和研發(fā)新的抗腎癌藥物十分必要。組蛋白去乙?；敢种苿? HDACIs)可通過細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)分化和凋亡等機(jī)制［2，3］對血液系統(tǒng)腫瘤和一些實(shí)體腫瘤有明顯抑制作用［4，5］。但HDACIs對腎癌細(xì)胞抑制作用的研究尚未見報道。HDACIs能提高細(xì)胞內(nèi)活性氧簇( ROS)水平，降低抗氧化系統(tǒng)作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。LBH589為一種新的HDACIs類藥物。本研究觀察了LBH589誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對腎癌細(xì)胞株OS-RC-2增殖的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑LBH589、N-乙酰半胱氨酸( NAC)購自Sigma公司;腎癌細(xì)胞株OS-RC-2(中國科學(xué)院細(xì)胞庫) ;胎牛血清、RPMI1640完全培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司; MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、EdU試劑盒購自廣州銳博公司;總ROS檢測試劑盒購自Enzo Life Sciences公司;兔抗人p-STAT3、Cyclin D1、GAPDH單抗，羊抗兔二抗購自美國Santa Cruzs公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將人腎癌細(xì)胞株OS-RC-2細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)到80%以上時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞進(jìn)行藥物刺激時，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基的DMSO終濃度為0.1%。

1.3 LBH589藥物濃度篩選采用MTT法檢測細(xì)胞生長情況。取對數(shù)生長期OS-RC-2細(xì)胞接種于96孔板，每孔0.2 mL。24 h后棄孔內(nèi)液體，每孔分別加入100 μL濃度為0、10、50、100、500、1 000 nmol/L LBH589的培養(yǎng)基，藥物處理24、48、72 h，每組5個復(fù)孔，每孔加50 μL 1×MTT，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，測D550值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LBH589呈時間和劑量依賴性抑制OS-RC-2細(xì)胞增殖，LBH589作用OS-RC-2細(xì)胞24、48、72 h，IC50分別為220、50、38 nmol/L，因此選擇50 nmol/L LBH589處理OS-RC-2細(xì)胞。

1.4細(xì)胞分組及LBH589干預(yù)將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，分為DMSO組、NAC組、LBH589組和NAC + LBH589組。各設(shè)3個復(fù)孔，NAC組加入5 mmol/L NAC刺激2 h，LBH489組加入50 nmol/L LBH589刺激48 h，NAC + LBH589組先加入5 mmol/L NAC預(yù)處理2 h，洗脫后再以50 nmol/L LBH589刺激48 h。

1.5細(xì)胞增殖檢測采用EdU法。取各組細(xì)胞行EdU標(biāo)記、細(xì)胞固化、EdU染色、Hoechst33342染色，激光共聚焦顯微鏡觀察并計算每個視野中的EdU染色陽性細(xì)胞百分比，共計算10個視野。激光共聚焦顯微鏡圖像分析顯示新增殖細(xì)胞經(jīng)EdU染色后表現(xiàn)為紅色熒光，所有活細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色后表現(xiàn)為藍(lán)色熒光，Overlay為紅色熒光和藍(lán)色熒光的重疊圖片。

1.6細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組對數(shù)生長期OS-RC-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，藥物刺激后PBS 洗2次，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集至相應(yīng)的流式管內(nèi)，行AnnexinV、PI染色，流式細(xì)胞儀檢測，分析凋亡細(xì)胞百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.7細(xì)胞ROS檢測采用流式細(xì)胞技術(shù)。取各組對數(shù)生長期OS-RC-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿。藥物刺激后PBS洗2次，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集至相應(yīng)的流式管內(nèi)，離心，PBS洗2次，每個流式管各加500 μL ROS Detection Solution，37℃避光30 min，流式儀檢測分析細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.8細(xì)胞p-STAT3、Cyclin D1表達(dá)檢測采用Western blotting法。取各組對數(shù)生長期細(xì)胞藥物處理后棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑，收集裂解混合液，12 000 r/min離心15 min，BCA法測定濃度。取30 μg蛋白標(biāo)本為上樣量，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，最后加入GAPDH、p-STAT3、Cyclin D1一抗和二抗，之后曝光顯影，重復(fù)5次，以Image J2x軟件進(jìn)行灰度分析，取平均值。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用單因素方差分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖情況比較DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組EdU染色陽性細(xì)胞比例分別為53%±4%、52%±5%、7%±3%、29%± 6%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組細(xì)胞凋亡率分別為0.25%±0.13%、0.18%±0.15%、11.35%± 2.40%、1.92%±0.63%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。

