• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    磷酸化PKC-δ對地塞米松誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響

    2016-01-20 13:55:08付文舉張德志王國喜劉玉林泰州市第二人民醫(yī)院江蘇泰州5500遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院
    山東醫(yī)藥 2015年31期
    關(guān)鍵詞:成骨細(xì)胞

    付文舉,張德志,王國喜,劉玉林( 泰州市第二人民醫(yī)院,江蘇泰州5500;遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

    磷酸化PKC-δ對地塞米松誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響

    付文舉1,張德志2,王國喜1,劉玉林1
    ( 1泰州市第二人民醫(yī)院,江蘇泰州225500;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

    摘要:目的觀察磷酸化PKC-δ對地塞米松( Dex)誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響。方法取新生SD大鼠顱骨第3代成骨細(xì)胞,分為對照組、Dex組( 1×10-7mol/L Dex)、PMA預(yù)處理組( 1×10-7mol/L Dex + 100 nmol/L PMA)、Rottlerin預(yù)處理組( 1×10-7mol/L Dex +2 μmol/L Rottlerin),培養(yǎng)24 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性,采用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙/溴乙錠( AO/EB)熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡,采用Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及磷酸化PKC-δ。結(jié)果與對照組相比,Dex組細(xì)胞增殖活性低,細(xì)胞凋亡多,磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)高,Bcl-2表達(dá)低( P均<0.05)。與Dex組相比,PMA預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性低,細(xì)胞凋亡多,磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)高,Bcl-2表達(dá)低( P均<0.05)。與Dex組相比,Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性高,細(xì)胞凋亡少,磷酸化PKC-δ、Caspase-3、Bax表達(dá)低,Bcl-2表達(dá)高( P均<0.05)。結(jié)論磷酸化PKC-δ可促進(jìn)Dex誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡。

    關(guān)鍵詞:蛋白激酶C-δ;半胱氨酸蛋白3; B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)蛋白x; B細(xì)胞淋巴瘤2;成骨細(xì)胞;細(xì)胞調(diào)亡

    Effect of phosphorylated PKC-δ on Dexamethasone-induced osteoblast apoptosis of rats

    FU Wen-jyu1,ZHANG De-zhi,WANG Guo-xi,LIU Yu-lin
    ( Second People's Hospital of Taizhou,Taizhou 225500,China)

    Abstract:Objective To observe the effect of phosphorylated protein kinase C-δ( PKC-δ) on Dexamethasone ( Dex) -induced osteoblast apoptosis of rats.Methods The osteoblasts of the third generation from newly born SD rats' calvaria were divided into four groups: the control group,Dex group ( 1×10-7mol/L Dex),PMA preconditioning group ( 1× 10-7mol/L Dex +100 nmol/L PMA) and Rottlerin preconditioning group ( 1×10-7mol/L Dex + 2 μmol/L Rottlerin).The cells of each group were incubated for 24 h.Then,the cell proliferation activity was measured by MTT assay,the apoptosis was detected by AnnexinⅤ-FITC/propidium iodide ( PI) -flow cytometry ( FCM) and acridine oringe/ethidium bromide ( AO/EB) staining,and the expression of the apoptosis-related proteins ( Bcl-2,Bax and Caspase-3) and phosphorylated PKC-δ was detected by Western blotting.Results Compared with the control group,the proliferation activity was reduced,the apoptosis was increased,the expression of phosphorylated PKC-δ,Caspase-3 and Bax was increased,while the Bcl-2 expression was decreased in the Dex group,and the difference was statistically significant ( all P<0.05).Compared with the Dex group,the cell proliferation activity was reduced,the apoptosis was increased,the expression of phosphorylated PKC-δ,Caspase-3 and Bax was increased,while the Bcl-2 expression was decreased in the PMA preconditioning group,and the difference was statistically significant ( all P<0.05).Compared with the Dex group,the cell proliferation activity was obviously higher,the apoptosis was decreased,the expression of phosphorylated PKC-δ,Caspase-3 and Bax was decreased,while the Bcl-2 expression was increased in the Rottlerin preconditioning group,and the difference was statistically significant ( all P<0.05).Conclusion The phosphorylated PKC-δ can promote the Dex-induced osteoblast apoptosis of rats.

