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    磷酸化PKC-δ對地塞米松誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響

    2016-01-20 13:55:08付文舉張德志王國喜劉玉林泰州市第二人民醫(yī)院江蘇泰州5500遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院
    山東醫(yī)藥 2015年31期
    關(guān)鍵詞:成骨細(xì)胞

    付文舉,張德志,王國喜,劉玉林( 泰州市第二人民醫(yī)院,江蘇泰州5500;遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

    磷酸化PKC-δ對地塞米松誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響

    付文舉1,張德志2,王國喜1,劉玉林1
    ( 1泰州市第二人民醫(yī)院,江蘇泰州225500;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

    摘要:目的觀察磷酸化PKC-δ對地塞米松( Dex)誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響。方法取新生SD大鼠顱骨第3代成骨細(xì)胞,分為對照組、Dex組( 1×10-7mol/L Dex)、PMA預(yù)處理組( 1×10-7mol/L Dex + 100 nmol/L PMA)、Rottlerin預(yù)處理組( 1×10-7mol/L Dex +2 μmol/L Rottlerin),培養(yǎng)24 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性,采用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙/溴乙錠( AO/EB)熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡,采用Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及磷酸化PKC-δ。結(jié)果與對照組相比,Dex組細(xì)胞增殖活性低,細(xì)胞凋亡多,磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)高,Bcl-2表達(dá)低( P均<0.05)。與Dex組相比,PMA預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性低,細(xì)胞凋亡多,磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)高,Bcl-2表達(dá)低( P均<0.05)。與Dex組相比,Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性高,細(xì)胞凋亡少,磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)低,Bcl-2表達(dá)高( P均<0.05)。結(jié)論磷酸化PKC-δ可促進(jìn)Dex誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡。

    關(guān)鍵詞:蛋白激酶C-δ;半胱氨酸蛋白3; B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)蛋白x; B細(xì)胞淋巴瘤2;成骨細(xì)胞;細(xì)胞調(diào)亡

    Effect of phosphorylated PKC-δ on Dexamethasone-induced osteoblast apoptosis of rats

    FU Wen-jyu1,ZHANG De-zhi,WANG Guo-xi,LIU Yu-lin
    ( Second People's Hospital of Taizhou,Taizhou 225500,China)

    Abstract:Objective To observe the effect of phosphorylated protein kinase C-δ( PKC-δ) on Dexamethasone ( Dex) -induced osteoblast apoptosis of rats.Methods The osteoblasts of the third generation from newly born SD rats' calvaria were divided into four groups: the control group,Dex group ( 1×10-7mol/L Dex),PMA preconditioning group ( 1× 10-7mol/L Dex +100 nmol/L PMA) and Rottlerin preconditioning group ( 1×10-7mol/L Dex + 2 μmol/L Rottlerin).The cells of each group were incubated for 24 h.Then,the cell proliferation activity was measured by MTT assay,the apoptosis was detected by AnnexinⅤ-FITC/propidium iodide ( PI) -flow cytometry ( FCM) and acridine oringe/ethidium bromide ( AO/EB) staining,and the expression of the apoptosis-related proteins ( Bcl-2,Bax and Caspase-3) and phosphorylated PKC-δ was detected by Western blotting.Results Compared with the control group,the proliferation activity was reduced,the apoptosis was increased,the expression of phosphorylated PKC-δ,Caspase-3 and Bax was increased,while the Bcl-2 expression was decreased in the Dex group,and the difference was statistically significant ( all P<0.05).Compared with the Dex group,the cell proliferation activity was reduced,the apoptosis was increased,the expression of phosphorylated PKC-δ,Caspase-3 and Bax was increased,while the Bcl-2 expression was decreased in the PMA preconditioning group,and the difference was statistically significant ( all P<0.05).Compared with the Dex group,the cell proliferation activity was obviously higher,the apoptosis was decreased,the expression of phosphorylated PKC-δ,Caspase-3 and Bax was decreased,while the Bcl-2 expression was increased in the Rottlerin preconditioning group,and the difference was statistically significant ( all P<0.05).Conclusion The phosphorylated PKC-δ can promote the Dex-induced osteoblast apoptosis of rats.

