單一位點(diǎn)夾心抗體法結(jié)合循環(huán)增強(qiáng)熒光免疫技術(shù)檢測(cè)BNP的評(píng)估

肖春海，　梁　爽，　劉靜凡，　李飛飛，　朱慶華，　瞿培培，　董志武

單一位點(diǎn)夾心抗體法結(jié)合循環(huán)增強(qiáng)熒光免疫技術(shù)檢測(cè)BNP的評(píng)估

肖春海，梁爽，劉靜凡，李飛飛，朱慶華，瞿培培，董志武

(上海市第六人民醫(yī)院金山分院檢驗(yàn)科，上海 201500)

摘要：目的初步評(píng)價(jià)單一位點(diǎn)夾心抗體(SES)法結(jié)合循環(huán)增強(qiáng)熒光免疫技術(shù)(CEIFA)檢測(cè)B型鈉尿肽(BNP)的性能。方法用SES法結(jié)合CEIFA儀檢測(cè)BNP，對(duì)其精密度、線(xiàn)性范圍、功能敏感性、回收率、樣本穩(wěn)定性及與西門(mén)子ADVIA Centaur CP化學(xué)發(fā)光儀(簡(jiǎn)稱(chēng)Centaur CP)的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果SES法結(jié)合CEIFA的批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為4.38%～7.84%和10.47%～11.21%。線(xiàn)性范圍為25～5 000 pg/mL。功能敏感性為12.5 pg/mL?；厥章蕿?5.04%～109.2%。與Centaur CP比較，其回歸方程為Y=0.998 3X-22.38(r=0.969，P<0.01)。對(duì)樣本穩(wěn)定性的要求低于Centaur CP。結(jié)論SES法結(jié)合CEIFA測(cè)定BNP具有較好的性能，與傳統(tǒng)的雙抗體夾心發(fā)光法比較有一定優(yōu)勢(shì)，適合臨床急診實(shí)驗(yàn)室使用。

關(guān)鍵詞：B型鈉尿肽；單一位點(diǎn)夾心抗體；熒光免疫分析；心力衰竭

Evaluation of BNP quantification by single-epitope sandwich combined with cyclic enhanced immunofluorescent assayXIAOChunhai，LIANGShuang，LIUJingfan，LIFeifei，ZHUQinghua，QUPeipei，DONGZhiwu

.(DepartmentofClinicalLaboratory，JinshanBranchofShanghaiSixthPeople′sHospital，Shanghai201500，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate B-type natriuretic peptide quantification by single-epitope sandwich(SES)combined with cyclic enhanced immunofluorescent assay(CEIFA). MethodsBy SES combined with CEIFA, BNP was determined. The precision, linear range, function sensitivity, recovery rate and sample stability were evaluated, and 45 samples were determined by the method, which the results were evaluated with those of SIEMENS ADVIA Centaur CP chemiluminescence analyzer (Centaur CP). ResultsThe within-run and between-run coefficients of variation(CV) were 4.38%-7.84% and 10.47%-11.21%, respectively. The linear range was 25-5 000 pg/mL. The function sensitivity was 12.5 pg/mL. The recovery rate was 95.04%-109.2%. The correlation formula between the novel method and Centaur CP was Y=0.998 3X-22.38 (r=0.969, P<0.01). The request of sample stability of SES combined with CEIFA was lower than that of Centaur CP. ConclusionsSES combined with CEIFA for BNP quantification has a good performance, and there are some advantages compared with traditional double-antibody sandwich chemiluminescence assay.

Key words:B-type natriuretic peptide; Single-epitope sandwich; Immunofluorescent assay; Heart failure

B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)屬于利鈉肽家族，由日本學(xué)者首先從豬腦中分離出來(lái)，但卻主要由心室肌細(xì)胞分泌，與左心室承受的壓力大小密切相關(guān)，所以現(xiàn)在更多稱(chēng)“B型利鈉肽”。人類(lèi)BNP基因位于1號(hào)染色體端臂遠(yuǎn)端，包括2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。BNP前體(BNP precursor, proBNP)裂解后同時(shí)產(chǎn)生具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的BNP和氨基末端碎片(N-terminal proBNP，NT-proBNP)，兩者都可作為心力衰竭診斷的有效特異指標(biāo)[1-3]。BNP雖然在診斷呼吸困難、肺栓塞、肺癌等疾病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4-6]，但目前應(yīng)用較多的仍為心血管領(lǐng)域[1-3，7-10]。我們主要是利用循環(huán)增強(qiáng)熒光免疫技術(shù)(cyclic enhanced immunofluorescent assay, CEIFA)結(jié)合單一位點(diǎn)夾心抗體(single-epitope sandwich，SES)法[11]實(shí)現(xiàn)BNP的檢測(cè)。