    Key words:protein kinase C-δ; caspase-3; B-cell lymphoma related protein x; B-cell lymphoma 2; osteoblasts; apoptosis

    糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死是股骨頭壞死的主要原因之一,其病理生理機(jī)制中涉及蛋白激酶C ( PKC)信號途徑的激活[1]。PKC-δ是PKC家族的重要成員,可參與多種細(xì)胞凋亡因子刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[2~4],但在成骨細(xì)胞凋亡方面的研究較少。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控因素中,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax一直備受關(guān)注。因此,本研究觀察了磷酸化PKC-δ對Dex誘導(dǎo)的大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響,為明確Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑出生24 h內(nèi)SD大鼠10只,購自遼寧醫(yī)學(xué)院動物培養(yǎng)中心。胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Heclone公司,吖啶橙、溴乙錠、Ⅰ型膠原酶、MTT購自Sigma公司,茜素紅為國產(chǎn),PKC-δ選擇性抑制劑Rottlerin、PKC激活劑佛波酯( PMA)購自美國Calbiochem公司,抗磷酸化PKC-δ一抗購自北京博奧森試劑有限公司,Annexin V-FITC流式檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

    1.2方法

    1.2.1成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定取所有大鼠顱骨,采用酶消化法分離成骨細(xì)胞,按1×105/mL濃度接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng),置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,24 h后首次換液,以后每2 d換液1次,待細(xì)胞融合至80%左右時,進(jìn)行傳代,取第3代成骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)的方法鑒定。24 h內(nèi)細(xì)胞貼壁,形態(tài)上呈多形性,主要為長梭形,胞質(zhì)有突起,向外伸展; 1周后,細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列,多數(shù)呈鱗片狀,體較大,多偽足,胞質(zhì)豐富,胞核較大;繼續(xù)培養(yǎng),可見局部多層生長,并有黑色鈣結(jié)節(jié)生成。

    1.2.2成骨細(xì)胞凋亡模型建立取70%~80%融合的第3代成骨細(xì)胞,更換新鮮培養(yǎng)液,分為對照組(未做任何處理)、Dex組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1×10-7mol/L)、PMA預(yù)處理組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1×10-7mol/L、PMA濃度為100 nmol/L)、Rottlerin預(yù)處理組(調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中Dex濃度為1× 10-7mol/L、Rottlerin濃度為2 μmol/L),置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    1.2.3成骨細(xì)胞增殖活性檢測采用MTT法。取上述四組細(xì)胞,以1×105/mL接種于96孔板,每組8復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清,加入培養(yǎng)液稀釋的MTT( 1 mg/mL),每孔10 μL,置培養(yǎng)箱中4 h;棄上清,加入等體積二甲亞砜,振蕩10 min,結(jié)晶溶解,呈紫色溶液; BIO-RAD680型酶標(biāo)儀490 nm波長測吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.2.4成骨細(xì)胞凋亡檢測采用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和吖啶橙/溴乙錠( AO/EB)熒光染色法檢測。參照Annexin V-FITC流式檢測試劑盒說明收集上述四組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。取上述四組細(xì)胞,PBS沖洗2次,0.1 g/L的AO/EB混合液染色,凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒,正常細(xì)胞呈綠色熒光,在熒光顯微鏡下觀察200倍視野下,隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞所占的比例。細(xì)胞凋亡率( %) = (凋亡細(xì)胞/計數(shù)細(xì)胞總個數(shù))× 100%。