2.3各組細(xì)胞ROS比較DMSO組、NAC組、LBH589組、NAC + LBH589組細(xì)胞ROS分別為0.60%±0.26%、0.33%±0.25%、12.2%± 2.65%、5.33%±1.05%，DMSO組、NAC + LBH589組與LBH589組比較，P均＜0.05。

2.4各組細(xì)胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表達(dá)比較結(jié)果見表1。

表1　各組OS-RC-2細(xì)胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表達(dá)比較(±s)

表1　各組OS-RC-2細(xì)胞p-STAT3和Cyclin D1蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與DMSO組比較，*P＜0.05。

組別p-STAT3　Cyclin D1 DMSO組1.00±0.07　1.00±0.08 NAC組　1.02±0.07　1.03±0.08 LBH589組　0.49±0.04*　0.45±0.04*NAC + LBH589組0.52±0.05　0.49±0.03

3　討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LBH589對OS-RC-2腎癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，其抑制率具有濃度依賴性和時間依賴性。EdU增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示OS-RC-2細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L LBH589處理48 h后，細(xì)胞增殖數(shù)量明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果同樣顯示，50 nmol/L LBH589刺激OS-RC-2細(xì)胞48 h，其細(xì)胞凋亡比例比DMSO組明顯增加。ROS的大量產(chǎn)生可能是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵事件之一［6，7］。LBH589能顯著誘導(dǎo)OS-RC-2細(xì)胞ROS生成，NAC能減少LBH589作用細(xì)胞后ROS產(chǎn)生，從而減弱LBH589抑制細(xì)胞增殖及促細(xì)胞凋亡作用。這可能與LBH589處理細(xì)胞后細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)如ROS的堆積密切相關(guān)，而NAC作為一種強(qiáng)大的抗氧化劑及自由基清除劑能夠保護(hù)腎癌細(xì)胞，對抗LBH589對OS-RC-2細(xì)胞的生長抑制作用。

STAT3持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，目前已被公認(rèn)為癌基因［8，9］。它能調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，如通過上調(diào)Bcl-xL、McL-1、Cyclin D1和c-myc基因的作用參與腫瘤的形成［10，11］。Cyclin D1是參與細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子，過度表達(dá)的Cyclin D1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期前進(jìn)，加快腫瘤細(xì)胞的增殖速度。LBH589作用OS-RC-2腎癌細(xì)胞后p-STAT3、Cyclin D1的表達(dá)明顯下降，LBH589抑制p-STAT3及下游靶基因蛋白Cyclin D1的表達(dá)使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻從而使細(xì)胞增殖受到抑制。NAC預(yù)處理后再以LBH589刺激48 h，p-STAT3、Cyclin D1蛋白表達(dá)與LBH589組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。這可能因?yàn)長BH589誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的大量ROS并不是通過抑制STAT3信號通路使腎癌細(xì)胞生長抑制，而是通過其他的方式和途徑引起細(xì)胞凋亡，這需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

可見，LBH589對OS-RC-2腎癌細(xì)胞生長有抑制作用，其抗腫瘤機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、升高ROS水平有關(guān)。LBH589能抑制STAT3信號通路，進(jìn)而使Cyclin D1表達(dá)下降，而LBH589誘導(dǎo)ROS升高不是通過抑制STAT3信號通路從而使腎癌細(xì)胞生長抑制。

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收稿日期:( 2015-05-27)

通信作者簡介:徐米清( 1964-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟I臟疾病的診斷與治療。E-mail: gyeyxu@163.com

作者簡介:第一馬俊健( 1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槟I臟疾病的診斷與治療。E-mail: mjjtt121@163.com

基金項目:廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目( Yq2013133)。

文章編號:1002-266X( 2015)31-0008-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R737.11

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.003