材料和方法

一、材料

1. 研究對(duì)象45份上海市第六人民醫(yī)院金山分院心內(nèi)科患者的乙二胺四乙酸二鉀鹽新鮮抗凝血漿；星童公司BNP標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100、1 000和5 000 pg/mL。

2.試劑與儀器西門(mén)子ADVIA Centaur CP化學(xué)發(fā)光儀(簡(jiǎn)稱(chēng)Centaur CP)及其配套BNP試劑盒(批號(hào)35890171)，星童Pylon Core熒光免疫分析儀(簡(jiǎn)稱(chēng)Pylon Core) 及其配套BNP試劑盒(批號(hào)000502191411)和BNP稀釋液(批號(hào)000502181529)。

二、原理

1. CEIFA原理將氣化的3-氨基丙基硅烷均勻鍍?cè)谑⑨槺砻妫谑杷饔孟驴梢詫慰寺】贵w固化在石英針的表面，形成捕捉抗體。通過(guò)二甲基甲酰胺分別將生物素與另一單克隆抗體偶聯(lián)形成生物素化抗體，將熒光素(花青染料5)與多聚糖-鏈霉親和素偶聯(lián)成熒光素-多聚糖-鏈霉親和素復(fù)合物。CEIFA利用生物素化的捕捉抗體對(duì)待測(cè)抗原的特異性以及對(duì)鏈霉親和素?zé)晒馀悸?lián)物質(zhì)的特異性，通過(guò)循環(huán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的循環(huán)放大。見(jiàn)圖1。

2. SES原理SES由HyTest公司發(fā)明，利用BNP環(huán)抗體能特異結(jié)合BNP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的11～16位氨基酸，形成新的抗原抗體復(fù)合物，同時(shí)此復(fù)合物能作為抗原，形成新的抗原特異位點(diǎn)，與此復(fù)合物的抗體特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)一個(gè)單克隆抗原位點(diǎn)的特異性?shī)A心反應(yīng)。見(jiàn)圖2。

3. CEIFA與SES法結(jié)合檢測(cè)BNP的過(guò)程固化后的BNP單克隆抗體作為捕捉抗體與樣本中完整的BNP分子和部分降解的BNP分子進(jìn)行結(jié)合，清洗后與另一生物素化BNP單克隆抗體進(jìn)行雙抗體夾心反應(yīng)，清洗后再與熒光素-多聚糖-鏈霉親和素反應(yīng)，之后再分別與生物素化BNP單克隆抗體和熒光素-多聚糖-鏈霉親和素反應(yīng)循環(huán)3次，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大，進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)圖3。

三、方法

1.精密度試驗(yàn)準(zhǔn)備2個(gè)批號(hào)的BNP試劑，取BNP濃度為100 pg/mL的低值和1 000 pg/mL的高值標(biāo)準(zhǔn)品每天測(cè)3次，連續(xù)測(cè)定5 d，根據(jù)測(cè)得BNP的結(jié)果計(jì)算濃度的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)[12]。

圖1CEIFA原理圖

圖2　SES原理圖

圖3　CEIFA結(jié)合SES法檢測(cè)BNP的過(guò)程圖

2.線(xiàn)性試驗(yàn)取5 000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)倍稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值。將實(shí)際測(cè)定的均值與理論值進(jìn)行比較，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)，相對(duì)偏差應(yīng)<15%。

3.功能敏感性對(duì)100 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)倍稀釋?zhuān)瑵舛纫来螢?0.00、25.00、12.50和6.25 pg/mL，-80℃低溫分裝保存，每天測(cè)定4次，連續(xù)5 d。