    1.2.5各組成骨細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ檢測采用Western blotting法。取上述四組細(xì)胞,以添加磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,獲取胞質(zhì)蛋白。等量蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,與抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗Caspase-3抗體及抗磷酸化PKC抗體( 1∶400稀釋) 4℃孵育過夜,與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h,用ECL顯影在柯達(dá)膠片上。同一膜用洗脫液洗脫,檢測β-actin表達(dá)( Abcam一抗1∶3 000稀釋)作為內(nèi)對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示,組間比較用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組細(xì)胞增殖活性比較對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞吸光度值分別為0.437±0.013、0.379±0.012、0.369±0.013、0.410± 0.010,Dex組與其他三組比較,P均<0.05。

    2.2各組細(xì)胞凋亡率比較流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為3.5%±0.46%,19.0%± 0.54%、26.7%±0.69%、10.5%±0.35%,Dex組與其他三組比較,P均<0.05。

    AO/EB雙熒光檢測結(jié)果顯示,對照組、Dex組、PMA預(yù)處理組、Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率分別為2.9%±0.45%、20.6%±0.50%、33.4%± 0.55%、14.0%±0.30%,Dex組與其他三組比較,P均<0.05。

    2.3各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較結(jié)果見表1。

    表1 各組成骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較(±s)

    表1 各組成骨細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2、磷酸化PKC-δ表達(dá)比較(±s)

    注:與對照組比較,*P<0.05;與Dex組比較,△P<0.05。

    組別 Caspase-3( 17 kDa)  Caspase-3( 28 kDa) Bax Bcl-2  磷酸化PKC-δ對照組 0.349 75±0.015 01  0.323 91±0.013 72  0.246 63±0.015 35  0.653 42±0.022 06  0.223 65±0.015 24 Dex組 0.610 23±0.038 94* 0.52 340±0.035 79* 0.374 51±0.035 03* 0.402 65±0.032 01* 0.613 25±0.038 47*PMA預(yù)處理組 0.704 21±0.043 25*△0.715 39±0.038 97*△0.539 78±0.040 87*△0.294 62±0.030 79*△0.734 25±0.041 98*△Rottlerin預(yù)處理組 0.501 34±0.031 52*△0.453 61±0.030 87*△0.301 75±0.031 64*△0.453 42±0.029 01*△0.429 87±0.030 27*△

    3 討論

    Weinstein等[5]最早提出糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量減少。隨后的臨床研究及動物實(shí)驗(yàn)研究[6,7]發(fā)現(xiàn),激素性骨壞死所致股骨頭中可見大量凋亡的骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中我們用Dex成功誘導(dǎo)建立成骨細(xì)胞凋亡模型。另外,我們的前期實(shí)驗(yàn)研究[1]證明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡與PKC通路相關(guān)。

    PKC是一類富含絲/蘇氨基酸的激酶,在機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,目前已發(fā)現(xiàn)12種亞型,作為細(xì)胞信號的重要成分對機(jī)體多種細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等方面起重要作用。在不同細(xì)胞中PKC各亞型作用各異,且受刺激因子不同和條件的影響[8,9]。PKC-δ可通過多種信號通路及相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10,11]。Rottlerin為PKC-δ的特異性抑制劑,PMA為PKC激活劑。本實(shí)驗(yàn)中MTT法檢測結(jié)果顯示,Dex組細(xì)胞增殖活性低于對照組,Rottlerin預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性高于Dex組,PMA預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性低于Dex組。流式細(xì)胞儀檢測及AO/EB雙熒光染色結(jié)果均表明,與對照組比較,Dex組細(xì)胞凋亡明顯增加,且PMA預(yù)處理組較Dex組細(xì)胞凋亡增加,Rottlerin預(yù)處理組較Dex組細(xì)胞凋亡減少??梢?,Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡與PKC-δ的磷酸化有關(guān)。Bcl-2的同系物Mcl-1與PKC-δ參與的HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示磷酸化PKC-δ表達(dá)的變化與促凋亡蛋白Caspase-3 和Bax一致,與凋亡保護(hù)性蛋白Bcl-2相反。由此,進(jìn)一步確認(rèn)PKC-δ的高表達(dá)與細(xì)胞的凋亡相關(guān),推測PKC-δ可能是通過促使Caspase-3、Bax的活化及抑制Bcl-2的表達(dá)水平,從而影響Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡。但其具體的作用途徑尚待進(jìn)一步研究。

