沙棘葉總黃酮含量測(cè)定方法的建立

李淑珍,武　飛,陳月林,楊　穎

(1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,內(nèi)蒙古烏蘭察布　012000;

2.烏蘭察布中心醫(yī)院,內(nèi)蒙古烏蘭察布　012000)

沙棘葉總黃酮含量測(cè)定方法的建立

李淑珍1,武飛2,陳月林1,楊穎1

(1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,內(nèi)蒙古烏蘭察布012000;

2.烏蘭察布中心醫(yī)院,內(nèi)蒙古烏蘭察布012000)

摘要：本研究通過(guò)比色條件NaNO2,Al(NO3)3和NaOH的加入量和靜置時(shí)間單因子篩選、多因子正交試驗(yàn)和方法學(xué)考察，建立了NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測(cè)定沙棘葉總黃酮含量的優(yōu)化方法.結(jié)果得出測(cè)定沙棘葉總黃酮含量的步驟是：取1 mL樣液于燒杯中，加70%的乙醇1 mL，再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min；然后加入4%的氫氧化鈉溶液6 mL，搖勻，放置15 min后，以70%乙醇作參比溶液，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光值.測(cè)得沙棘總黃酮含量為2.049%，比優(yōu)化前提高1.337倍，均達(dá)到《中國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn).該法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好,精密度和回收率高，并且設(shè)備簡(jiǎn)單、操作便捷，可為其他材料總黃酮的測(cè)定提供參考.

關(guān)鍵詞：沙棘葉；總黃酮；含量測(cè)定；分光光度法；正交試驗(yàn)

收稿日期：2015-05-14;修改稿收到日期:2015-08-05

E-mail:448609108@qq.com

基金項(xiàng)目:內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(NJZC14407)

作者簡(jiǎn)介：李淑珍(1974—)，女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，副教授，碩士.主要研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā).

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 949.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：章編號(hào)：1001-988Ⅹ(2015)06-0094-04

Abstract:A method for determination of total flavonoids in Hippophe rhamnoids L leaves is established,by singlefactor screening,multiple-factor orthogonal test and methodology examination of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH system spectrophotometry.The single factor includs reaction volume and reaction time.The results show that the optimization methods are:Take 1 mL sample solution in the beaker,add 70% ethanol 1 mL and 5% NaNO20.5 mL,shake well,react 6 min.Then add 10% Al(NO3)30.5 mL,shake well,react 6 min;After that add 4% NaOH 6 mL,shake well,react 15 min,determine absorbance at 510 nm with 70% ethanol as reference solution.The methodology shows that the method has good stability and reproducibility,high precision and recovery.It is more suitable for the determination content of total flavonoids in Hippophe rhamnoids L leaves， which has simple equipment,convenient operation and high accurate.using this method,the content of total flavonoids is 2.049%,which is 1.337 times than before optimized.Both of then reach to the regulation standard of “China pharmacopoeia”.This method can be looked as a reference method for the determination of total flavonoids in other materials.

Establishment of determination method

of total flavonoids inHippopherhamnoidsL leaves

LI Shu-zhen1,WU Fei2,CHEN Yue-lin1,YANG Ying1

(1.Wulanchabu Medical College,Wulanchabu 012000,Inner Mongolia,China;

2.Wulanchabu Central Hospital,Wulanchabu 012000,Inner Mongolia,China)

Key words:HippopherhamnoidsL leaves;total flavonoids;content determination;spectrophotometry;orthogonal test

沙棘(HippopherhamnoidsL)屬胡頹子科沙棘屬植物，又名醋柳(漢名)，是一種落葉灌木或小喬木，資源豐富，我國(guó)就有200萬(wàn)km2，占世界總面積的90%以上[1].沙棘根系發(fā)達(dá)，需水量少，成林快，而且抗寒抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄，生態(tài)適應(yīng)性廣，是防風(fēng)固沙、保持水土的優(yōu)選物種.沙棘為藥食同源植物，其根、莖、葉、花、果、種子含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀生理功效及顯著的藥用功能[2-5]，被國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和醫(yī)藥學(xué)家譽(yù)為21世紀(jì)人類(lèi)最具發(fā)展前途的營(yíng)養(yǎng)保健及醫(yī)藥植物，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[6].