4.回收試驗(yàn)在150 μL患者的待測(cè)血清中，分別加入BNP濃度為100和2 500 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液加入前后樣本的BNP濃度?；厥章?%)=(加入標(biāo)準(zhǔn)液后BNP質(zhì)量-加入標(biāo)準(zhǔn)液前BNP質(zhì)量)/實(shí)際加入的BNP質(zhì)量×100。

5.相關(guān)性試驗(yàn)45例臨床樣本在Centaur CP上檢測(cè)的BNP值為35 ～2 435 pg/mL，同時(shí)在Pylon Core上檢測(cè)，計(jì)算兩者的相關(guān)性。

6.樣本穩(wěn)定性試驗(yàn)將3份急診患者的樣本同時(shí)在Centaur CP和Pylon Core上檢測(cè)BNP，之后每隔2 h再分別在2臺(tái)儀器上同時(shí)檢測(cè)BNP，共檢測(cè)5次，總時(shí)長(zhǎng)為8 h。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、兩變量相關(guān)性和回歸分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、精密度試驗(yàn)

低值標(biāo)準(zhǔn)品(100 pg/mL)和高值標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 pg/mL)批內(nèi)和批間的BNP測(cè)定值均符合正態(tài)分布(P>0.05)，低、高值標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)CV分別為4.38%和7.84%，均<10%；批間CV分別為11.21%和10.47%，均<15%。

二、線(xiàn)性試驗(yàn)

將高值(5 000 pg/mL)、中值(1 000 pg/mL)和低值(100 pg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)偏差均<15%，線(xiàn)性方程為Y=1.033X-3.348，r=0.999 8，線(xiàn)性范圍為25 ～5 000 pg/mL。見(jiàn)表1。

三、功能敏感性

50.00、25.00、12.50和6.25 pg/mL 4種濃度中，12.5 pg/mL的CV為19.5%，最接近20%，所以此方法的功能敏感性為12.5 pg/mL。

四、回收試驗(yàn)

經(jīng)檢測(cè)，加入標(biāo)準(zhǔn)液前被檢測(cè)樣本的BNP濃度為258 pg/mL，加入標(biāo)準(zhǔn)液后樣本的檢測(cè)濃度分別為220.8和787.5 pg/mL。計(jì)算得平均回收率為102.12%。見(jiàn)表2。

五、相關(guān)性試驗(yàn)

45份樣本在Centaur CP和Pylon Core上檢測(cè)BNP的回歸方程為Y=0.998 3X-22.38(r=0.969，P<0.01)。見(jiàn)圖4。進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，t=1.175，P>0.05。

六、樣本穩(wěn)定性試驗(yàn)

取BNP高、中、低值各3份樣本，Pylon Core最初檢測(cè)結(jié)果分別為1 739、421和95 pg/mL，Centaur CP分別為1 709、415和93 pg/mL。每隔2 h測(cè)定BNP。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，2種儀器的檢測(cè)結(jié)果均逐漸降低，但Pulon Core檢測(cè)值的降低速度明顯沒(méi)有Centaur CP快。見(jiàn)表3、圖5。

表1　BNP線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

表2　CEIFA結(jié)合SES法檢測(cè)BNP的回收試驗(yàn)結(jié)果

注：Y=0.998 3X-22.38;R2=0.938 9

圖445份樣本在Pylon Core和Centaur CP上檢測(cè)BNP的回歸分析

表3　樣本穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果　(pg/mL)

注：與同一樣本Pylon Core均值比較， *P<0.05

時(shí)間(h)

圖5樣本穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)