    PKC-δ作用底物種類眾多,該信號傳導(dǎo)通路復(fù)雜,目前仍不斷有新的PKC-δ作用途徑提出,其最終的作用機(jī)制以及調(diào)解因子目前仍然沒有得到確定。本實(shí)驗(yàn)在離體細(xì)胞水平上證實(shí)了PKC-δ是Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡中PKC途徑的重要一環(huán),Rottlerin可通過抑制PKC-δ的表達(dá)減少細(xì)胞的凋亡,但PKC-δ究竟是通過介導(dǎo)何種信號通路來參與Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡還有待進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn):

    [1]仲興,張德志,韓鴻賓,等.地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的蛋白激酶C途徑[J].中國組織工程研究,2013,17( 41) : 7205-7212.

    [2]Khwaja A,Tatton L.Caspase-mediated proteolysis and activation of protein kinase Cdelta plays a central role in neutrophil apoptosis [J].Blood,1999,94( 1) : 291-301.

    [3]Patel R,Apostolatos A,Carter G,et al.Protein kinase C δ( PKC-δ) splice variants modulate apoptosis pathway in 3T3L1 cells during adipogenesis: identification of PKC-δⅡinhibitor[J].J Biol Chem,2013,288( 37) : 26834-26846.

    [4]Belot A,Kasher PR,Trotter EW,et al.Protein kinase cδ deficiency causes mendelian systemic lupus erythematosus with B celldefective apoptosis and hyperproliferation[J].Arthritis Rheum,2013,65( 8) : 2161-2171.

    [5]Weinstein RS,Jilka RL,Parfitt AM,et al.Inhibition of osteoblast ogenesis and promotion of apoptosis of osteoblasts and osteocytes by glucocorticoids.Potential mechanisms of their deleterious effects on bone[J].J Clin Invest,1998,102( 2) : 274-282.

    [6]Kothapalli R,Aya-ay JP,Bian H,et al.Ischaemic injury to femoral head induces apoptotic and oncotic cell death[J].Pathology.2007,39( 2) : 241-246.

    [7]Wang FS,Chuang PC,Lin CL,et al.MicroRNA-29a protects against glucocorticoid-induced bone loss and fragility in rats by orchestrating bone acquisition and resorption[J].Arthritis Rheum,2013,65( 6) : 1530-1540.

    [8]Shu L,Zhang W,Su G,et al.Modulation of HERG K Channels by Chronic Exposure to Activators and Inhibitors of PKA and PKC: Actions Independent of PKA and PKC Phosphorylation[J].Cell Physiol Biochem,2013,32( 6) : 1830-1844.

    [9]Qiu S,Jiang Z,Huang Z,et al.Migration of retinal pigment epithelium cells is regulated by protein kinase Cα in vitro[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2013,54( 10) : 7082-7090.

    [10]Patel R,Apostolatos A,Carter G,et al.Protein kinase C δ( PKC-δ) splice variants modulate apoptosis pathway in 3T3L1 cells during adipogenesis: identification of PKC-δII inhibitor[J].J Biol Chem,2013,288( 37) : 26834-26846.

    [11]Belot A,Kasher PR,Trotter EW,et al.Protein kinase cδ deficiency causes mendelian systemic lupus erythematosus with B celldefective apoptosis and hyperproliferation[J].Arthritis Rheum,2013,65( 8) : 2161-2171.

    [12]Opferman JT,Iwasaki H,Ong CC,et al.Obligate role of anti-apoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells[J].Science,2005,307( 5712) : 1101-1104.