    Key words:protein kinase C-δ; caspase-3; B-cell lymphoma related protein x; B-cell lymphoma 2; osteoblasts; apoptosis

    糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死是股骨頭壞死的主要原因之一,其病理生理機(jī)制中涉及蛋白激酶C ( PKC)信號途徑的激活[1]。PKC-δ是PKC家族的重要成員,可參與多種細(xì)胞凋亡因子刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[2~4],但在成骨細(xì)胞凋亡方面的研究較少。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控因素中,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax一直備受關(guān)注。因此,本研究觀察了磷酸化PKC-δ對Dex誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響,為明確Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑出生24 h內(nèi)SD大鼠10只,購自遼寧醫(yī)學(xué)院動物培養(yǎng)中心。胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Heclone公司,吖啶橙、溴乙錠、Ⅰ型膠原酶、MTT購自Sigma公司,茜素紅為國產(chǎn),PKC-δ選擇性抑制劑Rottlerin、PKC激活劑佛波酯( PMA)購自美國Calbiochem公司,抗磷酸化PKC-δ一抗購自北京博奧森試劑有限公司,Annexin V-FITC流式檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

    1.2方法

    1.2.1成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定取所有大鼠顱骨,采用酶消化法分離成骨細(xì)胞,按1×105/mL濃度接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng),置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,24 h后首次換液,以后每2 d換液1次,待細(xì)胞融合至80%左右時,進(jìn)行傳代,取第3代成骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)的方法鑒定。24 h內(nèi)細(xì)胞貼壁,形態(tài)上呈多形性,主要為長梭形,胞質(zhì)有突起,向外伸展; 1周后,細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列,多數(shù)呈鱗片狀,體較大,多偽足,胞質(zhì)豐富,胞核較大;繼續(xù)培養(yǎng),可見局部多層生長,并有黑色鈣結(jié)節(jié)生成。

    1.2.2成骨細(xì)胞凋亡模型建立取70%~80%融合的第3代成骨細(xì)胞,更換新鮮培養(yǎng)液,分為對照組(未做任何處理)、Dex組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1×10-7mol/L)、PMA預(yù)處理組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1×10-7mol/L、PMA濃度為100 nmol/L)、Rottlerin預(yù)處理組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1× 10-7mol/L、Rottlerin濃度為2 μmol/L),置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    1.2.3成骨細(xì)胞增殖活性檢測采用MTT法。取上述四組細(xì)胞,以1×105/mL接種于96孔板,每組8復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清,加入培養(yǎng)液稀釋的MTT( 1 mg/mL),每孔10 μL,置培養(yǎng)箱中4 h;棄上清,加入等體積二甲亞砜,振蕩10 min,結(jié)晶溶解,呈紫色溶液; BIO-RAD680型酶標(biāo)儀490 nm波長測吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.2.4成骨細(xì)胞凋亡檢測采用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙/溴乙錠( AO/EB)熒光染色法檢測。參照Annexin V-FITC流式檢測試劑盒說明收集上述四組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。取上述四組細(xì)胞,PBS沖洗2次,0.1 g/L的AO/EB混合液染色,凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒,正常細(xì)胞呈綠色熒光,在熒光顯微鏡下觀察200倍視野下,隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞所占的比例。細(xì)胞凋亡率( %) = (凋亡細(xì)胞/計數(shù)細(xì)胞總個數(shù))× 100%。