討論

心力衰竭患者心室負(fù)荷增加時(shí)，心肌細(xì)胞分泌的proBNP由108個(gè)氨基酸組成，之后水解成為76個(gè)氨基酸的NT-proBNP和32個(gè)氨基酸的BNP[7]，所以BNP和NT-proBNP都可以作為心力衰竭的診斷指標(biāo)，但目前2個(gè)指標(biāo)各有優(yōu)缺點(diǎn)。BNP半衰期短，不穩(wěn)定，體內(nèi)半衰期只有20 min，體外室溫下2 h內(nèi)測(cè)試結(jié)果可靠[11]，而NT-proBNP較BNP穩(wěn)定，體外24 h內(nèi)結(jié)果可靠[13]。由于NT-proBNP代謝主要通過(guò)高血流量的器官，如肝臟和腎臟等清除，而B(niǎo)NP主要通過(guò)鈉尿肽清除受體結(jié)合經(jīng)胞吞和溶酶體降解等方式進(jìn)行代謝，只有少量通過(guò)腎臟清除，所以腎功能對(duì)于NT-proBNP影響很大，對(duì)BNP的影響則較小[14-15]。而心血管疾病的慢性患者多伴有不同程度的腎功能損害，NT-proBNP半衰期長(zhǎng)，容易造成體內(nèi)NT-proBNP的積累，體外檢測(cè)時(shí)往往不能真實(shí)反映腎功能異?；颊咝募〉氖軗p程度。BNP半衰期短，不穩(wěn)定，如果BNP能及時(shí)檢測(cè)，其結(jié)果對(duì)臨床的可靠性會(huì)高于NT-proBNP，因?yàn)锽NP更能反映患者當(dāng)前心肌的受損情況。

本研究利用CEIFA實(shí)現(xiàn)了抗體的固化，循環(huán)反應(yīng)的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大。CEIFA檢測(cè)BNP具有良好的批內(nèi)和批間精密度，其CV分別<10%和<15%。線(xiàn)性范圍為25～5 000 pg/mL，功能敏感性為12.5 pg/mL，說(shuō)明此方法具有敏感性高、信號(hào)放大明顯等特點(diǎn)。本研究對(duì)此方法進(jìn)行了BNP的加樣回收試驗(yàn)和臨床樣本的相關(guān)性分析,結(jié)果顯示CEIFA檢測(cè)BNP的準(zhǔn)確性良好(平均回收率為102.12%)，與Centaur CP的相關(guān)性較好(r=0.969,P<0.01)。

BNP分子免疫反應(yīng)的特異性位點(diǎn)一般有3個(gè)可以選擇，分別是中間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及碳端和氮端。而傳統(tǒng)的雙抗體夾心法通常選擇其中的2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)。在樣本穩(wěn)定性試驗(yàn)過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，Pylon Core檢測(cè)BNP的結(jié)果降低程度明顯沒(méi)有Centaur CP快，在高值樣本中尤為明顯，因?yàn)榇私Y(jié)果的產(chǎn)生與SES技術(shù)有著密切的關(guān)系。由于BNP分子的兩端降解速度比環(huán)部快，環(huán)部相對(duì)比較穩(wěn)定，Centaur CP檢測(cè)BNP時(shí)其中一個(gè)單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)為碳端的27～32氨基酸[15]，不穩(wěn)定的碳端一旦水解，則不能完成雙抗體夾心的反應(yīng)，從而降低BNP的結(jié)合率，使檢測(cè)結(jié)果降低。有報(bào)道顯示BNP的體外穩(wěn)定性一般在2 h之內(nèi)[11,13]。如果所有樣本均在2 h之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果的影響不大。本研究的BNP檢測(cè)結(jié)合了SES法，檢測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)位于相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)部(11～16氨基酸)，形成抗原抗體復(fù)合物，以此復(fù)合物作為抗原，形成新的特異性位點(diǎn)，再與另一特異性抗體反應(yīng)，完成了單一位點(diǎn)的雙抗體夾心反應(yīng)[11,16]。由此可見(jiàn)，SES技術(shù)在BNP檢測(cè)過(guò)程中能減緩BNP的降解對(duì)于結(jié)果的影響，能為臨床提供更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究的BNP檢測(cè)法是SES法和CEIFA的結(jié)合，具有較好的檢測(cè)性能，同時(shí)相對(duì)于傳統(tǒng)的雙抗體夾心法有一定的優(yōu)勢(shì)，所以SES法結(jié)合CEIFA檢測(cè)BNP具有一定的臨床推廣價(jià)值，適合臨床急診實(shí)驗(yàn)室使用。

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(本文編輯：姜敏)

收稿日期：(2014-12-08)

中圖分類(lèi)號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0495-05R446.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.020

通訊作者：董志武，聯(lián)系電話(huà)：021-57331227。

作者簡(jiǎn)介：肖春海，男，1976年生，碩士，主管技師，主要從事臨床生化與免疫檢驗(yàn)研究。

基金項(xiàng)目：金山區(qū)科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新資金資助項(xiàng)目(2014-3-09)