    ·基礎(chǔ)研究·

    收稿日期:( 2015-05-02)

    作者簡介:第一付文舉( 1986-),男,住院醫(yī)師,主要研究方向?yàn)楣菈乃赖牟∫蚺c機(jī)制。E-mail: fuwenju2011@163.com

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81041063)。

    文章編號:1002-266X( 2015) 31-0020-03

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    中圖分類號:R681

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.007

    猜你喜歡
    成骨細(xì)胞
    微小核糖核酸-1205沉默Cullin-RING泛素E3連接酶4A激活A(yù)MPK信號傳導(dǎo)保護(hù)人成骨細(xì)胞免受地塞米松損傷的研究
    微納米分級形貌促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制研究進(jìn)展
    wnt經(jīng)典信號通路在酸性pH抑制成骨細(xì)胞功能中的作用
    microRNA-494通過TLR-4通路抑制成骨細(xì)胞分化及基質(zhì)礦化的分子機(jī)制
    BMP-7對高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞生物學(xué)性能的影響
    我國破解失重性骨丟失機(jī)制,揭示骨組織代謝平衡調(diào)控機(jī)制
    淫羊藿次苷Ⅱ通過p38MAPK調(diào)控成骨細(xì)胞護(hù)骨素表達(dá)的體外研究
    土家傳統(tǒng)藥刺老苞總皂苷對2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞損傷改善
    Bim在激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及意義
    姜黃素對脂多糖刺激成骨細(xì)胞骨吸收的影響
    免费无遮挡裸体视频| 国产成人精品无人区| 青草久久国产| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费看a级黄色片| 床上黄色一级片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 人妻久久中文字幕网| 亚洲成av人片在线播放无| 国产99白浆流出| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 一夜夜www| 很黄的视频免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩欧美 国产精品| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久九九精品影院| 中文字幕最新亚洲高清| 一级黄色大片毛片| 午夜免费观看网址| 丝袜人妻中文字幕| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产在线观看jvid| 一夜夜www| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲国产看品久久| 国产成人精品久久二区二区91| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久国产精品麻豆| 欧美日韩一级在线毛片| 脱女人内裤的视频| 成人国产一区最新在线观看| videosex国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 久久中文字幕一级| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av福利片在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜福利高清视频| 欧美性猛交黑人性爽| 日本一区二区免费在线视频| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久九九精品二区国产 | 成人永久免费在线观看视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| а√天堂www在线а√下载| 国产单亲对白刺激| 国产乱人伦免费视频| 日本 av在线| 久久久久久久精品吃奶| 制服人妻中文乱码| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成年人精品一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久国产精品麻豆| 精品一区二区三区四区五区乱码| 搞女人的毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美日韩精品网址| 草草在线视频免费看| 精品久久久久久久末码| 91大片在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 91国产中文字幕| 九色国产91popny在线| 国产亚洲av高清不卡| 日韩欧美三级三区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 黄片小视频在线播放| 国模一区二区三区四区视频 | 精品不卡国产一区二区三区| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一二三四社区在线视频社区8| 最近在线观看免费完整版| 怎么达到女性高潮| 91字幕亚洲| 午夜福利免费观看在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一本综合久久免费| 黄色女人牲交| 男男h啪啪无遮挡| 欧美一级a爱片免费观看看 | 午夜福利成人在线免费观看| netflix在线观看网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美日本亚洲视频在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av | 窝窝影院91人妻| 老司机在亚洲福利影院| 一区福利在线观看| 国产精品九九99| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一级毛片高清免费大全| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久国产精品影院| 男人舔奶头视频| 香蕉av资源在线| 日本免费a在线| 国模一区二区三区四区视频 | 欧美一级毛片孕妇| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品高清国产在线一区| 手机成人av网站| 999久久久国产精品视频| 美女大奶头视频| 黄色视频不卡| av超薄肉色丝袜交足视频| 在线看三级毛片| 两个人看的免费小视频| 色老头精品视频在线观看| av国产免费在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 日本五十路高清| 日本免费a在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 男人舔奶头视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产三级在线视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美在线一区亚洲| 亚洲在线自拍视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产av一区在线观看免费| 动漫黄色视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 精品久久蜜臀av无| 国产精品久久久久久久电影 | 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲人与动物交配视频| 欧美日韩精品网址| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲欧美激情综合另类| 曰老女人黄片| 变态另类丝袜制服| 欧美极品一区二区三区四区| 我的老师免费观看完整版| 露出奶头的视频| 精品欧美一区二区三区在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 天天添夜夜摸| 男女那种视频在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久久久久久久黄片| 欧美3d第一页| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲第一电影网av| 国产野战对白在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 99国产精品一区二区蜜桃av| xxx96com| 