沙棘總黃酮的定量測(cè)定方法報(bào)道有HPLC法和分光光度法等.HPLC法測(cè)定總黃酮含量精確度高、誤差小，但需預(yù)先知道總黃酮中的單體成分以此為對(duì)照進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)成本較高.在實(shí)際生產(chǎn)和科研中多用分光光度法，常采用在堿性介質(zhì)中加鋁鹽顯色，此法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低，同時(shí)也不需要預(yù)先知道總黃酮中的單體成分[7].但NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法操作方法文獻(xiàn)報(bào)道不一致[8-12]，NaNO2和Al(NO3)3靜置時(shí)間有2,4,6,8 min不等，NaOH靜置時(shí)間有10,15,20 min 不等；NaNO2和Al(NO3)3加入量有0.3,0.4,0.5,0.7,1 mL不等，NaOH加入量有1,2,4,6,10 mL 不等.本試驗(yàn)對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和沙棘葉樣品溶液中總黃酮含量進(jìn)行分析比較，建立NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系測(cè)定沙棘葉總黃酮含量的優(yōu)化方法.

1材料與方法

1.1儀器與試劑

722可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080-201408，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；沙棘葉采于內(nèi)蒙古烏蘭察布市卓資縣郊野，經(jīng)楊鴻飛教授鑒定；其他試劑均為分析純.

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取在120 ℃干燥至恒量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置50 mL 量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁溶液.精密量取10 mL用70%的乙醇定容50 mL，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(40 μg·mL-1).

1.3樣品溶液的制備

稱(chēng)取7月份沙棘葉10 g，加入150 mL 50%乙醇70 ℃水浴加熱提取0.5 h，過(guò)濾，回收乙醇，定容為100 mL，從中取5 mL定容到50 mL的容量瓶中，得樣品溶液.

1.4最大吸收波長(zhǎng)的確定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液各1 mL，分別加70%乙醇1 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入4%的NaOH溶液2 mL，搖勻，放置10 min 后，以70%乙醇作參比溶液[13]，于400～700 nm 處測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品與樣品溶液在510 nm 處均有最大吸收峰.

2結(jié)果與分析

2.1比色條件優(yōu)化

2.1.1試劑加入后靜置時(shí)間選擇準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液各1 mL，分別加70%乙醇1 mL，按表1設(shè)計(jì)，每次只改變一個(gè)時(shí)間因素，其余按1.4項(xiàng)所述定量方法，在510 nm測(cè)定吸光值，結(jié)果如表1.

表1　靜置時(shí)間對(duì)吸光值的影響

從表1可以看出，加入NaNO2溶液后的靜置時(shí)間對(duì)吸光值有一定影響.標(biāo)準(zhǔn)溶液在4～6 min 吸光值較穩(wěn)定；樣品溶液靜置4～8 min 吸光值較穩(wěn)定.綜合二者，靜置4～6 min即可使反應(yīng)充分，吸光值基本保持不變，所以操作應(yīng)在4～6 min內(nèi)完成.

加入Al(NO3)3溶液后，二者都在6 min后吸光值趨于穩(wěn)定，說(shuō)明二者與Al3+絡(luò)合反應(yīng)至少需要6 min才能完成.所以加入Al(NO3)3溶液靜置6 min 后，再加入氫氧化鈉溶液，所測(cè)吸光值較準(zhǔn)確、可靠.

加入NaOH溶液后靜置時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液無(wú)影響，10 min已達(dá)到穩(wěn)定；樣品溶液需15 min后達(dá)到穩(wěn)定.說(shuō)明對(duì)于組分單一的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入NaOH溶液10 min后吸光值已達(dá)到穩(wěn)定，較長(zhǎng)時(shí)間的放置，其吸光值穩(wěn)定不變.但對(duì)于組分復(fù)雜的樣品溶液其吸光值在15～20 min 達(dá)到穩(wěn)定，之后又發(fā)生衰減.綜合二者考慮，可選擇加入NaOH溶液后放置顯色15～20 min 測(cè)定吸光值[8,14].

2.1.2試劑加入量選擇準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液各1 mL，加70%乙醇1 mL，按表2設(shè)計(jì)，每次只改變一個(gè)劑量因素，其余按1.4項(xiàng)所述定量方法，在510 nm測(cè)定吸光值，結(jié)果如表2.

表2　溶液體積對(duì)吸光值的影響

吸光值測(cè)定結(jié)果看出，隨著加入NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液的量增加吸光值降低，這是由于溶液的總體積增大造成的，降低與體積增加正好成反比，說(shuō)明加入量不影響吸光值.為了節(jié)約試劑，我們選擇溶液的加入量都為最小值[8,14].

2.1.3多因子正交試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取樣品溶液1 mL，加70%乙醇1 mL，按照L9(33)正交表設(shè)計(jì)，依次對(duì)試劑靜置時(shí)間和加入量進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)定吸光度值.靜置時(shí)間優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3和表4，加入量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)表5和表6.