    1.2.5各組成骨細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ檢測采用Western blotting法。取上述四組細(xì)胞,以添加磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,獲取胞質(zhì)蛋白。等量蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,與抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體及抗磷酸化PKC抗體( 1∶400稀釋) 4℃孵育過夜,與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h,用ECL顯影在柯達(dá)膠片上。同一膜用洗脫液洗脫,檢測β-actin表達(dá)( Abcam一抗1∶3 000稀釋)作為內(nèi)對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示,組間比較用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組細(xì)胞增殖活性比較對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞吸光度值分別為0.437±0.013、0.379±0.012、0.369±0.013、0.410± 0.010,Dex組與其他三組比較,P均<0.05。

    2.2各組細(xì)胞凋亡率比較流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為3.5%±0.46%,19.0%± 0.54%、26.7%±0.69%、10.5%±0.35%,Dex組與其他三組比較,P均<0.05。

    AO/EB雙熒光檢測結(jié)果顯示,對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為2.9%±0.45%、20.6%±0.50%、33.4%± 0.55%、14.0%±0.30%,Dex組與其他三組比較,P均<0.05。

    2.3各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較結(jié)果見表1。

    表1 各組成骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較(±s)

    表1 各組成骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較(±s)

    注:與對照組比較,*P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05。

    組別 Caspase-3( 17 kDa)  Caspase-3( 28 kDa) Bax Bcl-2  磷酸化PKC-δ對照組 0.349 75±0.015 01  0.323 91±0.013 72  0.246 63±0.015 35  0.653 42±0.022 06  0.223 65±0.015 24 Dex組 0.610 23±0.038 94* 0.52 340±0.035 79* 0.374 51±0.035 03* 0.402 65±0.032 01* 0.613 25±0.038 47*PMA預(yù)處理組 0.704 21±0.043 25*△0.715 39±0.038 97*△0.539 78±0.040 87*△0.294 62±0.030 79*△0.734 25±0.041 98*△Rottlerin預(yù)處理組 0.501 34±0.031 52*△0.453 61±0.030 87*△0.301 75±0.031 64*△0.453 42±0.029 01*△0.429 87±0.030 27*△

    3 討論

    Weinstein等[5]最早提出糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量減少。隨后的臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)研究[6,7]發(fā)現(xiàn),激素性骨壞死所致股骨頭中可見大量凋亡的骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中我們用Dex成功誘導(dǎo)建立成骨細(xì)胞凋亡模型。另外,我們的前期實(shí)驗(yàn)研究[1]證明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡與PKC通路相關(guān)。

    PKC是一類富含絲/蘇氨基酸的激酶,在機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,目前已發(fā)現(xiàn)12種亞型,作為細(xì)胞信號的重要成分對機(jī)體多種細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等方面起重要作用。在不同細(xì)胞中PKC各亞型作用各異,且受刺激因子不同和條件的影響[8,9]。PKC-δ可通過多種信號通路及相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10,11]。Rottlerin為PKC-δ的特異性抑制劑,PMA為PKC激活劑。本實(shí)驗(yàn)中MTT法檢測結(jié)果顯示,Dex組細(xì)胞增殖活性低于對照組,Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性高于Dex組,PMA預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性低于Dex組。流式細(xì)胞儀檢測及AO/EB雙熒光染色結(jié)果均表明,與對照組比較,Dex組細(xì)胞凋亡明顯增加,且PMA預(yù)處理組較Dex組細(xì)胞凋亡增加,Rottlerin預(yù)處理組較Dex組細(xì)胞凋亡減少??梢?,Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡與PKC-δ的磷酸化有關(guān)。Bcl-2的同系物Mcl-1與PKC-δ參與的HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示磷酸化PKC-δ表達(dá)的變化與促凋亡蛋白Caspase-3 和Bax一致,與凋亡保護(hù)性蛋白Bcl-2相反。由此,進(jìn)一步確認(rèn)PKC-δ的高表達(dá)與細(xì)胞的凋亡相關(guān),推測PKC-δ可能是通過促使Caspase-3、Bax的活化及抑制Bcl-2的表達(dá)水平,從而影響Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡。但其具體的作用途徑尚待進(jìn)一步研究。