国产三级在线视频| 1024手机看黄色片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 黄色女人牲交| 亚洲人与动物交配视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品日韩av在线免费观看| www国产在线视频色| av免费在线观看网站| 99在线人妻在线中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 观看免费一级毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国模一区二区三区四区视频 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产伦一二天堂av在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲成a人片在线一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| a级毛片a级免费在线| 国产精品 欧美亚洲| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人欧美大片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美成人午夜精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 1024视频免费在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 国产午夜精品久久久久久| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产成人系列免费观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 18美女黄网站色大片免费观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | xxxwww97欧美| 色哟哟哟哟哟哟| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产片内射在线| av中文乱码字幕在线| 麻豆av在线久日| 男男h啪啪无遮挡| 色综合亚洲欧美另类图片| 国内精品久久久久久久电影| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线观看一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 小说图片视频综合网站| 欧美成人性av电影在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 宅男免费午夜| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人影院久久av| 欧美日本视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品人妻1区二区| 久久性视频一级片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品久久久久久,| 欧美乱妇无乱码| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜福利在线在线| 青草久久国产| 激情在线观看视频在线高清| 51午夜福利影视在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产主播在线观看一区二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 不卡一级毛片| 一本久久中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 啪啪无遮挡十八禁网站| www日本在线高清视频| 麻豆国产97在线/欧美 | 男女下面进入的视频免费午夜| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲九九香蕉| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美国产日韩亚洲一区| 男女下面进入的视频免费午夜| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 丝袜人妻中文字幕| 黄色成人免费大全| 国产精品av久久久久免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 女人被狂操c到高潮| 亚洲专区中文字幕在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产午夜福利久久久久久| 夜夜爽天天搞| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲国产欧美网| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品 欧美亚洲| 精品久久久久久,| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜两性在线视频| 国产成人影院久久av| 日韩精品中文字幕看吧| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品野战在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 99热只有精品国产| 天堂影院成人在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 精品欧美一区二区三区在线| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久性生活片| av天堂在线播放| 午夜福利在线观看吧| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 俄罗斯特黄特色一大片| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲国产欧美人成| 国产探花在线观看一区二区| 十八禁网站免费在线| 中文在线观看免费www的网站 | 免费在线观看日本一区| 亚洲av成人av| 午夜精品一区二区三区免费看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲成a人片在线一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国内精品久久久久精免费| 国产av一区二区精品久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人国产一区最新在线观看| 热99re8久久精品国产| 欧美三级亚洲精品| 夜夜爽天天搞| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人午夜高清在线视频| 成人国产综合亚洲| 久久亚洲真实| 欧美日韩精品网址| a级毛片在线看网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产亚洲精品一区二区www| 露出奶头的视频| 99国产精品99久久久久| 亚洲人成77777在线视频| 久久热在线av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲最大成人中文| 男女之事视频高清在线观看| 99国产精品一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久精品国产清高在天天线| 午夜久久久久精精品| 丰满的人妻完整版| 日韩欧美国产在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 色播亚洲综合网| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费看美女性在线毛片视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 不卡av一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久久久九九精品影院| 国产精品免费视频内射| 黄色视频,在线免费观看| 中文在线观看免费www的网站 | 久久九九热精品免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99热只有精品国产| 亚洲第一电影网av| 成人三级黄色视频| 三级毛片av免费| 国产99白浆流出| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 99精品欧美一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品一区二区三区四区久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 