試劑靜置時(shí)間正交試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4，從極差R值可以看出B>C>A，即各因素對(duì)沙棘葉總黃酮含量影響順序?yàn)锳l(NO3)3靜置時(shí)間>NaOH靜置時(shí)間>NaNO2靜置時(shí)間.方差分析結(jié)果表明，試劑靜置時(shí)間均極顯著影響沙棘總黃酮含量測(cè)定(P<0.01)，故最佳條件為A3B1C2，即靜置優(yōu)化后結(jié)果是：加NaNO2溶液后靜置6 min；加Al(NO3)3溶液后靜置6 min；加NaOH 溶液靜置15 min，再測(cè)定吸光值.

表3　試劑靜置時(shí)間正交試驗(yàn)結(jié)果

表4　試劑靜置時(shí)間的正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99.

試劑加入量正交試驗(yàn)結(jié)果如表5-6，從極差R值可以看出B>A>C，即各因素對(duì)沙棘葉總黃酮含量影響順序?yàn)锳l(NO3)3加入量>NaNO2加入量>NaOH加入量.方差分析結(jié)果表明，NaNO2,Al(NO3)3和NaOH加入量均極顯著影響沙棘總黃酮含量測(cè)定(P<0.01)，故最佳條件選為A1B1C3.

結(jié)合靜置時(shí)間和加入量結(jié)果，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測(cè)定沙棘葉總黃酮含量?jī)?yōu)化后的比色條件為：準(zhǔn)確吸取樣品溶液1 mL，加70%乙醇1 mL，加入5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min； 加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4% NaOH 溶液6 mL，靜置15 min，測(cè)定吸光度.

表5　試劑加入量正交試驗(yàn)結(jié)果

表6　試劑加入量正交試驗(yàn)方差分析

F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99

2.2沙棘葉總黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取在120 ℃干燥至恒量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置50 mL 量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液10,15,20,25,30,35,40,45 mL用70%的乙醇定容至50 mL，即為40,60,80,100,120,140,160,180 μg·mL-1的蘆丁溶液，各取1 mL 于試管中，按照上述確定比色條件，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光值.以吸光值值(A)為橫坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品濃度(C)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=477.38X-2.261(R=0.9979)，結(jié)果表明蘆丁在0～120 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系.采用上述優(yōu)化后的比色條件測(cè)定樣品溶液吸光值，計(jì)算總黃酮含量(表7).

表7　沙棘葉總黃酮含量

由表7可以看出，優(yōu)化前總黃酮含量為1.533%，優(yōu)化后總黃酮含量達(dá)2.049%，提高1.337倍.不管是優(yōu)化前還是優(yōu)化后，沙棘葉總黃酮含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定,總黃酮含量以蘆丁計(jì)不少于1.5%[5].

2.3方法學(xué)考察

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液各1 mL，分別加70%乙醇1 mL，按上述優(yōu)化后比色條件，測(cè)定吸光值，連續(xù)3 次，計(jì)算RSD.精密度測(cè)試RSD為1.03%，該方法的精密度良好.重現(xiàn)性測(cè)試RSD為4.37%，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性較好.精密吸取樣品溶液1 mL，加入0.04 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，加70%乙醇1 mL，按上述優(yōu)化后的比色條件，測(cè)定吸光值，連續(xù)3 次.回收率為1.003%，該方法回收率高.

3討論

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系分光光度法測(cè)定總黃酮的反應(yīng)原理是：先用亞硝酸鈉還原黃酮，再加硝酸鋁絡(luò)合，后用氫氧化鈉溶液使黃酮類(lèi)化合物開(kāi)環(huán)，生成2′-OH查爾酮而顯色.它的顯色反應(yīng)發(fā)生在黃酮類(lèi)化合物的3-OH,4-OH或5-OH,4 羰基或鄰二酚羥基，與鋁鹽進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色的絡(luò)合物而顯色[15].在NaNO2的強(qiáng)堿性溶液中，其在510 nm處吸光值值最大，從而為分光光度法測(cè)定提供了可靠的依據(jù).本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體

系分光光度法，對(duì)試劑加入量和靜置時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化.優(yōu)化后的比色方法是：取1 mL 于樣液燒杯中，加70%的乙醇1 mL，再加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%的氫氧化鈉溶液6 mL，搖勻，靜置15 min 后，以70%乙醇作參比溶液，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光值.該方法所用試劑比優(yōu)化前增加了，所用時(shí)間增加5 min，但反應(yīng)更加充分，該法測(cè)定沙棘總黃酮含量高(總黃酮含量為2.049%)，比優(yōu)化前提高1.337倍，達(dá)到《中國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn).方法學(xué)考察顯示該法重現(xiàn)性好(RSD為4.37%)、精密度高(RSD為1.03%)、回收率高(回收率為1.003%)，且操作簡(jiǎn)單方便，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用到其他藥物總黃酮的測(cè)定.

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