    PKC-δ作用底物種類眾多,該信號傳導(dǎo)通路復(fù)雜,目前仍不斷有新的PKC-δ作用途徑提出,其最終的作用機(jī)制以及調(diào)解因子目前仍然沒有得到確定。本實(shí)驗(yàn)在離體細(xì)胞水平上證實(shí)了PKC-δ是Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡中PKC途徑的重要一環(huán),Rottlerin可通過抑制PKC-δ的表達(dá)減少細(xì)胞的凋亡,但PKC-δ究竟是通過介導(dǎo)何種信號通路來參與Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡還有待進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn):

    [1]仲興,張德志,韓鴻賓,等.地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的蛋白激酶C途徑[J].中國組織工程研究,2013,17( 41) : 7205-7212.

    [2]Khwaja A,Tatton L.Caspase-mediated proteolysis and activation of protein kinase Cdelta plays a central role in neutrophil apoptosis [J].Blood,1999,94( 1) : 291-301.

    [3]Patel R,Apostolatos A,Carter G,et al.Protein kinase C δ( PKC-δ) splice variants modulate apoptosis pathway in 3T3L1 cells during adipogenesis: identification of PKC-δⅡinhibitor[J].J Biol Chem,2013,288( 37) : 26834-26846.

    [4]Belot A,Kasher PR,Trotter EW,et al.Protein kinase cδ deficiency causes mendelian systemic lupus erythematosus with B celldefective apoptosis and hyperproliferation[J].Arthritis Rheum,2013,65( 8) : 2161-2171.

    [5]Weinstein RS,Jilka RL,Parfitt AM,et al.Inhibition of osteoblast ogenesis and promotion of apoptosis of osteoblasts and osteocytes by glucocorticoids.Potential mechanisms of their deleterious effects on bone[J].J Clin Invest,1998,102( 2) : 274-282.

    [6]Kothapalli R,Aya-ay JP,Bian H,et al.Ischaemic injury to femoral head induces apoptotic and oncotic cell death[J].Pathology.2007,39( 2) : 241-246.

    [7]Wang FS,Chuang PC,Lin CL,et al.MicroRNA-29a protects against glucocorticoid-induced bone loss and fragility in rats by orchestrating bone acquisition and resorption[J].Arthritis Rheum,2013,65( 6) : 1530-1540.

    [8]Shu L,Zhang W,Su G,et al.Modulation of HERG K Channels by Chronic Exposure to Activators and Inhibitors of PKA and PKC: Actions Independent of PKA and PKC Phosphorylation[J].Cell Physiol Biochem,2013,32( 6) : 1830-1844.

    [9]Qiu S,Jiang Z,Huang Z,et al.Migration of retinal pigment epithelium cells is regulated by protein kinase Cα in vitro[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2013,54( 10) : 7082-7090.

    [10]Patel R,Apostolatos A,Carter G,et al.Protein kinase C δ( PKC-δ) splice variants modulate apoptosis pathway in 3T3L1 cells during adipogenesis: identification of PKC-δII inhibitor[J].J Biol Chem,2013,288( 37) : 26834-26846.

    [11]Belot A,Kasher PR,Trotter EW,et al.Protein kinase cδ deficiency causes mendelian systemic lupus erythematosus with B celldefective apoptosis and hyperproliferation[J].Arthritis Rheum,2013,65( 8) : 2161-2171.

    [12]Opferman JT,Iwasaki H,Ong CC,et al.Obligate role of anti-apoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells[J].Science,2005,307( 5712) : 1101-1104.

    ·基礎(chǔ)研究·

    收稿日期:( 2015-05-02)

    作者簡介:第一付文舉( 1986-),男,住院醫(yī)師,主要研究方向?yàn)楣菈乃赖牟∫蚺c機(jī)制。E-mail: fuwenju2011@163.com

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81041063)。

    文章編號:1002-266X( 2015) 31-0020-03

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    中圖分類號:R681

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.007

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