十八禁网站免费在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产一区二区在线av高清观看| 一级毛片女人18水好多| 91成年电影在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 久久久久久久午夜电影| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一级片免费观看大全| 国产精品99久久99久久久不卡| 一级片免费观看大全| 精品不卡国产一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久人人人人人| 两人在一起打扑克的视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久伊人香网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久国产精品人妻蜜桃| АⅤ资源中文在线天堂| 99久久99久久久精品蜜桃| 香蕉丝袜av| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美不卡视频在线免费观看 | 少妇粗大呻吟视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲乱码一区二区免费版| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 在线视频色国产色| 色尼玛亚洲综合影院| 免费av毛片视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久国产精品麻豆| 一本综合久久免费| 国产精品 国内视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品电影一区二区在线| 少妇的丰满在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 成人一区二区视频在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色 视频免费看| 国内精品久久久久久久电影| 一a级毛片在线观看| 国产片内射在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲成av人片在线播放无| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 两性夫妻黄色片| ponron亚洲| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 91大片在线观看| 国产精品九九99| 国产伦在线观看视频一区| 两个人视频免费观看高清| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲专区中文字幕在线| 精品欧美一区二区三区在线| 丰满人妻一区二区三区视频av | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产一区二区在线av高清观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线观看午夜福利视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 看片在线看免费视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 熟女电影av网| 一进一出抽搐动态| 美女大奶头视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久久久久大精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜福利在线在线| svipshipincom国产片| 国产成年人精品一区二区| 欧美高清成人免费视频www| cao死你这个sao货| 亚洲精品在线美女| x7x7x7水蜜桃| 国产免费av片在线观看野外av| 脱女人内裤的视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 动漫黄色视频在线观看| 国产区一区二久久| 黄色女人牲交| 一区二区三区国产精品乱码| 免费搜索国产男女视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品一及| 国产亚洲精品av在线| 色播亚洲综合网| 两个人的视频大全免费| 又爽又黄无遮挡网站| 国产91精品成人一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| ponron亚洲| 色av中文字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 搞女人的毛片| 香蕉国产在线看| 亚洲自拍偷在线| 在线播放国产精品三级| 欧美性猛交黑人性爽| 免费无遮挡裸体视频| av福利片在线| avwww免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 又紧又爽又黄一区二区| 免费在线观看成人毛片| 久久天堂一区二区三区四区| 中文字幕av在线有码专区| 久久亚洲真实| 97碰自拍视频| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲无线在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| av福利片在线| 亚洲美女视频黄频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 99热只有精品国产| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 成人手机av| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲在线自拍视频| 亚洲七黄色美女视频| 色哟哟哟哟哟哟| 国产单亲对白刺激| 长腿黑丝高跟| 免费无遮挡裸体视频| 黄色片一级片一级黄色片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 丁香六月欧美| 久久精品91无色码中文字幕| 日本五十路高清| 久久人妻av系列| 一个人免费在线观看电影 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 婷婷亚洲欧美| 无人区码免费观看不卡| 精品国产美女av久久久久小说| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久国内视频| 村上凉子中文字幕在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲成人久久性| 精品久久久久久成人av| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 老司机在亚洲福利影院| 很黄的视频免费| 亚洲,欧美精品.| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 丰满人妻一区二区三区视频av | 禁无遮挡网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 免费观看精品视频网站| 人成视频在线观看免费观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 最近最新中文字幕大全电影3| 我要搜黄色片| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品永久免费网站| 久久中文字幕一级| 人妻夜夜爽99麻豆av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中文字幕熟女人妻在线| 熟女电影av网| 老司机福利观看| 九九热线精品视视频播放| 婷婷精品国产亚洲av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 美女黄网站色视频| 国内精品一区二区在线观看| 成人av在线播放网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 一本综合久久免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲美女视频黄频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 99在线视频只有这里精品首页| 婷婷六月久久综合丁香| 99久久99久久久精品蜜桃| 91国产中文字幕| avwww免费| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久 成人 亚洲| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲黑人精品在线| 嫩草影视91久久| 91大片在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产探花在线观看一区二区| 午夜福利在线观看吧| 少妇人妻一区二区三区视频| 窝窝影院91人妻|